俞保圣 许佳 石泉 周勇 叶向光

摘 要 为了解安徽口岸入境人员疟疾流行情况，本研究对2023年来自非洲和东南亚等疟疾流行国家和地区的重点入境人员进行主动监测，运用快速诊断试剂检测（Rapid Diagnostic Reagent Test，RDT）、镜检及荧光定量PCR等方法进行联合检测分析。结果表明：在780例入境人员中共检测出3例疟疾样本，其中1例显示RDT阳性，镜检为恶性疟；2例显示RDT阳性，镜检均为阴性，但荧光定量PCR检测均为阳性，结合临床症状和流行病学史分析，3例均感染疟疾。多种疟疾检测方法的联合应用，可以避免单一检测方法产生的假阴性结果，及时发现输入性病例，有效防止我国疟疾输入再传播，充分发挥海关守护国门安全的职责和使命。

关键词 疟疾；入境人员；镜检；快速诊断试剂检测；荧光定量PCR

Combined Application of Multiple Testing Methods in Malaria Surveillance of Individuals Entering Anhui Province

YU Bao -S heng ¹ XU Jia ¹ SHI Quan ¹ ZHOU Yong ² YE Xiang-Guang ^1*

Abstract To assess the prevalence of malaria among individuals entering Anhui Province, this study conducted proactive surveillance in 2023 on key entrants from malaria-endemic regions such as Africa and Southeast Asia. A combination of rapid diagnostic reagent testing (RDT), microscopic examination and fluorescence quantitative PCR was employed for analysis. The results revealed that a total of 3 malaria samples were detected out of 780 entrants, among which 1 case was RDT-positive with microscopic examination confirming falciparum malaria; and 2 cases were RDT-positive with negative microscopic results, but positive fluorescence quantitative PCR results. Combined with clinical symptoms and epidemiological investigation, all three cases were confirmed as malaria infection. The joint application of multiple malaria detection methods helps avoid false-negative results generated by a single test method, ensures timely detection of imported cases, effectively preventing the re-transmission of imported malaria in China, and reinforces the vital role of the Customs in safeguarding national health security.

Keywords malaria; entry personnel; microscopic examination; rapid diagnostic reagent test (RDT); fluorescence quantitative PCR

基金项目：海关总署科研项目（2022HK090）

第一作者：俞保圣（1983—），男，汉族，安徽合肥人，本科，主管技师，主要从事口岸传染病检测工作，E-mail: yubs2004@sina.com

通信作者：叶向光（1968—），男，汉族，安徽安庆人，硕士，主任医师，主要从事口岸传染病防治工作，E-mail: yexiangguang@163.com

1. 安徽国际旅行卫生保健中心（合肥海关口岸门诊部） 合肥 230000

2. 合肥海关 合肥 230000

1. Anhui International Travel Health Care Center (Hefei Customs Port Clinic), Hefei 230000

2. Hefei Customs, Hefei 230000

疟疾是经携带有疟原虫的雌性按蚊叮咬传播的虫媒传染病，也是世界上严重危害人类生命健康的传染病之一，至今仍在全球威胁着数亿人的生命安全^[1-2]。引起人类疟疾的疟原虫有恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫。在我国常见是恶性疟和间日疟，其他3种少见。感染后主要出现寒战、高热、多汗、肌肉酸痛和乏力等症状，经过一定的潜伏期后，症状会反复出现，长期多次发作后，易引起贫血和脾肿大，严重时会引起癫痫、昏迷、急性肾功能衰竭，甚至导致死亡。2021年6月30日世界卫生组织（WHO）经论证评估宣布中国实现消除疟疾^[3-4]。随着国际间的合作交流日益频繁，国际旅行入境人员增加，我国每年有数千例境外输入病例^[5-6]，防止疟疾输入再传播成为我国消除疟疾后的长期工作任务。本研究通过联合应用快速诊断试剂检测（Rapid Diagnostic Reagent Test，RDT）、镜检及荧光定量PCR等多种检测方法对2023年安徽口岸入境人员疟疾情况进行监测，为海关及时准确发现输入性病例及建立有效的疟疾监测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源

2023年1—12月，采集来自非洲和东南亚等疟疾流行地区的重点入境人员的EDTA-抗凝血2 mL/人。这些重点入境人员共计780人，其中男性394人，女性386人，最小年龄16岁，最大年龄62岁，16～35岁人员约占总数的90%，主要来自柬埔寨、老挝、越南、印度、牙买加、摩洛哥等47个国家。

1.1.2 试剂和仪器

恶性疟原虫/间日疟原虫检测试剂盒（胶体金法，蓝十字生物药业（北京）有限公司）；疟原虫核酸检测试剂盒（荧光PCR法，上海之江生物科技股份有限公司）。Axio scope 5光学显微镜（蔡司科技（苏州）有限公司）；Quantstudio 6荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.2 检测方法

1.2.1 快速诊断试剂检测

将采集的抗凝血用恶性疟原虫/间日疟原虫检测试剂盒（胶体金法）进行初筛^[7]，向试剂加样孔中直接加入5 µL全血样本，再滴加3～4滴样本稀释液，15 min后判读结果，超过30 min结果无效。按说明书进行结果判别：在C质控阳性的同时，T1阳性为恶性疟感染，T2阳性为间日疟感染，T1+T2阳性为恶性疟和间日疟的混合感染；只有C质控阳性为阴性。

1.2.2 血涂片制作与镜检

（1）薄血膜的制作。取2 µL RDT初筛阳性的抗凝血样本滴于载玻片上，随后手持推片并使推片的下缘平抵于载玻片，推片与载玻片成30°夹角，此时载玻片与推片之间的血液向两边扩散，当血液扩散至约2 cm时，自右向左迅速推成像舌条状的薄血膜。

（2） 血涂片染色。在经过充分干燥固定过的薄血膜上滴加新配制的3%吉氏染液，均匀覆盖整个血膜，静置染色30 min后，用缓慢流水冲净（切勿先倒掉染液），自然晾干。

（3）镜检。加香柏油1滴于染色后的血涂片上，然后用普通光学显微镜调至10×目镜和100×油镜进行检查，若镜检阳性并判断出相应虫种，直接确诊该种疟原虫感染。

1.2.3 荧光定量PCR检测

（1）疟原虫DNA的提取。对于RDT初筛阳性，但镜检阴性的样本进行疟原虫DNA提取，参照疟原虫核酸测定试剂盒（荧光PCR法）说明书要求，对全血样本进行核酸裂解处理，提取核酸-20℃保存备用。

（2）荧光定量PCR。按照疟原虫核酸测定试剂盒（荧光PCR法）说明书，对提取的样本核酸进行疟原虫实时荧光定量PCR检测。反应体系40 µL，循环参数设置为37℃ 2 min；94℃ 2 min；93℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环，60℃单点荧光检测，用试剂盒中的阴性和阳性标准品分别设置阴性对照和阳性对照，当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性，样本核酸扩增曲线呈近似S形时，且Ct值≤38，判断为阳性。

2 检测结果

疟疾实验室检测流程如图1所示。

图1 实验室检测流程

Fig.1 Laboratory Testing Process

2.1 人员基本情况

病例A为男性，55岁，归国劳务人员，合肥人，曾在安哥拉务工5年，其间有与疟疾患者接触史及蚊虫叮咬史。病例B为男性，27岁，外籍留学生，一直在塞拉利昂生活、学习，有蚊虫叮咬史及疟疾病史。病例C为男性，49岁，归国劳务人员，合肥人，曾在几内亚工作1年，其间有与疟疾患者接触史和蚊虫叮咬史，并有过2次疟疾发病史，在当地进行青蒿素治疗后症状缓解。

2.2 实验室检测结果

2.2.1 病例A

病例A自上海浦东国际机场入境后自觉头痛、关节肌肉酸痛、反复发烧（39℃左右）1天，并伴乏力2天，通过海关与地方多部门联合的出入境人员传染病后续监管机制，于2023年1月9日在安徽国际旅行卫生保健中心（合肥海关口岸门诊部）（以下简称“安徽国际旅行卫生保健中心”）进行疟疾检测，其RDT结果为T1阳性，根据试剂盒说明书判断为恶性疟阳性（图2）。由于RDT方法的局限性，其结果不能作为确证结果，还需要进一步检测确证分析。经血涂片染色镜检，薄血膜镜下可见寄生在红细胞中的疟原虫小滋养体（环状体），被寄生红细胞大小正常，未见被寄生的红细胞胀大（间日疟）、卵圆形或边缘呈伞矢状（卵形疟）等，小环状体较小，约占红细胞直径的1/6，环纤细，浅蓝色，核较小多为1个，可见多个正常大小的红细胞内寄生1个小滋养体，核为2个，胞质纤细，虫体呈“耳机状”（恶性疟典型特征），虫体大多位于红细胞的边缘，根据以上形态特征镜检鉴别为恶性疟阳性（图3）。由于疟原虫镜检为检查疟原虫的“金标准”，镜检阳性可直接确诊并上报，无须进一步荧光定量PCR检测分析。结合流行病学史、临床表现及实验室检测结果，诊断为恶性疟确诊病例。

图2 病例A的快速诊断试剂检测结果

Fig.2 RDT results of Case A

图3 病例A的血涂片镜检结果（吉姆萨染色，×1000）

Fig.3 Results of blood film microscopic examination of Case A (Giemsa staining,×1000)

2.2.2 病例B

病例B于2023年9月26日由上海浦东国际机场入境，当日乘高铁至合肥入住某高校宿舍，27日来安徽国际旅行卫生保健中心进行传染病监测体检，同时接受疟疾免费检测，其RDT结果为T1阳性，根据试剂盒说明书判断为恶性疟阳性（图4），其结果同样需进一步检测确证分析。但血涂片染色镜检结果为阴性（图5），其结果尚不能确诊，不可直接上报，需要运用一种疟原虫检出限更低、检测灵敏度和特异性更高的分子生物学技术方法进一步检测确证分析，后经过实时荧光定量PCR检测，Ct值为29.46，判断为疟原虫核酸检测阳性（图6）。患者无自觉症状，否认任何不适主诉，结合流行病学史及实验室检测结果，综合诊断为疟疾无症状感染者。

2.2.3 病例C

病例C于2023年9月28日由北京首都国际机场入境，通过海关与地方多部门联合的出入境人员传染病后续监管机制，于10月11日在安徽国际旅行卫生保健中心进行疟疾检测，其RDT结果为T1阳性，根据试剂盒说明书判断为恶性疟阳性（图7），其结果同样需进一步检测确证分析，但经血涂片染色镜检结果也为阴性（图8），同上，后经过实时荧光定量PCR检测，Ct值为29.08，判断为疟原虫核酸检测阳性（图9）。患者无自觉症状，否认任何不适主诉，结合流行病学史及实验室检测结果，综合诊断为疟疾无症状感染者。

实验检测的定性结果资料以绝对数表示，比较采用McNemar卡方检验，双侧p≤0.05为有统计学意义。经检验，780人中镜检阳性1例和RDT阳性3例，两组间差异无统计学意义（p = 0.500）。

2.3 处置措施

以上阳性病例确诊后，安徽国际旅行卫生保健中心立即通过海关业务系统逐级上报。另外，通过疟疾专报系统上报国家寄生虫病防治信息管理系统，同时通知地方疾控部门将患者转至相关医疗机构进行系统治疗。相关人员信息见表1。

3 讨论

虽然我国已实现了消除疟疾的目标，但随着国际贸易合作的日益频繁，近年来往返非洲和东南亚等疟疾高风险地区和国家的航班逐年增加^[8]，导致我国仍然存在疟疾输入再传播风险^[9]。因此，海关不仅要建立健全多部门合作的联防联控机制，还应加强口岸疟疾传染病监测体系，建立有效的疟疾监测方法，采用多种检测方法联合应用，从而进一步加强我国的疟疾防治成效。

随着全球防治疟疾进程的不断推进，越来越多的国家共同面临着消除疟疾方面的一个主要困难，就是如何运用新技术和新策略，及时准确发现所有的疟疾感染病例，尤其是病例中的无症状感染者，并将其妥善处置^[10]。目前，疟疾无症状感染者在国际上被定义为：通过检测发现已感染疟原虫，却没有发热（腋下体温正常＜37.5℃），同时也没有其他疟疾相关临床症状的人^[11]。疟疾无症状感染者通常又被人们认为是一种“沉默”的疟疾病例^[12]，因为其体内也寄生有疟原虫的配子体^[13]，会导致疟疾的传播，同样具有传染性。在部分疟疾流行的国家或地区，疟疾无症状感染者的存在是疟疾持续传播的主要原因之一，在疟疾的传播和流行过程中具有重要作用^[14-16]。

无症状感染者的发现主要取决于检测方法。目前，临床上检测疟疾的方法主要有传统的血涂片镜检法、RDT法和分子生物学技术（PCR）等^[17]，镜检法其优点是对设备要求低、能快速检测并能进行分型，全世界广泛使用且被认为是“金标准”^[18]。但缺点是对人员专业能力要求高，特别是疟原虫密度低和服用抗疟药物时，容易漏诊或误诊^[19]。RDT法的优点是简单快速，对人员和设备要求低，多项研究表明，RDT已具有较高的特异性和灵敏度，在基层疟疾检测中更具优势^[20]，有望替代镜检。其缺点是能同时检测4种疟原虫的试剂盒较少，其他试剂盒主要针对间日疟和恶性疟，不能覆盖所有疟疾类型。分子生物学技术主要有普通PCR、实时荧光定量PCR、巢式PCR等。普通PCR检测特异性、敏感性优于镜检，可鉴别虫种，还可用于抗药性相关检测，但其缺点是费用较高，检测时间较长，需要专业仪器设备和试剂，技术要求较高，不能用于原虫密度定量。实时荧光定量PCR与血涂片镜检法和RDT相比，其疟原虫检出限更低，检测灵敏度和特异性都很高，现在国际上通常将其作为监测、发现疟疾无症状感染者的有效手段^[21]，可对疟原虫进行定量分析，检测时长优于普通PCR，还用于疟疾后续治疗效果的评估，缺点是对操作人员的技术要求和对仪器设备要求较高。巢式PCR可对疟原虫作出分型鉴定，但因其费时费力，对实验室人员技术水平、仪器设备、试剂耗材等各方面要求比较高^[22]，该方法仅适合有条件的实验室开展，目前较难推广。因此，使用RDT对入境重点人员进行快筛，阳性样本再分别进行血涂片镜检和实时荧光定量PCR检测，将这3种检测方法在入境人员疟疾监测中进行联合应用^[23]，作为海关监测疟疾传染病的手段，可以及时发现疟疾传染源，防止境外疟疾输入国内，做到了“及时发现，精准阻传”。

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图5 病例B的血涂片镜检结果（吉姆萨染色，×1000）

Fig.5 Results of blood film microscopic examination of Case B (Giemsa staining,×1000)

图4 病例B的快速诊断试剂检测结果

Fig.4 RDT results of Case B

1: 阳性对照; 2: 血液样本; 3: 阴性对照

图6 实时荧光定量PCR检测结果

Fig.6 Results of real-time fluorescence quantitative PCR detection of Case B

图7 病例C的快速诊断试剂检测结果

Fig.7 RDT results of Case C

图8 病例C的血涂片镜检结果（吉姆萨染色，×1000）

Fig.8 Results of blood film microscopic examination of Case C (Giemsa staining,×1000)

1: 阳性对照; 2: 血液样本; 3: 阴性对照

图9 病例C的实时荧光定量PCR检测结果

Fig.9 Results of real-time fluorescence quantitative PCR detection of Case C

表1 重点入境人员信息表

Table 1 Information Sheet on Priority Entrants