黄圣南 刘冬妮 王显龙 禤开智 李丹丹

黄圣南 ¹ 刘冬妮 ² 王显龙 ¹ 禤开智 ¹ 李丹丹 ¹

摘 要 本文建立了一种同位素内标稀释结合浓硫酸磺化处理，经液相色谱串联质谱对样品中五氯酚（Pentachlorophenol，PCP）及其钠盐快速分析筛查的方法。通过改变样品的pH值将样品中的五氯酚钠（Sodium pentachlorophenate，PCP-Na）转化成五氯酚后，用正己烷提取后辅以浓硫酸磺化，后采用高效液相色谱串联质谱法进行测定，内标法定量。结果显示，五氯酚在0.15～10 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r＞0.999；方法加标试验的平均回收率为90%～101%、RSD为4.17%～12.69%（n = 6），检出限和定量限分别为0.15 μg/kg、0.50 μg/kg。结果表明，该方法操作简便，准确度和灵敏度较高，检出限、定量限均达到痕量分析标准，为五氯酚及其钠盐的快速检测提供了方法依据。

关键词 五氯酚及其钠盐；磺化；内标法

Isotope Internal Standard Dilution-UPLC/MS/MS Rapid Screening of Pentachlorophenol and Its Sodium Salt R esidues

HUANG Sheng -N an ¹ LIU Dong-N i ² WANG Xian -L ong ¹ XU A N Kai -Z hi ¹ LI D an-Dan ¹

Abstract A method was developed for the rapid analysis and screening of Pentachlorophenol (PCP) and its sodium salts in samples by using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS) after internal standard dilution combined with concentrated sulfuric acid sulfonation. Sodium pentachlorophenate (PCP-Na) in the sample was converted into pentachlorophenate by changing the pH value of the sample, then extracted with n-hexane, sulfonated with concentrated sulfuric acid, determined by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, and quantified by internal standard method. The results demonstrated that the linear relationship of pentachlorophenol was good in the range of 0.15-10 ng/mL, and the correlation coefficient r was ＞0.999. The average recoveries from the spiking experiments were 90% to 101%, with an RSD of 4.17% to 12.69% (n = 6). The limits of detection and quantitation were 0.15 μg/kg and 0.50 μg/kg, respectively.

Keywords pentachlorophenol and its sodium salts; sulfonate; internal standard method

五氯酚（Pentachlorophenol，PCP）和五氯酚钠（Sodium pentachlorophenate，PCP-Na）从20世纪30年代起长期作为防腐剂、杀螺剂、除草剂在农业等行业中使用。目前五氯酚及其钠盐的检测方法多数需要使用固相萃取柱等净化材料^[1-2]，或需对其进行衍生化处理^[3-5]，实验过程较为复杂且成本较高。笔者从大批量动物源性食品中痕量五氯酚的快速分析筛查角度考虑，建立了一种无需进行衍生化处理且不使用固相萃取柱，便可对动物源性食品中PCP及PCP-Na进行快速分析筛查的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；TQS三重四极杆质谱仪（美国Waters公司）；涡漩混合器（德国IKA公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）；超声波振荡器（德国ELMA公司）；万分位电子天平MS204S（瑞士梅特勒公司）；氮吹浓缩仪（美国Biotage公司产品）；13 mm×0.22 μm疏水性微孔滤膜（北京纳鸥科技有限公司）；五氯酚钠标准物质（浓度为1000 μg/mL，北京坛墨质检科技有限公司）；¹³C₆-五氯酚标准物质（纯度≥99.9%，北京坛墨质检科技有限公司）；硫酸（优级纯，广东广试试剂科技有限公司产品）；甲醇、正己烷（色谱纯，德国CNW公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线制备

取浓度为1000 μg/mL的五氯酚钠标准溶液100 μL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容后得到浓度为10 μg/mL的五氯酚钠储备液，按五氯酚与五氯酚钠相对分子质量比计，使用50%甲醇水进行稀释得到浓度为100 ng/mL的五氯酚使用液，现配现用；准确称取10 mg（±0.1 mg）五氯酚同位素内标于10 mL容量瓶中，用甲醇定容后得到浓度为1 mg/mL的五氯酚同位素内标储备液，再用甲醇稀释得到100 ng/mL的五氯酚同位素内标使用液，现配现用；依次吸取15 μL、50 μL、100  μL、200 μL、500 μL、1000 μL浓度为100 ng/mL的五氯酚使用液于10 mL容量瓶中，向各容量瓶中分别加入100 μL的五氯酚同位素内标使用液，用体积比为2∶3的甲醇水溶液定容后得到浓度为0.15 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL的五氯酚标准曲线（内标浓度均为1 ng/mL）。

1.2.2 样品提取

根据GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》附录A对待检样品测定部位进行制备，称取5.00 g（精确到0.01 g）样品于50 mL离心管中，先后加入50 μL浓度为100 ng/mL的¹³C₆-PCP工作液和2 mL浓硫酸混匀，再加入10 mL正己烷涡旋提取3 min后进行震荡提取5 min，9000 r/min（4℃）离心5 min（油脂含量较高的样品或分层效果不好时需加入少量氯化钠后进行涡旋、离心提取），吸取2 mL上清液于10 mL试管中备用。

1.2.3 样品净化

向2 mL上清液中加入1 mL浓硫酸后，低速涡旋5 s左右进行磺化处理，3000 r/min（4℃）离心5 min，取1 mL上清液于40℃氮吹至近干，加入0.5 mL乙腈复溶，经0.22 μm微孔滤膜过滤后备用。

1.3 UPLC-MS/MS条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters XSelect^®HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；柱温：40℃；进样量：5 μL；液相色谱分离梯度见表1。

表1 液相色谱分离方法

Table 1 Liquid chromatography separation method

1.3.2 质谱条件

离子源模式：电喷雾离子源（ESI^-）；质谱扫描方式：多反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；离子源温度 150℃；脱溶剂温度（Desolvation Temp）500℃；脱溶剂气（氮气）流速为16670 mL/min；锥孔气（氮气）流速为150 mL/min；毛细管电压（X-ray tube voltage）3000 V；定性、定量离子、碰撞能量、锥孔电压见表2。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件优化

2.1.1 色谱条件优化

由于不同品牌C₁₈色谱柱生产工艺存在差异且填料中硅胶纯度也不一样，会影响待测物质在质谱中的灵敏度。由于五氯酚疏水性较强，所以大部分研究使用C₁₈色谱柱进行检测^[6-7]。本研究通过比对多个品牌不同型号的C₁₈色谱柱，结果表明结合Waters XSelect^®HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）并采用甲醇和5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相，可得到理想峰形的目标化合物及合适的保留时间，最终选择Waters XSelect^®HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）作为分析柱。

2.1.2 质谱条件优化

五氯酚是分子结构为共轭结构的小分子量化合物，其离子在碰撞室中不容易被打碎，较难获得特征离子^[8]。五氯酚分子结构中含5个Cl原子，Cl元素有³⁵Cl和³⁷Cl两种同位素，本研究在ESI^-模式下对200 ng/mL五氯酚标准溶液进行母离子全扫描，得到离子对262.7＞262.7、264.7＞264.7、266.7＞266.7、268.7＞268.7。但实际检测中发现未进行打碎的4个母离子组成的离子对在谱图上的基线较高，且除了262.7＞262.7外，五氯酚同位素内标在其余3个由母离子组成的五氯酚离子对相同保留时间上均有干扰（均有响应）。因此，通过进一步优化毛细管电压、碰撞能量以及锥孔电压对选定的母离子进一步打碎，得到五氯酚的新离子对264.7＞35.0、266.7＞35.0，五氯酚同位素内标的新离子对270.7＞35.0、272.7＞35.0，且实验结果表明该五氯酚离子对与其对应的同位素内标离子对不存在以上所诉的干扰情况。综上所述，最终选取PCP定量离子对为264.7＞35.0，定性离子对为266.7＞35.0；¹³C₆-PCP定量离子对为270.7＞35.0，定性离子对为272.7＞35.0。PCP、¹³C₆-PCP典型多反应监测谱图如图1所示。

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取溶剂优化

五氯酚酸钠易溶于水而五氯酚易溶于有机溶剂^[9]，在碱性条件下主要以五氯酚酸钠的形式存在，在酸性条件下则转换成五氯酚形式。本研究分别比较了硫酸∶正己烷（1∶10）；硫酸∶正己烷（1∶5）；乙腈∶水（1∶1）；含3%三乙胺的乙腈∶水（1∶1）；含1%甲酸的乙腈∶水（4∶1）5种提取溶剂。结果表明乙腈∶水（1∶1）提取效果最差；硫酸∶正己烷（1∶10）与含1%甲酸的乙腈∶水（4∶1）、含3%三乙胺的乙腈∶水（1∶1）提取效果相近；硫酸∶正己烷（1∶5）提取效果最佳，结果见表3。因此，最终选择硫酸∶正己烷（1∶5）作为提取溶剂（上述比值均为体积比）。

2.2.2 净化条件优化

在农药检测中基质干扰是影响检测结果准确度的一个重要因素，目前常见的净化方法有QuEChERS^[10]、液-液分配法^[11]、固相萃取净化^[12]。液-液分配法操作简单，但对蛋白质及脂肪含量较高的样品净化效果较差。本研究中QuEChERS分别尝试了0.2 g C₁₈+0.2 g MgSO₄、0.4 g C₁₈+0.4 g MgSO₄、4 g MgSO₄+1 g NaCl+1 g Na₃C₆H₅O₇+1 g C₆H₆Na₂O₇、4 g MgSO₄+2 g NaCl+0.5 g Na₃C₆H₅O₇+0.5 g C₆H₆Na₂O₇共4种净化方案，结果表明对于多种不同基质的净化效果而言，QuEChERS较难实现完全覆盖，个别基质中的PCP、PCP-Na回收率较低；固相萃取净化效果较好，但实验成本较高且操作过程繁琐；采用浓硫酸磺化法进行净化，操作简单且净化效果好，能有效降低实验成本和提高检测效率，适用于化学性质稳定的农药检测中对样品进行净化，因此实验最终选择浓硫酸对样品进行净化处理，净化效果如图2所示。另外，本研究还对不同品牌的微孔滤膜对待测物质的吸附情况进行了比较实验，结果表明个别品牌的微孔滤膜对五氯酚及其钠盐有较强的吸附性，会导致回收率和准确度降低。

2.3 基质效应考察

在质谱分析中基质效应是影响结果准确度的重要因素^[13]，基质效应（Matrix Effect，ME）计算公式如下：基质效应（%）= [基质匹配标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率－1]×100%。ME为负值表示存在基质抑制效应，正值表示存在基质增强效应，以绝对值作为判断依据，绝对值越大则表示该样品基质效应越强^[14]。| ME |＜20%表示弱基质效应；20% ≤| ME |≤50％表示中等强度基质效应；| ME |＞50%表示强基质效应^[15]。结果如表4所示，多种样品均存在中等强度基质效应，且个别样品存在强基质效应。因此，方法使用浓硫酸磺化法对样品进行净化处理，并采用同位素内标法对基质效应进行校正，从而有效提高检测结果的稳定性和准确性。

2.4 方法学评估

2.4.1 检出限与定量限的确定

根据内标法原理结合优化后的实验条件，以五氯酚质量浓度为横坐标，五氯酚定量离子对峰面积与其同位素内标峰面积的比值为纵坐标，绘制6个浓度水平的工作曲线，该曲线线性范围为0.15～10 ng/mL，相关系数r为0.9998。向不同空白基质中加入五氯酚标准溶液进行逐级稀释，以3倍信噪比对应的浓度0.15 ng/mL作为检出浓度，10倍信噪比对应的浓度0.5 ng/mL作为定量浓度，按取样量5 g计算，方法检出限为0.15 μg/kg，定量限为0.50 μg/kg。

2.4.2 回收率与精密度

分别对5 g不同基质的空白样品进行三梯度、六平行的加标试验，平均回收率在90%～101%之间，相对标准偏差（RSD）在4.17%～12.69%之间，结果见表4，表明该方法的稳定性和准确度良好，符合检测要求。

2.5 方法比较

该方法与现有五氯酚相关的国家标准、行业标准、相关检测方法相比（表5），在前处理实验过程中无需使用固相萃取柱且无需进行衍生化处理，既提高了检测效率又能有效降低实验成本，且方法检出限、定量限均低于其他方法，准确度、精密度均能满足农作物中五氯酚及其钠盐的检测要求。

3 结论

本研究基于同位素内标校正结合浓硫酸磺化处理，建立了一种痕量PCP、PCP-Na的快速分析筛查方法，该方法操作过程简便，具有较高的准确度和灵敏度，方法检出限、定量限均达到痕量分析标准，为痕量五氯酚及其钠盐的定性、定量分析提供可靠的方法依据和检测思路。

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基金项目：海关总署科研项目（2024HK024）

第一作者：黄圣南（1988—），男，壮族，广西贵港人，本科，工程师，主要从事食品质量安全检测工作，E-mail: 403493126@qq.com

1. 海口海关技术中心 海口 570311

2. 海南省检验检测研究院食品检验检测中心 海口 570314

1. Haikou Customs Technical Center, Haikou 570311

2. Food Inspection and Testing Center Hainan Institute of Inspection and Testing, Haikou 570314

表2 五氯酚及其内标物的保留时间、锥孔电压、

碰撞能量、定性及定量离子对

Table 2 Retention time, cone-hole voltage, collision energy, qualitative and quantitative ion pairs of pentachlorophenol and its internal standard

图1 PCP、¹³C₆-PCP打碎后的离子监测谱图

Fig.1 Ion monitoring spectra of PCP and 13C6-PCP after breaking

表3 不同溶剂的提取效率

Table 3 Extraction efficiency of different solvents

图2 多种样品基质净化效果

Fig.2 A variety of sample substrate purification effects

表4 不同空白基质中五氯酚的基质效应、回收率和相对标准偏差（n = 6）

Table 4 Matrix effect, recovery and relative standard deviation of pentachlorophenol in different blank substrates (n = 6)

表5 五氯酚相关检测方法比较

Table 5 Comparison of relevant methods