王红 李晓宾 李君萍 程小兰 滕新栋

王 红 ¹ 李晓宾 ^{1 *} 李君萍 ¹ 程小兰 ² 滕新栋 ³

摘 要 本文评估了FTA卡（Flinders Technology Associates，FTA）在呼吸道样本保存中的实际应用。通过分别采用常规口咽拭子采样管和FTA卡收集呼吸道样本各40例，利用实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qPCR）检测相关呼吸道病原体，将FTA卡置于4℃、20℃（常温）、37℃环境下保存72 h、168 h、336 h、672 h，比较不同环境条件下病原体核酸平均循环阈值（Cycling threshold，Ct）。实验结果显示，检出12例阳性呼吸道相关病原体，FTA卡样本与口咽拭子采样管的检测结果一致，差异无统计学意义；对于肺炎链球菌和流感嗜血杆菌，同未保存FTA卡样本的Ct值比较，4℃和常温保存672 h以上会引起Ct值明显升高，37℃保存168 h以上会引起Ct值明显升高；对于鼻病毒、冠状病毒-229E、偏肺病毒和甲型流感病毒，同未保存FTA卡样本的Ct值比较，4℃ 336 h以上会引起Ct值明显升高，常温保存168 h会引起Ct值明显升高，37℃保存72 h以上会引起Ct值明显升高，且对于鼻病毒、冠状病毒-229E、偏肺病毒，37℃保存672 h后，未检测到阳性信号。结果表明，FTA卡作为一种呼吸道样本的采集方式，将其常温保存336 h后，不影响病原体的qPCR结果，但应尽可能降低保存温度、缩短保存时间，以免影响后续实验结果。

关键词 qPCR；呼吸道样本；口咽拭子；FTA卡

Study on the Impact of FTA Cards on Preserving Respiratory Samples

WANG Hong ¹ LI Xiao-Bin ^1* LI Jun-Ping ¹ CHENG Xiao-Lan ² TENG Xin-Dong ³

Abstract This paper evaluated the practical application of FTA (Flinders Technology Associates) cards in respiratory tract sample preservation. 40 respiratory tract samples were collected with conventional oropharyngeal swab tubes and FTA cards respectively. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) was used to detect related respiratory pathogens. The FTA cards were stored at 4℃, normal temperature (20℃), 37℃ for 72 h, 168 h, 336 h, 672 h, and the Cycling threshold (Ct) values of pathogen nucleic acid under different environmental conditions were compared. 12 patients were found to be positive for respiratory tract related pathogens. The results of FTA card samples were consistent with those of oropharyngeal swabs, and the difference was not statistically significant. For Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae samples, compared with those from samples not preserved on FTA cards, the Ct values were significantly increased when stored at 4℃ and normal temperature for more than 672 hours, and when stored at 37℃ for more than 168 hours. For rhinovirus, coronavirus-229E, metapneumovirus and influenza A virus, compared with those from samples not preserved on FTA cards, the Ct values increased significantly when stored at 4℃ for 336 h, 168 h at room temperature, and 72 h at 37℃. For rhinovirus, coronavirus-229E and metapneumovirus, no positive signal was detected after storage at 37℃ for 672h. As a respiratory tract sample collection method, FTA cards can be stored at room temperature for 336 h without affecting the pathogen qPCR results, but the storage temperature should be reduced as much as possible to shorten the storage time, so as not to affect the subsequent experimental results.

Keywords qPCR; respiratory tract samples; oropharyngeal swabs; FTA cards

第一作者：王红（1966—），女，汉族，山西晋中人，本科，副主任技师，主要从事口岸卫生检疫工作及传染病检测技术研究，E-mail: wanghongall@163.com

通信作者：李晓宾（1987—），男，汉族，山西高平人，硕士，主管技师，主要从事口岸卫生检疫工作及传染病防控研究，E-mail: 460513480@qq.com

1. 山西国际旅行卫生保健中心（太原海关口岸门诊部） 太原 030021

2. 大连国际旅行卫生保健中心（大连海关口岸门诊部） 沈阳 116007

3. 青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部） 青岛 266073

1. Shanxi International Travel Health Care Center (Taiyuan Customs Port Clinic), Taiyuan 030021

2. Dalian International Travel Health Care Center (Dalian Customs Port Clinic), Shenyang 116007

3. Qingdao International Travel Health Care Center (Qingdao Customs Port Clinic), Qingdao 266073

呼吸道感染是临床常见疾病之一，其发病率和死亡率常年居高不下^[1]。80%以上的呼吸道感染疾病是由非细菌性病原体引起，其中流感病毒、肺炎支原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒较为常见^[2-3]。咽拭子是呼吸道感染最常见的标本，是利用咽拭子采样器从患者咽部和扁桃体取出分泌物进行病毒、细菌、真菌等病原体检测，并可根据检测结果指导临床诊断和治疗。目前，分子生物学检测已经逐渐成为呼吸道病原学诊断的主流方法，如何能够科学有效地进行样本保存和运输对于后续检测至关重要^[2]。

FTA卡含有独特的化学物质，当样品吸附在卡上时，细胞膜和细胞器被裂解，蛋白质变性，释放出的核酸被捕获在FTA卡纤维上，可免受核酸酶、氧化剂和紫外线损伤，为室温下采集、运输和储存样本提供了稳妥、安全、可靠的方法。研究表明FTA卡上采集血液、唾液等样本后，DNA被收集下来且不易被降解，可以在室温下稳定保存多年^[4]。目前FTA卡已应用到法医学人类身份鉴定、基因组学研究、药物研发、畜牧业、植物学等领域^[5]，但FTA卡在不同温度下保存呼吸道样本的研究资料还较为欠缺，因此本研究主要致力于温度和时间对于FTA卡保存呼吸道样本的研究，以期为在口岸应用FTA卡采样提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

收集自2023年12月—2024年3月在某社区医院门诊就诊病人的口咽拭子和FTA卡样本各40例，共80份样本，包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、流感病毒、鼻病毒等病原体阳性标本12例，其余标本为阴性标本。

1.2 试剂与仪器

核酸提取或纯化试剂（江苏硕世生物科技公司）；一次性使用病毒采样管（太原十亿科技有限公司）；一次性使用采样器（太原十亿科技有限公司）；FTA卡（Whatman公司）；ABI QuantStudio7Flex荧光PCR仪（美国ABI公司）；甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂及21种呼吸道病原体核酸检测试剂盒（江苏硕世生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集

口咽拭子的采集：用一次性采样器擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁各3次，将拭子头浸入病毒保存液采样液中，尾部弃去，旋紧采样管螺旋口。

FTA卡采集：用一次性采样器擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁各3次，将一次性拭子置于1.5 mL 0.9%的生理盐水中；在生物安全柜中，取出FTA卡，标记采样编号、采样日期、姓名等信息；取上述150 µL液体滴入FTA卡圆形区域中央，室温干燥2 h后，将卡置于真空密封带中。

1.3.2 FTA卡的预处理

将含有样本的FTA卡置于垫板上，使用打孔器在FTA卡上打下12个直径为6 mm的圆片，将每个圆片单独置于0.2 mL无RNA酶离心管内，分别储存于4℃、20℃（常温）、37℃环境下，每个温度分别保存72 h、168 h、336 h、672 h。

1.3.3 核酸提取

口咽拭子样本核酸提取按照核酸提取或纯化试剂（磁珠法）试剂盒步骤操作；FTA卡样本无需提取核酸，FTA卡直接用于后续实验。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测

口咽拭子和FTA卡样本采集完毕后，立即同步进行PCR检测，用14种呼吸道病原体核酸检测试剂盒检测，在ABI QuantStudio 7实时荧光定量PCR仪上进行qPCR实验，按照试剂盒说明书进行操作，实验重复3次，取平均循环阈值（Cycling threshold，Ct）进行统计分析；将阳性样本的FTA卡在4℃、20℃（常温）、37℃环境条件下，分别保存3天、7天、3周、4周，后进行qPCR 实验,每次实验做2个复孔，取平均Ct值。

1.3.5 核酸检测结果的判断

当出现典型的S型曲线，且Ct值≤42时，判断为阳性；当42≤Ct值≤45时，判断为可疑，建议复测，若42≤Ct值≤45或者Ct值≤42，则判断为阳性；当Ct值≥45时判断为阴性。

1.3.6 数据处理

将收集的数据用软件SPSS 21.0进行分析，每组样本Ct值用均值±标准差表示，以p＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 口咽拭子保存液和FTA卡Ct 值的比较

40例样本中检出呼吸道病原体阳性样本12例，其余样本为阴性样本，阳性样本的感染病原体、核酸类型、口咽拭子Ct值以及FTA卡Ct值等基本信息见表1，结果显示口咽拭子和FTA卡Ct 值比较差异无统计学意义；另外28例样本的结果见表2，结果显示FTA卡与口咽拭子样本的检测结果无差异。

2.2 4℃环境不同保存时间对FTA卡样本Ct 值的影响

12份阳性FTA卡样本储存在4℃环境下，经过不同时间的Ct值的变化见表3。结果显示肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌在336 h以内不会引起Ct值明显变化（p＞0.05），而在372 h会引起Ct值明显升高（p＜0.05），差异有统计学意义；甲型流感病毒、鼻病毒、冠状病毒-229E、偏肺病毒在168 h内不会引起Ct值明显变化（p＞0.05），而在336 h会引起Ct值明显升高（p＜0.05），差异有统计学意义，见表3。

2.3 常温环境下不同保存时间对FTA卡样本Ct 值的影响

12份阳性FTA卡样本储存在常温环境下，经过不同时间的Ct值的变化见表4。结果显示肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌在336 h以内不会引起Ct值明显变化（p＞0.05），而在672 h会引起Ct值明显升高（p＜0.05），差异有统计学意义；甲型流感病毒、鼻病毒、冠状病毒-229E、偏肺病毒在72 h内不会引起Ct值明显变化（p＞0.05），而在168 h会引起Ct值明显升高（p＜0.05），差异有统计学意义。

2.4 37℃环境下不同保存时间对FTA卡样本Ct 值的影响

12份阳性FTA卡样本储存在37℃环境下，经过不同时间的Ct值的变化见表5。结果显示肺炎链球菌、流感嗜血杆菌在72 h以内不会引起Ct值明显变化（p＞0.05），而在168 h会引起Ct值明显升高（p＜0.05），差异有统计学意义；甲型流感病毒、鼻病毒、冠状病毒-229E、偏肺病毒在72 h后会引起Ct值明显升高（p＜0.05），差异有统计学意义，鼻病毒、偏肺病毒和冠状病毒-229E在672 h后检测不到。

3 讨论

临床样本的质量会对实验室检测结果产生影响，尤其是样本的保存时间。王博文等^[6]通过研究不同样本保存条件对鼻咽拭子呼吸道病原体核酸检测的影响，发现对于腺病毒和支原体，同未保存样本核酸检测Ct值相比，20℃保存48 h以上，会引起样本Ct值明显上升，4℃保存96 h以上才会导致样本Ct值变化。FTA卡是一种区别于鼻咽拭子的采样方式，可以在室温下采集、运输和储存^[7]，Janina Krambrich等^[8]将虫媒病毒培养液保存于FTA卡上，发现该卡用于黄病毒和甲病毒的保存是安全有效的，将含有黄病毒或甲病毒FTA卡保存于常温环境中，不影响检测结果。

本研究通过qPCR检测出12份阳性样本，28份阴性样本，每组样本的FTA卡样本与口咽拭子采样管的检测结果完全一致，且Ct值无差异，说明FTA卡在呼吸道样本的采集中具有一定的可行性。本研究进一步探索FTA卡不同保存环境温度对于检测结果的影响，结果显示所研究的病原体随着时间的延长，Ct值也在逐渐升高，其中偏肺病毒、鼻病毒和冠状病毒-229E在37℃环境保存28 d后检测不到病毒载量；保存于4℃环境下，所研究的7种病原体在7 d以内不会引起Ct值明显变化，而在14 d或28 d后会引起Ct值明显升高，但RNA病毒的Ct值变化比DNA病毒的Ct值变化明显，可能是由于RNA易降解导致；储存在常温环境下的肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌在7 d以内不会引起Ct值明显变化，而在14 d后会引起Ct值明显升高，差异有统计学意义；甲型流感病毒、鼻病毒、冠状病毒-229E、偏肺病毒在3 d内不会引起Ct值明显变化，而在7 d后会引起Ct值明显升高，差异有统计学意义；储存在37℃环境下，肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌在7 d以内不会引起Ct值明显变化（p＞0.05），而在7 d后会引起Ct值明显升高，差异有统计学意义；甲型流感病毒、鼻病毒、冠状病毒-229E、偏肺病毒在3 d后会引起Ct值明显升高，差异有统计学意义。

本研究为FTA卡在呼吸道样本不同温度下的保存提供了一定基础数据，也为国境口岸探索一种更加便利、不受低温限制的采样方式提供了参考依据。FTA卡常温运输72 h内，虽然会导致部分病原体的Ct值升高，但不会影响检测结果的一致性。因此，送样单位如果可以保证72 h内将样本送达实验室，可以采用常温运送；如果需要7 d才能送达实验室，建议采用冰袋或冰盒运送，这样可以保证样本质量，从而保证检测结果质量。

参考文献

[1]王博文, 李国凯, 杨莉, 等. 不同样本保存条件对鼻咽拭子呼吸道病原体核酸检测的影响[J]. 临床检验杂志, 2021, 39(11): 836-838.

[2]刘馨玉, 李萌, 石璞玉, 等. 多重实时荧光定量 PCR对下呼吸道感染病原体检测分析[J]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2019, 12(5): 559-562．

[3]韩起, 殷作明, 杨光, 等. 高原地区部队营区腺病毒流行特征及发病特点[J]. 西部医学, 2020, 32(1): 53-55．

[4]叶颖, 李磊, 朱丽, 等. 国境口岸应对重大传染病疫情的措施与思考[J]. 中国公共卫生管理, 2023, 39(6): 774 -777.

[5]王玥晖,尚进,杨晨,等. FTA-环介导等温扩增技术直接提取变异链球菌DNA的效果评价[J].中国组织工程研究, 2025, 29(5): 1043-1049.

[6]王博文, 李国凯, 杨莉, 等. 不同样本保存条件对鼻咽拭子呼吸道病原体核酸检测的影响[J]. 临床检验杂志, 2021, 39(11): 836-838.

[7] Kriegshäuser G, Berndt A, Alpar D, et al. Stable preservation of SARS-COV-2 RNA from gargle samples on FTA cards[J]. Clinica Chimica Acta, 2022, 530: 297-324.

[8] Krambrich J, Bringeland E, Hesson JC, et al. Usage of FTA®Classic Cards for Safe Storage, Shipment, and Detection of Arboviruses[J]. Microorganisms, 2022, 10(7): 1445.

表1 阳性样本保存液和FTA卡Ct 值的比较

Table 1 Ct values of positive sample preservation solution and FTA cards preservation solution and FTA card

表2 口咽拭子样本和FTA卡检测结果

Table 2 Test results of oropharyngeal swab samples and FTA cards

表3 4℃环境下不同保存时间FTA卡样本的Ct 值变化

Table 3 Ct values of FTA card samples under different storage times at 4℃

表4 常温环境下不同保存时间FTA卡样本的Ct 值变化

Table 4 Ct values of FTA card samples under different storage times at room temperature

表5 37℃环境下不同保存时间FTA卡样本的Ct 值

Table 5 Ct values of FTA card samples under different storage times at 37℃