高洁 岳燕喜 倪永付 朱涛 武娜

摘 要 本文针对酱油调味料中可能添加的6种合成着色剂（柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性橙Ⅱ），结合样品特性，从样液稀释倍数、固相萃取柱的选择以及液相色谱仪检测条件进行研究，建立了高效液相色谱法同时测定酱油调味料中6种合成着色剂的方法。结果显示，6种合成着色剂在0.2～10.0 μg·mL^-1的质量浓度范围内线性良好，相关系数r＞0.9990，检出限为0.1～0.5 mg·kg^-1，定量限为0.3～1.5 mg·kg^-1，平均加标回收率为95.0%～98.2%，相对标准偏差（n = 6）在6.0%以内。该方法便捷、高效，适用于酱油调味料中6种合成着色剂的同时测定。

关键词 高效液相色谱法；马铃薯葡萄糖琼脂培养基；酱油调味料；合成着色剂；阴离子交换柱固相萃取柱

Determination of Six Synthetic Colorants in Soy Sauce Seasoning by High-Performance Liquid Chromatography

GAO Jie ¹ YUE Yan-Xi ¹ NI Yong-Fu ¹ ZHU Tao ² WU Na ¹

Abstract This article focuses on six synthetic colorants (Tartrazine, Amaranth, Ponceau 4R, Sunset Yellow FCF, Allura Red AC, and Acid Orange Ⅱ) potentially added to soy sauce seasonings. Based on the characteristics of the samples, a high-performance liquid chromatography method (HPLC) was established to simultaneously determine the six synthetic colorants in soy sauce seasonings, including the dilution ratio of the sample solution, the selection of solid-phase extraction columns, and the detection conditions of the liquid chromatograph. The results showed that the six synthetic colorants exhabited good linearity within the mass concentration range of 0.2-10.0 μg·mL^-1, with a correlation coefficient r＞0.9990, a detection limit of 0.1-0.5 mg·kg^-1, a quantification limit of 0.3-1.5 mg·kg^-1, an average spiked recovery rate of 95.0%-98.2%, and a relative standard deviation (n = 6) of 6.0% or less. This method is convenient, efficient, and suitable for the simultaneous determination of six synthetic colorants in soy sauce seasonings.

Keywords High-Performance Liquid Chromatography (HPLC); Photo-Diode Array (PDA); soy sauce seasoning; Synthetic Colorants; Anion Exchange solid-phase extraction (SPE) columns

酱油调味料包括各种类的酱油及由酱油成分制作的浓缩调味料（如红烧酱料、红烧酱卤等），主要是小麦、大豆等原料发酵而成，含有糖类、有机酸、氨基酸等多种生理活性和营养物质成分^[1]，是日常生活中必不可少的传统调味品。随着酱油调味料消耗量的上升，其年产量不断增加，市面上的产品越来越多样化。为使酱油调味料的色彩鲜艳，可以添加可食用色素焦糖色等^[2]。合成着色剂和可食用色素在功能上有相似性，大多是含磺酸基偶氮染料^[3-5]。欧洲委员会颁布的欧盟食品接触材料着色剂AP89决议Resolution AP(89)1 on Colourants和我国GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》，对允许使用于食品中的9种合成着色剂作出规定^[6]。

合成着色剂的分析方法有很多种，使用最广泛的检测方法为高效液相色谱法^[7]，而配备二极管阵列检测器后，其对多种合成着色剂分离速度更快、灵敏度和分辨率更高，更适用于复杂基质成分分离、多种目标物的同时检测^[8]。我国已发布GB/T 5009.35—2023《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》，对15种合成色素同时进行检测，但其中不包括酸性橙Ⅱ；SN/T 3536—2013《出口食品中酸性橙Ⅱ号的检测方法》中规定了出口食品（饮料、红酒、黄鱼等）中酸性橙Ⅱ号的高效液相色谱法检测方法。

国标方法针对不同类型的固体样品中的合成着色剂建立了统一的检测方法，但处理方法复杂、耗时长、效率低，不适用于液体样品^[9]。SN/T 3536—2013中的方法对液体样品（饮料、红酒）中酸性橙Ⅱ建立了检测方法，但不适用于酱油这种基质略复杂、盐度较高的液体样品。另外，还有很多学者对食品中的合成着色剂进行了研究^[10]。

本文根据合成着色剂的结构特点，结合酱油调味料样品的特性，针对酱油调味料中可能添加的6种合成着色剂（柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性橙Ⅱ），研究其前处理方法及高效液相色谱检测条件，最终确定了采用固相萃取作为前处理方法，高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）梯度洗脱，建立了同时测定酱油调味料中6种合成着色剂的固相萃取-高效液相色谱（Solid phase extraction column- High Performance Liquid Chromatography, SPE-HPLC）方法，以期为酱油调味料的食品安全及实验室检测方法研究提供参考。

1 实验部分

1.1 实验仪器及材料

Agilent1260高效液相色谱仪（配备二极管阵列检测器）购于美国Agilent公司；HS260B振荡仪购于德国IKA公司；Bioridge GL-23M离心机购于湘仪公司；MS3 basic涡旋振荡器购于德国IKA公司；CPA225D分析天平购于德国Sartorius AG 公司；Milli-Q超纯水系统购于Millipore公司；氮气浓缩装置购于美国OA-SYS公司。

氨水（分析纯）、石油醚（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、甲酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、超纯水（18.2 MΩ·cm）和乙酸铵（分析纯）；固相萃取柱：氨基阴离子交换柱（Welchrom NH₂，500 mg/6 mL）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄浓度均为100 μg·mL^-1，（中国计量科学研究院）；诱惑红浓度为100 μg·mL^-1，（阿尔法，纯度≥95%）；酸性橙Ⅱ：DR，（纯度92.16%），酸性橙Ⅱ标准储备液：按酸性橙Ⅱ纯度折算为100%后，准确称取10 mg（精确至0.0001 g），加水溶解后定容至100 mL，配置成100 μg·mL^-1的标准储备液。

混合标准中间液（10 μg·mL^-1）：上述6种标准储备液各移取5 mL，置于50 mL容量瓶中，用水定容，摇匀，得到混合标准中间液（各合成着色剂浓度均为10 μg·mL^-1）。

标准系列工作液：吸取混合标准中间液，用水稀释成浓度为0.2 μg·mL^-1、0.5 μg·mL^-1、1.0 μg·mL^-1、2.0 μg·mL^-1、5.0 μg·mL^-1、10.0 μg·mL^-1的标准工作液，储存于4℃冰箱中。

1.2.2 试剂配制

2%甲酸水溶液：取2 mL甲酸，用水定容至100 mL。

10%氨水甲醇溶液：取10 mL氨水，用甲醇定容至100 mL。

1.2.3 样品前处理

准确称取酱油调味料样品10.00 g（精确至0.01 g）于25 mL容量瓶，用水定容至刻度，混匀，振荡5 min，离心10 min，取上清液10 mL，转移至活化后的固相萃取柱（6 mL甲醇、6 mL水活化），依次用3 mL甲酸水溶液、3 mL甲醇溶液淋洗，用6 mL氨水甲醇溶液洗脱。收集洗脱液，氮吹至近干，加水定容至2 mL，涡旋混合1 min，过0.45 μm水性滤膜后，待测。

1.2.4 液相色谱仪参数与条件

色谱柱：C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；进样量：10 μL；柱温：30℃；检测器：二极管阵列；波长范围：415～520 nm，检测波长：415 nm（柠檬黄），520 nm（苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性橙Ⅱ）；液相色谱仪洗脱梯度见表1。

表1 6种合成着色剂的洗脱梯度表

Table 1 Elution gradient table of 6 synthetic colorants

2 结果与分析

2.1 检测方法优化

2.1.1 液相色谱仪检测参数选择

本实验采用150 mm的C₁₈色谱柱对6种合成着色剂进行同时分离、检测，相较于国标方法中使用的250 mm的C₁₈色谱柱，目标物出峰更快，缩短了检测时长，间接延长了色谱柱使用寿命^[11]。

将浓度为10.0 μg·mL^-1的6种合成着色剂混合标准溶液以1.2.4液相色谱仪条件注入液相色谱，考察不同洗脱梯度及淋洗液配比下6种合成着色剂的分离效果。结果表明，按照表1的梯度洗脱程序可以实现较好的分离，同时各组分的响应值也得到增强，6种合成着色剂的液相色谱图如图1所示 。

图1 6种合成着色剂混合标准溶液色谱图

Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 6 synthetic colorants

2.1.2 样品稀释倍数的选择

准确称取10.00 g（精确至0.01 g）酱油调味料样品，分别用水定容于10 mL 、25 mL、50 mL容量瓶，按照1.2.3进行处理。上机结果显示定容于10 mL 、50 mL的样品，回收率在80%～90%之间，而定容于25 mL的样品，回收率高于90%以上。实验表明，定容于25 mL的处理方法不易造成固相萃取柱堵塞，便于操作；回收率最高，处理效果最佳。因此，最终选择的稀释处理方法为：称取10.00 g酱油调味料样品，用水定容于25 mL容量瓶。

2.1.3 固相萃取柱的选择

固相萃取技术是目标物通过在吸附剂填料中选择性保留与选择性洗脱从而实现净化的一种分离技术^[12]。笔者对酱油调味料样品处理过程中是否需要使用固相萃取柱进行了辩证。图1处理过程中未使用固相萃取柱，结果表明，谱图中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄附近基线高，存在杂质峰，影响结果准确性，且容易损毁色谱柱。图2是固相萃取柱净化后的目标物谱图，基线平稳，无杂质，6种着色剂分离较好且无干扰。因此，在酱油调味料的处理过程中应选择采用阴离子交换固相萃取柱。

2.2 线性范围、检出限及定量限

选用优化后的色谱条件和参数，上机运行1.2.1中的标准系列溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性拟合。6种合成着色剂在0.2～10 μg·mL^-1 内均呈良好的线性，相关系数（r）均在0.9990以上。本试验条件下对混合标准溶液进行稀释，以日落黄的3倍信噪比、10倍信噪比确定检出限和定量限。6种合成着色剂的各项参数见表3。

表3 6种合成着色剂加标回收率和精密度 (n = 6)

Table 3 The recovery rates and precision of six synthetic colorants (n = 6)

注: ND表示未检出

2.3 回收率及精密度

对该方法进行确证性实验，选取阴性酱油调味料样品，每份样品称取10.00 g，制作3个浓度水平的回收样品，3个浓度分别为1.0 mg·kg^-1、5.0  mg·kg^-1和10.0 mg·kg^-1，每个浓度平行做6次，结果见表3。酱油调味料中合成着色剂的回收率在95.0%～98.2%之间，相对标准偏差（RSD）小于6%（n = 6），表明该方法具有较好的回收率与精密度。

3 实际样品测定

对12个酱油调味料样品进行盲样检测，在其中2个酱油调味料中单独添加浓度为0.80 mg·kg^-1、0.60 mg·kg^-1的酸性橙Ⅱ，检出浓度依次为0.79 mg·kg^-1、0.58 mg·kg^-1，回收率＞96.7%，如图4、图5所示。样品检测结果符合相关规定要求。

图4 样品1中合成着色剂酸性橙Ⅱ的色谱图

Fig.4 Chromatogram of Acid Orange Ⅱin Sample 1 soy sauce

图5 样品2中合成着色剂酸性橙Ⅱ的色谱图

Fig.5 Chromatogram of Acid Orange Ⅱin Sample 2 soy sauce

4 结论

本研究所建立的固相萃取-高效液相色谱法（SPE-HPLC）可同时测定酱油调味料中的柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性橙Ⅱ共6种合成着色剂的含量。采用阴离子交换固相萃取小柱对样品中的合成着色剂进行提取和净化，并优化梯度洗脱程序，6种合成着色剂在 C₁₈色谱柱上实现了良好的分离， 同时二极管阵列检测器提高了目标物的响应值，降低了酱油样品的基质干扰，使得方法检出限更低、精密度更高。本方法可为酱油调味料领域的检测提供技术支持。

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第一作者：高洁（1984—），女，汉族，山东济宁人，硕士，高级工程师，主要从事食品检验工作，E-mail: gaoabai@163.com

1. 济宁海关技术中心 济宁 272000

2. 浙江绿城医院司法鉴定所 杭州 310000

1. Jining Customs Technical Centre, Jining 272000

2. Zhejiang Green City Hospital Forensic Institute, Hangzhou 310000

图2 6种合成着色剂未使用固相萃取柱净化的色谱图

Fig.2 Chromatograms of 6 synthetic colorants without solid-phase extraction column purification

图3 6种合成着色剂使用固相萃取柱净化后的色谱图

Fig.3 Chromatograms of 6 synthetic colorants purified using solid-phase extraction columns

表2 6种合成着色剂检出结果

Table 2 Detection results of 6 synthetic colorants