于滢泉 张涛 刘迪 杜建森 刘蜜 鞠成飞

摘 要 为减少由船舶压载水和沉积物转移导致的有害水生物和病原微生物传播，更好地保护海洋生态系统，国际海事组织发布了《国际船舶压载水和沉积物控制与管理公约》，对压载水经过处理后应达到的排放标准进行了规定。本文对检测压载水是否达到排放标准的生物检测技术进行了总结归纳，对各种检测技术的优缺点进行分析，对未来应当加强研究的方向进行了展望，旨在为海关系统制定监管标准、推荐检测方法、促进技术创新与科研发展提供参考。

关键词 压载水；水生物；病原微生物；检测

Overview of Detection Techniques for Organisms in Ballast Water

YU Ying-Quan ¹ ZHANG Tao ¹ LIU Di ¹ DU Jian-Sen ^1* LIU Mi ² JU Cheng-Fei ³

Abstract To mitigate the risk of spreading harmful aquatic organisms and pathogenic microorganisms resulting from the transfer of ship ballast water and sediments, and to safeguard marine ecosystems, the International Maritime Organization (IMO) has issued the International Convention for the Control and Management of Ships’ Ballast Water and Sediments, which outlines discharge standards for treated ballast water. This article summarizes and categorizes biological testing techniques used to verify compliance with these discharge standards. It analyzes the strengths and limitations of various detection methods and offers insights into future research directions. The goal is to provide reference for customs authorities in establishing regulatory standards, recommending testing methodologies, and promoting technological innovation and scientific research.

Keywords ballast water; aquatic organisms; pathogenic microorganisms; detection

海洋是地球上最大的生态系统^[1]，孕育着平均细胞密度约为5×10⁵ cells/mL的海洋微生物，为大约3.6×10²⁸个微生物提供了生存空间^[2]，因此海洋微生物群落具有高度多样性^[3]。商品的全球贸易在一定程度上依靠海上运输，为确保船只的航海性能处于最佳状态，多数商船在其船体中装备了压载水舱用于装载压载水，根据货物载重量和分布情况泵入或排出压载水，用于保持船舶平衡、管理应力负载及调节稳定性。但同时也会导致有害水生物和病原微生物随着压载水跨区域传播，如果新的环境具备温度适宜、营养丰富、缺乏天敌等条件，可能会出现更加有利于其繁衍的情况^[4]，从而对本地海洋生物群落产生深远影响，如生物多样性下降、脆弱物种消失、生态系统中入侵物种的引入等^[5]。值得注意的是，在海水环境中微生物的数量占据主导地位^[6]，历史上有记录显示霍乱弧菌存在于船舶的压载水中^[7]。因此，相关部门和从业人员应高度关注压载水携带的病原微生物情况，避免这些微生物对人类健康产生影响。

1 检测依据

国际海事组织（International Maritime Organi- zation，IMO）于2004年通过了《国际船舶压载水和沉积物控制与管理公约》。该公约于2017年获得全球批准，并于2024年全面实施。其中，D-2条款对船舶限制其排放压载水中的存活生物浓度作出规定，主要包括活体生物和病原菌两部分内容，具体如下：（1）每立方米中≥50 μm的存活生物少于10个；（2）每毫升中≥10 μm且＜50 μm的存活生物少于10个。此外，还对3种特定指示性病原菌设定了数值限制。D-2条款部分基于生物体的大小来设定，≥50 μm的生物包括大型藻类、原生生物中的大细胞种类、浮游动物以及鱼类幼虫，而≥10 μm且＜50 μm的尺寸组则主要由浮游植物组成。对于＜10 μm的生物体浓度，该条款对霍乱弧菌（O1和O139血清型）、大肠埃希氏菌以及肠球菌进行了规定，未包含病毒以及某些＜10 μm藻类^[8] 。

我国相关法律法规主要包括《中华人民共和国生物安全法》《中华人民共和国国境卫生检疫法》《中华人民共和国进出境动植物检疫法》《中华人民共和国海洋环境保护法》《中华人民共和国水污染防治法》等。其中《中华人民共和国生物安全法》规定进出境的人员、运输工具、集装箱、货物、物品、包装物和国际航行船舶压载水排放等应当符合我国生物安全管理要求；新修订的《中华人民共和国国境卫生检疫法》规定海关依照本法监督固体、液体废弃物和船舶压载水的处理。以上法律法规为我国监管部门和检测机构提供了依据。

2 活体生物检测

《国际船舶压载水和沉积物控制与管理公约》生效后，船舶会受到停靠港口所在国监管机构的检查，以监控排放的压载水是否合规。合规检查可以通过指示性分析和详细分析两个步骤进行^[9]。其中，指示性分析用于早期识别潜在的不合规情况，如果发现不合规或存在疑问，则需进行详细分析；详细分析可在不进行前期指示性分析的情况下进行。总体而言，指示性分析是快速评估，其精确度不如详细分析，并且可能是间接测量；详细分析一般直接计数生物体，通常更加精确，要求检测人员具备更高的专业知识和经过系统培训。目前，国际主流的压载水活体生物指示性分析快速检测技术主要包括脉冲调制叶绿素（Pulse Amplitude Modulation，PAM）荧光法、荧光素二乙酸酯（Fluorescein Diacetate，FDA）染色脉冲计数法、流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）和三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）法^[10]；压载水活体生物详细分析主要为显微镜检查。

2.1 PAM荧光法

PAM荧光法是一种非破坏性的生物监测技术，主要用于评估光合活性生物的生理状态，能够评估浮游植物及其他光合生物的光合作用效率与光抑制状况。该方法基于叶绿素分子在吸收光能后释放荧光的自然特性，通过精密测量和分析这些荧光信号的变化，检测叶绿素的浓度，进而推算出生物个数。此类技术使用的设备成本较低，检测速度快，但仅能进行半定量检测，其准确性取决于各厂商荧光强度和生物个数运算的数据库，且仅适用于浮游植物检测，水浊度过大时准确度降低，无法检测浮游动物^[11]。

2.2 FDA染色脉冲计数法

FDA染色脉冲计数法用于评估水样中的微生物活性或生物量。FDA本身是一种无荧光、无极性的化合物，能够自由渗透通过完整的细胞膜，当FDA进入活细胞后，被细胞内的酯酶分解生成有极性的荧光素，荧光素无法自由透过活细胞膜而积累在细胞内，使活细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。通过计数发出荧光的细胞数量，可间接评估水样中的微生物活性或生物量。然而，FDA染色脉冲计数法虽然具有灵敏度高、操作简便等优点，但也存在一些局限性，如可能受到非生物因素（化学物质、光照等）的干扰，从而影响结果的准确性。因此，在使用该方法时需要注意控制实验条件，并结合其他生物学和生态学指标进行综合评估。

2.3 FCM

FCM能够对样本进行快速和多参数分析，并且无论微生物细胞是否可培养，都能对其进行有效检测，适用于群落水平和单细胞水平分析。FCM可以与多种染色剂或标记物结合使用，通过荧光分子标记目标细胞，使它们与非生物颗粒区分开来。FCM在压载水处理系统认可测试和压载水详细分析中展现出巨大的应用潜力，可应用于测量样本中生物体的相对大小、数量以及活力^[12]。FCM的优势在于其高通量处理能力，能在短时间内处理大量样本，对于需要大量数据支持的合规性检测至关重要。它不仅能提供关于微生物数量的直接信息，还能通过荧光标记物的使用揭示微生物的生理状态，如区分活细胞与死细胞、受损细胞或存活但不可培养（Viable But Non-Culturable，VBNC）状态细胞，从而帮助评估压载水处理系统的实际效能。然而，流式细胞仪价格昂贵、体积庞大、操作复杂，且通常不能提供对所计数生物的视觉确认。因此，具有绿色自荧光的无生命颗粒可能被误认为是活的生物体^[13]。此外，由于前向散射大小校准是使用球形珠子进行的，所以非球形生物体的最小尺寸（宽度）难以准确判断。水生原生生物很少是球形的（微型浮游生物和纳米鞭毛虫除外），且部分以多细胞群体或丝状体形式存在^[14]。在流式细胞仪中，群体中的每个细胞不会被单独计数为一个细胞，而是整个群体被计为一个细胞。因此，如果小细胞（＜10 μm）以群体形式生长，流式细胞仪可能将它们计为一个＞10 μm的生物体，从而将其归类为压载水性能标准中的10～50 μm大小类别。

2.4 ATP法

ATP是生命体的标志性物质，通过测量ATP的含量可量化液体环境中活体生物的数量，包括细菌、真菌、原生动物、藻类、硅藻以及其他浮游生物。与其他方法相比，ATP法能够检测样本中的所有活生物体，ATP分析提供了即时的生物负荷指标，因为所有活细胞都含有ATP，它是细胞能量传递的分子基础。这意味着ATP检测能够快速而全面地评估压载水中的微生物总量，对于即时判断压载水处理系统的处理效果尤为有用，尤其是在船上进行指示性分析快速检测时。需要注意的是，ATP水平也可能受到非生物因素（如有机质）的干扰，因此在解释数据时应予以考虑。

2.5 显微镜检查

显微镜检查常用于详细分析，它不仅能够对微生物进行定量并观察细胞形态，还可以识别反映细胞存活能力的特征，或结合染色技术进行细胞存活状况的评估。然而，该方法耗时较长，仅适用于小体积的样本分析，并且需要高度的专业技能。使用显微镜计数10～50 μm的生物体时，涉及正确确定该尺寸范围内生物的最小尺寸以及评估其生命力等多个问题。可自行移动的生物显然具有生命力，但由于许多原生生物不具有移动性，因此常使用染色剂来辅助判定生命力。但是，在某些情况下染色剂也不是绝对的生命力指示剂，例如处于指数增长阶段的细胞群体中，细胞间的绿色荧光强度可能相差10倍以上，导致对低荧光强度细胞生命力的视觉判断变得主观随意^[15]。此外，计数过程中生物体的生命力可能会下降，从而限制了样本计数的可用时间。基于形态学分类的标本鉴定为生物多样性评估提供了基础，但这些传统方法也存在不足，限制了其实用性。基于形态学的生物多样性评估往往费时且成本高昂，对专业的分类学知识依赖性强^[16]，通常仅限于识别完整的成年个体^[17]，并且许多分类群尚未进行全面的分类学评估，其中包括一些种类繁多且生态上重要的类群^[18]。

3 病原菌检测

依据《国际船舶压载水和沉积物控制与管理公约》D-2条款，压载水合规检测包括对活体生物的检测，还包括对病原菌进行检测，病原菌检测主要包含以下几种方法。

3.1 显微镜检验

病原菌的形态学检验方法主要依赖于显微镜观察，结合染色技术来揭示病原菌的形态特征，为病原菌的初步识别和分类提供依据。细菌形态学检验包括菌落形态学检验和细胞形态学检验，细菌的形态、染色以及特殊结构是最基本的分类依据。

3.2 血清学检验

病原菌的血清学检验是利用免疫学试验的方法和原理，通过已知特异性抗体免疫血清与分离培养的未知纯种细菌或标本中的抗原进行血清学反应，以确定病原菌的种或型，如凝集试验、沉淀试验等。

3.3 生化检验

病原菌的生化检验是一种利用生物化学方法来检测细菌的代谢产物，从而鉴别不同种类细菌的实验技术。由于各种细菌所具有的酶系统不同，对营养物质的利用能力也各异，在代谢过程中所产生的合成或分解产物也不同。这些代谢产物具有种的特异性，通过检测这些代谢产物，可以鉴别细菌的种类，如氯化钠试验、氧化酶试验等。

3.4 分离培养

病原菌分离培养方法，如平板计数法、滤膜法和最大可能数（Most Probable Number，MPN）法等，依赖于微生物的生长，通常耗时较长，特别是对于生长缓慢的物种尤其如此。选择性培养基可以在一定程度上实现微生物的区分，但物种或株系鉴定则需要额外的分析。此外，基于分离培养的方法往往会低估活细胞的数量，因为许多微生物在实验室条件下无法生长和繁殖^[19]，以及还有处于VBNC状态的细胞。使用固体培养基时，由于压载水中的微生物源自液体介质，实验室结果与实际情况之间可能存在差异。

3.5 分子生物学技术

当前，基于核酸的检测技术在敏感性、特异性和成本效益方面所展现出来的进展已受到广泛认可。这些基于探针的方法不仅适用于检测缺乏诊断性形态特征的卵、幼虫和其他生活阶段^[20]，亦能辨识种级上难以通过形态学区分的相似种^[21]，以及存活但不可培养的微生物^[22]。因此，分子生物学技术，如环境DNA（environmental Deoxyribonucleic Acid，eDNA）分析，正逐渐成为补充或替代传统形态学方法的重要工具。eDNA方法可以从环境样本中提取脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）片段，结合高通量测序技术，能够快速识别环境中的生物种类，显著提高检测速度，并探测到难以用传统方法发现的稀有物种或微小生物。这种方法降低了对专业分类学知识的依赖，揭示包括微生物在内的整个生态系统的生物多样性概况。尽管eDNA技术在应用过程中仍面临如DNA的降解、污染问题和数据解析复杂性等挑战，但其在压载水监测领域的潜力已被广泛认可，有望为有效管理生物入侵风险和保护全球海洋生物多样性提供有力支持。

尽管基于核酸的检测工具在目标检测方面具有显著优势，但定量分析技术亟待优化，如荧光定量PCR（Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction，qPCR）在将浓度数值转换为生物体数量方面需要进一步完善。对于单细胞目标物种而言，因细胞计数与核酸浓度之间存在较强的相关性^[23]，换算相对简单；然而对于像浮游动物等体积更大、结构更复杂的生物体，由于个体间体重的差异，换算更为复杂，因此准确性有待提升^[24]。未来，核酸检测方法也可以从判断目标生物的存活状态方面进一步深入研究。

4 展望

压载水带来的生物入侵风险正逐步受到重视，针对压载水生物的检测技术也在不断发展。现有的检测技术原理及目标生物各有不同，所得结果也各有侧重。此外，微流控芯片技术以及基于流式细胞术的流式细胞摄像系统等也正应用于压载水生物检测，这些技术智能化、自动化程度高，但价格昂贵且对算法要求高。随着计算机技术、光学成像技术、传感器技术及测序技术的快速发展，目前压载水生物检测技术将逐步完善，灵敏度高、自动化智能化、直观可视化的检测技术也将进一步发展。

压载水富集技术主要是从大量的压载水中有效地富集和分离出其中的生物样本，使检测更加集中和有效，主要包括富集培养法、离心法、过滤法等。富集技术在压载水检测过程中发挥了重要作用，但是应用中还存在富集效率低、富集不完全、对富集对象的物理损伤和化学干扰、自动化和智能化水平不足的现象。今后还需积极探索新的富集方法和处理技术，提高过滤精度和效率，降低处理成本，如加强磁性分离法的应用、研究纳米过滤材料和多级过滤系统、加强富集设备的自动化和智能化研究等^[25]。

微生物在面临黑暗的压载水舱或饥饿时期时，也会采用形成孢囊^[26]和进入VBNC状态等多种生存策略。在海洋环境中，已记录到指示性细菌等病原微生物都可能处于VBNC状态^[27]。它们可能仍然具有传染性，继续产生毒素，或者在排放时由于环境条件改变而从VBNC状态恢复^[28]，从而构成健康风险。在压载水舱中，微生物可能采用另一种生存策略——形成生物膜，即“内部船体污垢”^[29]，这些生物膜不仅为微生物细胞提供对抗物理、化学或生物压力的保护，增强生存能力，还可能促进了微生物种类的传播，对生态系统构成潜在威胁。因此，未来的研究应加强对这些方面的深入探讨。

此外，除了压载水外，对沉积物的研究也应受到高度重视。压载水舱中的沉积物积累受多种因素的影响，如船舶的压载管理实践、压载水舱类型，以及自上次干坞清洗以来的时间。沉积物的处理通常在船舶干坞维护期间进行，频率约为每30个月1次^[30]。根据《国际海上人命安全公约》（International Convention for the Safety of Life at Sea，SOLAS），船只必须在5年内完成2次在干坞中的船体检查，且2次检查之间的间隔不得超过36个月。压载水舱中沉积物的积累厚度从几厘米到超过30 cm不等，相当于数十吨到数百吨的沉积物。虽然不同船只间的沉积物类型有所差异，但大多数为细泥，平均颗粒尺寸小于20 μm^[31]。这些沉积物不仅占据了压载水舱空间，增加了船舶的重量和燃料消耗，而且可能携带各种外来物种、病原体以及有害物质，对环境构成潜在威胁。因此，对压载水舱沉积物的有效管理，不仅是遵守国际公约的要求，也是保护全球海洋生态平衡的重要措施。尽管《国际船舶压载水和沉积物控制与管理公约》在处理压载水来控制外来水生生物传播方面有所规定，但对于由沉积物引起问题处理的规定尚不够充分。因此，国际社会亟待加强对沉积物管理的重视，制定具体的标准和指导原则，确保沉积物处理和排放的安全性，以全面保护全球海洋生态系统的健康与稳定。

参考文献

[1] KodziusR, GojoboriT. Marine metagenomics as a source for bioprospecting[J]. Marine Genomics 24(1): 21-30.

[2] DeLong E F, Karl D M. Genomic perspectives in microbial oceanography[J]. Nature, 2005(437): 336-342.

[3] Karl D M. Microbial oceanography: paradigms processes and promise[J]. Nature Reviews Microbiology, 2007(5): 759-769.

[4] Steichen J, Schulze A, Brinkmeyer R, et al. A biological survey of ballastwater on board vessels travelling the North Atlantic Ocean[J]. Marine Pollution Bulletin, 2014(87): 201-210.

[5] Casas Monroy O, Linley R D, Adams J K, et al. Relative invasion risk for plankton across marine and freshwater systems:examining efficacy of proposed International ballast water discharge standards[J]. Public Library of Science One10, 2015(3): e0118267.

[6] Curtis T P, Sloan W T, Scannell J W. Estimating prokaryotic diversity and its limits[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002(99): 10494-10499.

[7] McCarthy S A, Khambaty F M. International dissemination of epidemic Vibriocholerae by cargoship ballast and other nonpotable waters[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1994(60): 2597-2601.

[8] Seoane S, Puente A, Guinda X, et al. Bloom forming and toxic phytoplankton in transitional and coastal waters of Cantabria region coast (Southeastern Bay of Biscay, Spain) [J]. Marine Pollution Bulletin, 2012(64): 2860-2866.

[9] International Maritime Organization. Guide lines for ballast water sampling (G2) Resolution MEPC[S]. 2008b, 173(58): 4-5.

[10] 李涛, 田玉军, 文嘉鹏. 港口水域船舶压载水采集及快速分析技术概述[J] 交通节能与环保, 2022(6): 9-10.

[11]詹世杰, 王建, 张灿. 压载水指示性分析仪器在未来船舶运营中的趋势分析[J] 航海技术, 2022(2): 66-67.

[12] Bakalar G. Review of inter disciplinary devices for detecting the quality of ship ballast water[J]. Springerplus, 2014.3(1): 468.

[13] Tang Y Z, Dobbs F C. Green autofluorescence in dinoflagellates, diatoms, and other microalgae and its implications for vital staining and morphological studies[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007(73): 2306-2313.

[14] Hoppenrath M, Elbrachter M, DrebesG. Selected microphytoplankton species from the North Sea around Helgoland and Sylt[J]. Germany Schweizerbart Science Publishers, 2009: 18-21.

[15] Peperzak L, Brussaard CPD. Phytoplankton viability assay for oil compounds in water[M]. Handbook of hydrocarbon and lipidmicrobiology book5, 2010: 4499-4508.

[16]Pfrender M E, Hawkins C P, Bagley M J, et al. Assessing macroinvertebrate biodiversity in fresh water ecosystems: advances and challenges in DNA-based approaches[J]. Quarterly Review of Biology, 2010(85): 319-340.

[17] Besansky N J, Severson D W, Ferdig M T. DNA barcoding of parasites and invert berate disease vectors: what you don’t know can hurt you[J]. Trends in Parasitology, 2003(19): 545-546.

[18] Creer S, Fonseca V G, Porazinska D L, et al. Ultrasequencing of the mei of aunal biosphere:practice, pitfalls and promises[J]. Molecular Ecology, 2010, 19(1): 4-20.

[19] Tyson G W, Banfield J F. Cultivating the uncultivated: aco-mmunity genomics perspective[J]. Trends in Microbiology, 2005(13): 411-415.

[20] Pfrender M E, Hawkins C P, Bagley M J, et al. Assessing macroinvert berate biodiversity in fresh water ecosystems: advances and challenges in DNA-based approaches[J]. Quarterly Review of Biology, 2010(85): 319-340.

[21] Bucklin A, Ortman B D, Jennings R M, et al. A “RosettaStone” for metazoan zooplankton: DNA barcode analysis of species diversity of the Sargasso Sea (Northwest Atlantic Ocean)[J]. Deep-SeaRes IITop Stud Oceanogr, 2010(57): 2234-2247.

[22] Li L, Mendis N, Trigui H, et al. The importance of the viable butnon-culturable statein human bacterial pathogens[J]. Frontiers in Microbiology, 2014(5): 258.

[23] Doblin M A, Coyne K J, Rinta-Kanto J M, et al. Dynamics and short-term survival of toxic cyanobacteria species in ballast water from NOBOB vessels transiting the GreatLakes—implications for HAB invasions[J]. Harmful Algae, 2007(6): 519-530.

[24] Darling J A, Blum M J. DNA-based methods for monitoring invasive species:a review and prospectus[J]. Biological Invasions, 2007(9): 751-765.

[25]吴妍, 张晓, 张良. 水源性致病微生物检测中水样前处理方法研究进展[J] 净水技术 2023, 42(11): 8-17.

[26] Grigorszky I, Kiss K T, Beres V, et al. The effects of temperature nitrogen and phosphorus on the encystment of Peridiniumcinctum, Stein(Dinophyta)[J]. Hydrobiologia, 2006(563): 527-535.

[27] Kaberdin V R, Montanchez I, Parada C. Unveiling the metabolic pathways associated with the adaptive reduction of cell size during Vibrioharvey ipersistence in seawater microcosms[J]. Microbial Ecology, 2015(70): 689-700.

[28] Fernandez-Delgado M, Garcia-Amado M A, Contreras M, et al. Survival induction and resuscitation of Vibriocholerae from the viable but non culturable state in the Southern Caribbean Sea[J]. Revista Do Institu to De Medicina Tropical De Sao Paulo, 2015(57): 21-26.

[29] Drake L A, Meyer A E, Forsberg R L, et al. Potential invasion of microorganisms and pathogens via‘interiorhullfouling’: biofilms inside ballast water tanks[J]. Biological Invasions, 2005(7): 969-982.

[30] Apostolidis A, Kokarikis J, Merikas A. Modelling the dry-docking cost-the case of tankers[J]. Journal of Ship Production and Design, 2012, 28(3): 134-143.

[31] Hamer J P. Ballast tank sediments invasive aquatic species of Europe[J]. Distribution impacts and management Springer Dordrecht, 2002: 232-234.

基金项目：国家重点研发计划（2022YFC2302800）

第一作者：于滢泉（1981—），男，汉族，山东临沂人，本科，副主任技师，主要从事卫生检疫工作，E-mail: yingquan_yu@foxmail.com

通信作者：杜建森（1985—），男，汉族，山东安丘人，博士，高级工程师，主要从事卫生检疫工作，E-mail: djs916@163.com

1. 青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部） 青岛 266073

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