吴丽娜 殷培军 武茂苍 王小叶 段效辉 杨爽 唐静 贾俊涛

摘 要 CytoQuant^®便携式流式细胞仪是一种新的活菌快速计数设备。本研究以GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》为参照方法，依据ISO 16140-2:2016《食物链的微生物学 方法验证 第2部分：参考法替代（专有）方法验证协议》和GB 4789.45—2023《食品安全国家标准 微生物检验方法验证通则》，对CytoQuant^®便携式流式细胞仪的活菌计数性能进行验证，包括仪器的线性和检出限、精密度、包容性，并通过检测水、乳酸菌、环境涂抹、食品等样品验证其快速检测效果。结果显示，CytoQuant^®便携式流式细胞仪的活菌计数结果与国标法计数结果无显著性差异，定量范围为10⁴ ～10⁷ CFU/mL。结果表明，CytoQuant^®便携式流式细胞仪可有效快速地计数微生物数量，且与国标法微生物检测相比，流程简单，耗时短，可提高检测效率，满足样品快速检测的需要。

关键词 流式细胞仪；验证；快速检测

Performance Validation of the CytoQuant^® Mobile Flow Cytometry

WU Li-Na^1�YIN Pei-Jun¹ WU Mao-Cang² WANG Xiao-Ye¹

DUAN Xiao-Hui³ YANG Shuang⁴ TANG Jing¹ JIA Jun-Tao^1*

Abstract The CytoQuant® mobile flow cytometer is a novel device for rapid counting of viable bacteria. This study aimed to validate the performance of the CytoQuant mobile flow cytometer in viable cell counting, using National Food Safety Standard-Food Microbiological Examination: Aerobic Plant Count (GB 4789.2-2022) as the reference method. The validation was conducted in accordance with Microbiology of the Food Chain-Method Validation-Part 2: Protocol for the Validation of Alternative (Proprietary) Methods against a Reference Method (ISO 16140-2:2016) and National Food Safety Standard-General Rules for Validation of Microbiological Test Methods (GB 4789.45-2023). The validation included assessment of the instrument’s linearity and detection limit, precision, inclusivity, and its rapid detection effectiveness was verified through the examination of samples such as water, lactic acid bacteria, environmental swabs, and food. The results showed that there was no significant difference between the cell counts obtained by the CytoQuant mobile flow cytometer and those by the national standard method, with a quantitative range of 104 to 107 CFU/mL. The findings indicate that the CytoQuant mobile flow cytometer can effectively and rapidly count microbial numbers, and compared with the national standard method for microbial detection, it has a simpler procedure, shorter time consumption, and can improve detection efficiency, meeting the needs for rapid sample detection.

Keywords flow cytometry; validation; rapid detection

基金项目：海关总署科研项目（2024HK004）

第一作者：吴丽娜（1995—），女，汉族，山东青岛人，硕士，中级工程师，主要从事微生物检测工作，E-mail: wuln0901@163.com

通信作者： 贾俊涛（1977—），男，汉族，山东青岛人，硕士，研究员, 主要从事微生物检测工作，E-mail: jiajt@tom.com

1. 青岛海关技术中心 青岛 266109

2. 青岛大港海关 青岛 266000

3. 烟台海关 烟台 264000

4. 天津海关动植物与食品检测中心 天津 300000

1. Technology Center of Qingdao Customs District, Qingdao 266109

2. Qingdao Dagang Customs, Qingdao 266000

3. Yantai Customs, Yantai 264000

4. Tianjin Customs Animal, Plant and Food Testing Center, Tianjin 300000

CytoQuant^®便携式流式细胞仪是近年来使用较多的快速定量细菌的仪器，通过直接定量分析环境表面的细菌与残留物，可在食品生产设施或其他关注卫生洁净度的区域，对清洁程序进行现场即时验证。它兼具流式细胞术与手持设备的便捷性，具有检测程序简单、数据传输简便、测量不受消毒剂或温度的影响、读取结果快等优势，可即时对食品生产设施、洁净室、医院或其他需要关注卫生洁净度的环境表面进行细菌与残留物的定量分析。相对于传统微生物平板培养方法，CytoQuant^®便携式流式细胞仪可在30 s内快速出具实验结果，缩短检测周期。

本研究以GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》为参照，将CytoQuant^®便携式流式细胞仪计数结果与国标法计数结果进行比较，验证仪器的使用效率，并通过在不同样品中添加污染菌株，评价在实际样品检测过程中仪器的定量分析效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

大肠埃希氏菌（Escherichia coli. ATCC 25922，Ec）（美国菌种保藏中心）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus. ATCC 25923，Sa）（美国菌种保藏中心）、肠炎沙门氏菌ATCC 13076（美国菌种保藏中心）、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 49416（美国菌种保藏中心）、宋内志贺氏菌ATCC 25931（美国菌种保藏中心）、副溶血性弧菌ATCC 17802（美国菌种保藏中心）、单增李斯特氏菌ATCC 19114（ 美国菌种保藏中心）、铜绿假单胞菌ATCC 27853（美国菌种保藏中心）、小肠结肠炎耶尔森氏菌NICPBP 52203（中国药品生物制品检定所）、粪肠球菌ATCC 19433（美国菌种保藏中心）、植物乳杆菌CGMCC(B) 1.0557（中国普通微生物菌种保藏管理中心）、乳酸乳球菌ATCC 11454（美国菌种保藏中心）、两歧双歧杆菌CICC 10395（中国工业微生物菌种保藏管理中心）、克罗诺杆菌NICPBP 50205（中国药品生物制品检定所）、蜡样芽孢杆菌ATCC 11778（美国菌种保藏中心）、产气荚膜梭菌ATCC 13124（美国菌种保藏中心）、乙型溶血性链球菌CMCC 32210（中国医学细菌保藏管理中心）。

1.1.2 试剂与仪器

磷酸盐缓冲液（PBS，sigma 806552，pH = 7.4）；菌落总数测试片（3M）；MRS培养基、平板计数琼脂、0.85%生理盐水、含3%氯化钠的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，均购于北京陆桥技术股份有限公司。

CytoQuant®便携式流式细胞仪购于上海茸众仪器科技有限公司。

1.1.3 样品

将实验菌株接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基，置于（36±1）℃培养24 h，Ec和Sa用稀释液（PBS用无菌水稀释20倍）制备污染浓度分别为10³ CFU/mL、10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL、10⁶ CFU/mL、10⁷ CFU/mL、10⁸ CFU/mL的样液。其余菌株制备污染浓度在10⁴～10⁷ CFU/mL之间的样液。

1.2 试验方法

1.2.1 线性和检出限

取浓度为10³～10⁸ CFU/mL的Ec和Sa样液进行线性试验。对每一种菌，分别用我国国家标准（以下简称“GB”）和CytoQuant^®便携式流式细胞仪（以下简称“CQ”）测试每个试样，重复测试3次（如果菌液浓度高导致CQ无法读数，将菌液稀释后再计数），将6个不同稀释度的Ec和Sa取2 mL加入到样品检测管中，用CQ进行检测，同时分别将菌液10倍梯度稀释，取1 mL适宜梯度的菌液加到菌落总数测试片，（36±1）℃培养24 h。按ISO 16140-2:2016《食物链的微生物学 方法验证 第2部分：参考法替代（专有）方法验证协议》的方法拟合线性并绘制Bland-Altman偏倚图。根据测试结果估算检出限。

1.2.2 精密度

取浓度为10⁵ CFU/mL、10⁶ CFU/mL、10⁷ CFU/mL的Ec和Sa样液进行精密度试验。对每一种菌，每个浓度测试2个试样，每个试样重复测试5次，分别用GB和CQ进行测试，具体检测方法同1.2.1所述，按ISO 16140-2:2016和GB 4789.45—2023《食品安全国家标准 微生物检验方法验证通则》的方法绘制准确度图并进行评价。

1.2.3 包容性

对全部菌种，每种菌选取一管浓度在10⁴ ～10⁷ CFU/mL之间的样液，每管样液用CQ和GB同时测试。将菌株浓度调整至10⁴～10⁷ CFU/mL后，取2 mL加入到样品检测管中，用CQ进行检测。同时，将菌液10倍梯度稀释，用GB进行检测，取1 mL适宜梯度的菌液（具体为肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内志贺氏菌、单增李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、克罗诺杆菌、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、乙型溶血性链球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌）加到菌落总数测试片，（36±1）℃培养24 h。其中，小肠结肠炎耶尔森氏菌（26±1）℃培养48 h，产气荚膜梭菌厌氧培养；副溶血性弧菌0.1 mL涂布在含3%氯化钠的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，（36±1）℃倒置培养24 h；植物乳杆菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌用MRS培养基倾注平皿，待培养基凝固后，（36±1）℃厌氧倒置培养72 h。重复3次，绘制柱状图。

1.3 样品检测

选取水、乳酸菌、环境涂抹（实验台面、不锈钢面、地胶、地砖）、食品（牛奶、乳粉、调味粉、糕点、饼干）等样品进行检测。

无菌水用不同浓度Ec样液污染后，浓度约为10¹ CFU/mL、3×10¹ CFU/mL、9×10¹ CFU/mL、10² CFU/mL、3×10² CFU/mL、9×10² CFU/mL、10³ CFU/mL、3×10³ CFU/mL、10⁴ CFU/mL、3×10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL，其中，浓度为10¹ CFU/mL、3×10¹ CFU/mL、9×10¹ CFU/mL、10² CFU/mL、3×10² CFU/mL、9×10² CFU/mL的样液过滤浓缩1 L，浓度为10³ CFU/mL、3×10³ CFU/mL的样液过滤浓缩0.5 L，浓度为10⁴ CFU/mL、3×10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL的样液过滤浓缩0.1 L，滤膜剪碎后放入离心管中，用5 mL稀释液重悬，用GB和CQ对其进行检测，具体检测方法同1.2.1所述。

乳酸菌样品取1 g置于盛有9 mL稀释液中，用稀释液稀释至10⁵ CFU/mL左右，取2 mL加入到样品检测管中，用CytoQuant^®便携式流式细胞仪进行检测，同时用MRS培养基倾注平皿，待培养基凝固后，（36±1）℃厌氧倒置培养72 h。

浓度范围在10⁴～10⁷ CFU/mL之间的Ec样液分别涂布在实验台面、不锈钢面、地胶、地砖等表面，用CytoQuant^® Swab Kit的拭子涂抹5 cm²×5 cm²的环境面，再将拭子插入到检测管中进行读数，同时用菌落总数测试片进行计数。

食品样品（牛奶、乳粉、调味粉、糕点、饼干）取1 g置于9 mL稀释液中，用Ec样液将其污染至10⁸ CFU/mL，用稀释液稀释至10⁵ CFU/mL左右，用GB和CQ对同一样品进行检测，具体检测方法同1.2.1所述，每个样品测试1次。试验结果绘制散点图。

2 结果与分析

2.1 线性和检出限

通过使用CQ和GB分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行不同浓度的菌落计数，从图1和图2可以看出，两种方法线性关系显著（决定系数大于0.99），两种方法的偏倚在上下接收线（图上虚线）范围内。根据ISO 16140-2:2016判定，两种方法一致。从图3和图4还可以看出，检出限约为10⁴ CFU/mL，CytoQuant^®便携式流式细胞仪的定量范围为10⁴ ～10⁷ CFU/mL。

2.2 精密度

如图5和图6所示，中间的折线表示结果的均值或中位值，上下两条折线表示预期80%结果分布的范围，上下两条折线之间间距很窄，表示精密度良好，但有部分折线超过上虚线的界限，说明准确度略超出控制范围，原因是存在较显著的偏倚（约0.5 CFU/mL）。根据ISO 16140-2:2016规定，允许检测方法的结果出现偏倚，扣除偏倚因素（中间的折线移至横轴附近），结果准确度可以满足规定要求。

2.3 包容性

选取17株标准菌株分别通过GB和CQ测定菌液浓度，两种方法结果无显著性差异。由图7可知，CQ包容性满足要求，且CQ计数结果与GB计数结果一致，表明CytoQuant^®便携式流式细胞仪可有效进行细菌计数。

2.4 样品检测

通过对食品样品和环境样品进行检测，两种方法计数结果存在相关性（图8）。对于食品样品、乳酸菌食品样品、环境涂抹样品来说，随着染菌浓度的增加，GB和CQ测得的菌落数也随之增加，且CQ结果高于GB。对于水样来说，随着染菌浓度的增加，GB和CQ测得的菌落数也随之增加，低浓度和高浓度染菌水样CQ结果高于GB，而中浓度染菌水样结果相近。整体上，CQ结果略高于GB结果，但对于个别样品（如水样的中浓度样品），CQ结果略低于GB结果，CQ可应用于实际样品检测。

图8 样品检测结果散点图

Fig.8 Scatter plot of sample detection results

3 讨论与结论

有效的微生物检测技术对把控产品流通过程中的健康风险十分关键。传统的微生物检测方法通常包括病原菌的培养、形态学观察和生化分析等，操作简单，但菌落培养和分析时间长，致使检测效率低；菌落分离和鉴定等生化过程会导致成本增加；传统方法对突变菌株、不常见菌株和微生物分泌的特定毒素的识别能力不足。因此，迫切需要高质量的分析来解决这些传统方法的局限性。随着检测要求的提高，各种微生物快速计数方法被逐渐研发出来，包括荧光显微镜计数法、荧光定量PCR法、dPCR法、酶联免疫吸附法、酶底物法、微生物代谢法、流式细胞仪计数法、荧光计数法等^[1-2]。

在使用荧光定量PCR及平板菌落计数法计数农家干酪中双歧杆菌菌体数的研究中表明^[3]，两种方法均可有效定量双歧杆菌，但DNA 提取的浓度和纯度对荧光定量PCR计数的双歧杆菌数量影响较大，荧光定量PCR法是基于细菌 DNA浓度和纯度进行计数的，对于死菌或者非可培养状态的细菌的DNA均可提出，无法区分活死菌，导致所有状态细菌DNA全被扩增，使结果有差异，且用于荧光定量PCR法的DNA模板有一定的纯度要求，因此对提取样品中DNA的方法有要求^[4]。ATP荧光法常用于现场卫生检测和水中细菌污染的快速检测^[5-6]。虽然ATP荧光法计数结果与传统方法计数结果呈现较好的相关性，但是ATP荧光法无法区分死活细菌，只是对于人工模拟样品计数结果较为理想，而对于实际样品计数结果往往差异很大，不能准确报告菌的数量，只能半定量地反应污染程度。此外，酶底物法可有效检出水样中的大肠埃希氏菌、包装饮用水中的铜绿假单胞菌^[7-8]，与多管发酵法相比，酶底物法用于检测水样中的菌落总数、粪大肠菌群准确性较高，可以作为评价水质微生物污染的标准方法^[9]。与传统检测方法相比，以上方法具有检测速度快、结果准确等优点，但是也由于成本昂贵、仪器设备体积大等无法便捷使用。综上所述，CytoQuant^®便携式流式细胞仪体积小、携带方便、操作简单，且本研究也显示其活菌计数结果与GB 4789.2—2022计数结果一致，表明该方法可以准确计数样液中的活菌，从而快速出具实验结果，更有效应用到实际检测中。

参考文献

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图1 大肠埃希氏菌ATCC 25922线性图

Fig.1 Linear graph of Escherichia coli. ATCC 25922

图2 金黄色葡萄球菌ATCC 6538线性图

Fig.2 Linear graph of Staphylococcus aureus. ATCC 6538

图3 大肠埃希氏菌ATCC 25922 Bland-Altman图

Fig.3 Bland-Altman diagram of Escherichia coli. ATCC25922

图4 金黄色葡萄球菌ATCC 6538 Bland-Altman图

Fig.4 Brand-Altman diagram of Staphylococcus aureus. ATCC 6538

图5 大肠埃希氏菌ATCC 25922准确度图

Fig.5 Accuracy chart of Escherichia coli. ATCC 25922

图6 金黄色葡萄球菌ATCC 6538准确度图

Fig.6 Accuracy chart of Staphylococcus aureus. ATCC 6538

图7 CQ与GB的包容性结果

Fig.7 Inclusive results of CQ and GB