吴巧维 王潇伦 金园园 周丹虹 袁天虎 劳华均

摘 要 本研究针对传统的15 d传代方法，改用7 d石蜡保存法和甘油肉汤保存法，探索适合莱士曼氏乳酸杆菌传代培养方法。通过长期实验验证，分析标准曲线和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD），得到这两种方法标准曲线线性关系r²均＞0.99，相对标准偏差RSD分别为2.5%～3.7%和2.9%～7.2%。证实了用7 d石蜡保存法、甘油肉汤保存法这两种方法保存的莱士曼氏乳酸杆菌活性稳定，活化周期短，可满足维生素B₁₂检测要求。

关键词 微生物法；维生素B₁₂；莱士曼氏乳酸杆菌；保存方法

Study on Suitable Subculture Methods

of Lactobacillus leishmannii

WU Qiao-Wei¹ WANG Xiao-Lun¹ JIN Yuan-Yuan¹ ZHOU Dan-Hong¹

YUAN Tian-Hu¹ LAO Hua-Jun^2*

Abstract In this study, the traditional method of 15-day passage method was changed to 7-day passage method with liquid paraffin and glycerin broth preservation method to explore a suitable subculture method of Lactobacillus leishmannii. The standard curve and the relative standard deviation (RSD) of these two methods were analyzed through long-term experimental verification. The results showed that these two methods standard curve linear relationship r² was＞0.99, and the RSD were 2.5%-3.7% and 2.9%-7.2%, respectively. This study proved that Lactobacillus leishmannii saved by the 7-day passage method with liquid paraffin and the glycerin broth preservation method had stable activity and short activation period, which can meet the requirement of vitamin B₁₂ detection.

Keywords microbial method; vitamin B₁₂; Lactobacillus leishmannii; preservation method

维生素B₁₂是人体必需的维生素之一^[1-2]，是婴幼儿食品和乳品中重要营养成分之一^[3-7]。目前GB 5009.285—2022《食品安全国家标准 食品中维生素B₁₂的测定》中的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱-质谱法和微生物法^[8]。相较于其他方法，微生物法可灵敏检测出样品中具有生物活性的维生素B₁₂总量。美国公职分析化学家协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）也将微生物法作为维生素B₁₂检测的首选方法和仲裁方法。但微生物法不稳定因素较多、操作步骤繁琐、实验周期长，其中莱士曼氏乳酸杆菌的纯化和活性是实验关键。传统的每15天转种1次的连续传代保存方式不能保证活性，易引入杂菌。另外，冷藏的菌株活化制备菌悬液过程需耗时3～4 d，也会对检测周期产生一定的影响^[9]。

本研究根据现有的一些菌株保存和传代方式，参考刘萍等^[10]对莱士曼氏乳酸杆菌生长特性的研究、李全霞等^[11]研究所证实的用甘油冷冻保存菌株的方法，以及黄进丽等^[12]对维生素B₁₂接种液制备方法的优化，寻求适合莱士曼氏乳酸杆菌保存的新方法，确保菌株无污染、性能稳定且可长期保存，能被快速活化用于检测，缩短检测周期。

1 材料

1.1 标准菌株

莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）ATCC7830，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。

1.2 实验试剂

乳酸杆菌肉汤培养基（美国BD公司）；乳酸杆菌琼脂培养基（美国BD公司）；维生素B₁₂测定用培养基（北京陆桥技术股份有限公司）。

维生素B₁₂标准品（纯度98.1%）（TMstandard）；无水偏重亚硫酸钠、一水合柠檬酸、无水磷酸氢二钠、甘油（100%）、石蜡（分析纯）（国药集团化学试剂有限公司）。

60%甘油水：60 g甘油加水至100 mL，混匀121℃灭菌15 min。

1.3 实验样品

质控样：中国检验检疫科学研究院测试评价中心（批号：QC-IP-741）；

市售婴幼儿配方乳粉：（1）婴儿配方奶粉1段；（2）婴儿配方奶粉2段。

1.4 实验仪器与设备

SQP万分之一天平（赛多利斯科学仪器上海有限公司）；FE 20 pH计（梅特勒-托利多公司）；UV-3210紫外可见分光光度计（上海凌析仪器有限公司）；高速冷冻离心机（赛默飞中国有限公司）；Vortex Genie2漩涡振荡器（美国SI公司）；GR85DRL高压蒸汽灭菌锅（厦门致微仪器有限公司）；36℃恒温培养房。

2 实验方法

2.1 标准菌株活化时间

将莱士曼氏乳酸杆菌的冻干菌株活化后，接种到乳酸杆菌琼脂培养基，36℃培养18 ～24 h。继续转种2～3代增加活力。将活化后的菌株接种到3管30 mL乳酸杆菌肉汤培养基中，36℃培养。在培养8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h后，以不接种乳酸杆菌肉汤培养基为空白管，550 nm下测定接种试管的吸光度，记录不同培养时间下莱士曼氏乳酸杆菌的生长浓度，选择适宜的活化时间。

2.2 4种菌株保存方法

2.2.1 定期传代法

使用第4代菌株作为工作菌株，A组每14天、B组每7天用接种针将莱士曼氏乳酸杆菌固体穿刺至乳酸杆菌琼脂培养基，每组3平行，36℃培养18～24 h，置2～8℃冰箱保存备用。

2.2.2 石蜡保存法

使用第4代菌株作为工作菌株，A组每14天、B组每7天用接种针将莱士曼氏乳酸杆菌固体穿刺至乳酸杆菌琼脂培养基，滴加2～3 mL灭菌石蜡，使试管中石蜡液面高度到达1 mL，每组3平行，36℃培养18～24 h，置2～8℃冰箱保存备用。

2.2.3 甘油肉汤保存法

将活化后的莱士曼氏乳酸杆菌接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，36℃培养18～24 h。将菌液与60%无菌甘油水按体积1∶1比例充分混匀，分装多支小离心管，每管0.5 mL，置于-80℃低温冰箱保存。

2.2.4 瓷珠保存法

将活化后的莱士曼氏乳酸杆菌接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，36℃培养18～24 h。以2000 r/min离心5 min，弃去上清液，刮取底下菌株加入瓷珠菌种保存管中，充分震荡混合均匀，用无菌吸管吸去溶液，置-80℃超低温冰箱保存。

2.3 透光率值换算浊度值

将活化好的菌液2000 r/min离心5 min，弃去上清液，加10 mL无菌生理盐水，混匀，重复洗涤3次。用分光光度计，以9 g/L氯化钠溶液做空白，于550 nm波长下将洗涤后的菌液按照80%、75%、70%、65%、60%的透光率调成测试菌液，并用浊度计分别测试对应的浊度值，换算成相应浊度范围。

2.4 质控样及市售奶粉样测试及分析

购买质控样和2种市售奶粉样，低温保存，定期取样，制备标准曲线与样品待测液系列，接种按照适宜方法活化的菌株制成的菌悬液。标准曲线的配制、样品前处理、后续培养和测定分析按照GB 5009.285—2022中第三法微生物法规定的进行。

3 结果

3.1 适宜培养时间

以菌株培养时间为横坐标，对应时间下测得的吸光度值为纵坐标，绘制莱士曼氏乳酸杆菌的生长曲线，如图1所示。由图可知，当培养时间在8～10 h时，吸光度值变化较小，菌株生长迟缓；当培养时间在10～16 h时，吸光度值变化较明显，菌株进入对数生长期；在16～18 h时，其吸光度值变化极小，菌株进入稳定期；18 h时试管内菌株开始沉淀。这说明按照标准要求的连续传代2～3次再活化的新鲜菌株，可以最快在16 h时达到稳定期，此时活菌数多且活力强。

3.2 保存方法比较

按照2.2.1、2.2.2传代的菌株，在传代时同时接种一管乳酸杆菌肉汤培养基，36℃培养。在培养16 h、18 h、20 h、22 h、24 h后，以不接种乳酸杆菌肉汤培养基为空白管，550 nm下测定并记录不同培养时间的吸光度值，统计15代内每组菌到达稳定期时间（菌株未在24 h内到达稳定期即不在继续传代）。由表1可知，定期传代法A组分别在传代3次、4次、4次后失活，B组分别在传代10次、5次、9次后失活；石蜡保存法A组其中一组保持活性传至15代，另两组在传代9次、7次后失活；石蜡保存法B组3组都传至15代，且活性较强，菌株都在22 h前到达稳定期。结果证明，每7天将莱士曼氏乳酸杆菌固体穿刺传代一次，封上石蜡，即可在这7天内直接转接乳酸杆菌肉汤活化用作菌悬液，无须传代2～3次。

按照2.2.3、2.2.4传代的菌株，以14 d为一周期进行一次活化。甘油肉汤保存法每次取出3管，各取一环分别接种1管乳酸杆菌肉汤培养基；瓷珠保存法每次取出3颗分别放入3管乳酸杆菌肉汤培养基。36℃培养，记录每组菌到达稳定期时间。由表2可知，甘油肉汤保存的菌株在24次活化期间，3组平行均能在18 h前达到稳定期；瓷珠保存的菌株从第16次活化期开始，到达稳定期时间从18 h到超过24 h变化较大，活性不稳定。结果证明，甘油肉汤保存法保存的莱士曼氏乳酸杆菌相对于瓷珠保存活性更稳定。

本实验证明，每7天转种1次的石蜡保存法和甘油肉汤保存法均能保证莱士曼氏乳酸杆菌活性，且保存周期长，适合实验室保存和使用莱士曼氏乳酸杆菌。

3.3 透光率换算浊度值

由于本实验室紫外分光分度计未配置在无菌环境中，调配适宜透光率范围的测试菌株不便，因此利用浊度计测量合适透光率范围内的菌悬液，便于在无菌环境下操作，避免污染。所测浊度值如表3所示，透光率60%～80%的测试菌液对应的浊度值为0.35～0.93。

表3 菌悬液透光率对应浊度值

Table 3 The light transmittance of bacterial suspension

corresponding to the turbidity value

3.4 质控样及市售奶粉样测试结果分析

每7天取样，制备标准曲线和样品待测液系列，接种7 d石蜡保存法活化的菌悬液；每14天取样，制备标准曲线和样品待测液系列，接种甘油肉汤保存法活化的菌悬液。按照GB 5009.285—2022中第三法微生物法规定培养、检测。汇总一年内维生素B₁₂标准曲线（4次函数拟合）相关系数r²和样品维生素B₁₂检测值，如表4—7所示。

表4 7 d石蜡保存菌株不同保存时间段标准曲线相关系数r²

Table 4 Correlation coefficient r² of standard curve for different storage periods of the 7-day passage method with liquid paraffin

从表4、表5数据可知，使用7 d石蜡保存法在传代15代内活化的莱士曼氏乳酸杆菌和使用甘油肉汤保存法在一年内活化的莱士曼氏乳酸杆菌，测得的维生素B₁₂标准曲线相关系数r²均＞0.99，曲线拟合良好，符合GB/T 27404中附录F.2标准曲线检测要求。

统计表6、表7数据可知，使用7 d石蜡保存法保存的15代内的菌株和使用甘油肉汤保存法保存的一年内的菌株测得的质控样、奶粉1、奶粉2的维生素B₁₂的RSD值分别为2.5%、2.9%、3.7%和2.9%、4.2%、7.2%。表明两种方法重复性良好，按照这两种方法保存活化的菌悬液，适用检测一般的奶粉样品。另外，两组质控样检测结果均在给定的范围值5.09(4.16-6.02) μg/100g内，符合实验质控要求。

表5 甘油肉汤保存菌株不同保存时间段标准曲线相关系数r²

Table 5 Correlation coefficient r² of standard curve for different storage periods of the glycerin broth preservation method

4 讨论

本研究主要采用GB 5009.285—2022中的微生物法对婴幼儿奶粉样品进行检测。其中，莱士曼氏乳酸杆菌的保存和活性是实验关键点。本实验改良了传统的每15天转种一次的连续传代保存方式，使用7 d石蜡保存法和甘油肉汤保存法，不仅保证了菌株活性，还缩短了前期实验准备时间，对实验室工作运行起到了积极作用。

本实验证明，两种优化后的保存方法在保证实验可靠和结果准确度的前提下，将原本需要3～4 d活化制备菌悬液的时间缩短至1 d，检测周期也由4～5 d缩减至2 d，大大提高了实际工作效率。其中，甘油肉汤保存法保存的菌株，经过检验后能保证同一批次的菌株纯度和活性，保存有效期超过一年，但需使用-80℃超低温冰箱，每次取用菌株过程手续较为繁琐，对实验室也要求更高。7 d石蜡保存法只需用到2～8℃冰箱和灭菌石蜡，适合更多实验室推广和使用，但每次传代后菌株的生长存在一定偏差，菌株纯度和活性不能保证。两种方法相对于传统保存方法利大于弊，二者结合使用可以满足大多数实验室对莱士曼氏乳酸杆菌的保存活化要求，未来也适合在有维生素B₁₂检测需求的领域继续推广使用。

参考文献

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基金项目：宁波中盛产品检测有限公司科研项目（2022ZS003）

第一作者：吴巧维（1990—），女，汉族，浙江宁波人，本科，工程师，主要从事食品微生物检测，E-mail: 1358734886@qq.com

通信作者：劳华均（1968—），男，汉族，浙江宁波人，本科，高级工程师，主要从事食品微生物检测，E-mail: laohuajun@customs.gov.cn

1. 宁波中盛产品检测有限公司 宁波 315012

2. 宁波海关技术中心 宁波 315012

1. Ningbo Joysun Product Testing Service Company, Ningbo 315012

2. Technology Center of Ningbo Customs, Ningbo 315012

图1 不同培养时间菌液吸光度值

Fig.1 The absorbance value of the bacterial solution at different culture time

表1 定期传代法和石蜡保存法菌株到达稳定期时间（h）

Table 1 Time when the strains reached the stable period by regular passage method and paraffin preservation method (h)

注: “＞24”表示24 h时菌株未到达稳定期; “-”表示24 h时肉汤无肉眼可见浑浊, 判断为菌株失活.

表2 甘油肉汤保存法和瓷珠保存法菌株到达稳定期时间（h）

Table 2 Time when the strains reached the stable period by glycerin broth preservation method and porcelain beads

preservation method (h)

注: “＞24”表示24 h时菌株未到达稳定期; “-”表示24 h时肉汤无肉眼可见浑浊,判断为菌株失活.

表6 7 d石蜡保存法菌株检测样品维生素B₁₂含量（μg/100g）

Table 6 Content of vitamin B₁₂ in samples determined by strain of the 7-day passage method with liquid paraffin (μg/100g)

表7 甘油肉汤保存法菌株检测样品维生素B₁₂含量（μg/100g）

Table 7 Content of vitamin B₁₂ was determined by strain of the glycerin broth preservation

method (μg/100g)