周洁 黄夏宁 卢玲敏 万旻 梁方芳 梁中平 郭枫 覃杨光

覃海文 ^1,2 孙 涛 ^1,2 孔德英 ^1,2 滕少娜 ^1,2 周 林 ^1,2 高文娜 ³ 郑春生 ³ 石 娟 ^{4 *}

摘 要 随着第二代测序技术的发展，简化基因组测序已成为一种高效、低成本的开发基因组遗传资源的方法。基因分型测序（Genotyping-By-Sequencing，GBS）技术基于DNA限制性内切酶对植物基因组进行简化，不依赖于参考基因组开发的SNP标记，为非模式植物的基因组研究提供了快速、精准、高通量和高性价比的工具，在动物基因组遗传研究领域也得到了快速发展。本文重点介绍GBS的主要操作步骤、技术类型、研究进展及其应用情况。

关键词 基因分型测序；研究进展；应用

Research Progress of Genotyping-by-sequencing

QIN Hai-Wen^1,2 SUN Tao^1,2 KONG De-Ying^1,2 TENG Shao-Na^1,2

ZHOU Lin^1,2 GAO Wen-Na³ ZHENG Chun-Sheng³ SHI Juan^4*

Abstract With the development of second-generation sequencing technology, simplified genome sequencing has become an efficient and low-cost method to develop genetic resources of plant genomes. Genotyping-By-Sequencing (GBS) technology is based on DNA restriction endonuclease to simplify the plant genome, and does not rely on SNP markers developed from reference genomes, which provides a rapid, precise, high-throughput and cost-effective tool for genomic studies of non-model plants, and it has seen rapid development in the field of animal genomic genetic studies in these years. This paper mainly focuses on the main operational steps, types of technologies, research progress and the application of GBS.

Keywords Genotyping-By-Sequencing (GBS); research progress; application

第二代测序技术是从第一代测序——Sanger法测序发展起来的高通量、高速度、高精度和低成本的测序技术，它可以一次对数百万个DNA片段进行快速测序，提供有关基因组结构、遗传变异、基因表达谱和表观遗传修饰等信息^[1]。广泛使用的测序平台包括Roche 454测序平台^[2]、离子激流测序平台（Ion Torrent）^[3]和Illumina测序平台^[4]。相对于一代测序，第二代测序技术大大降低了测序成本并大幅度提高了测序速度，显著提高了DNA测序的通量、速度和精准度，在基因组学研究和临床诊断中应用广泛，如突变体的定位、检测SNP位点、全基因组甲基化测序等^[5]。

随着第二代测序技术的发展，简化基因组测序（Reduced-Representation Genome Sequencing，RRGS）已成为一种高效、低成本的开发动植物基因组遗传资源的方法，其主要利用限制性内切酶（Restriction Endonuclease，RE）打断基因组DNA，对特定片段进行高通量测序，从而获得大量遗传多态性序列来充分代表目标物种全基因组信息。此方法实验步骤简单、成本低，而且可不依赖参考基因组就能获得全基因组范围内的遗传多态性信息，因而广泛应用于生态学、进化学和基因组学等领域。其中，基因分型测序（Genotyping-By-Sequencing，GBS）是专为Illumina测序技术而开发的，它是根据整个基因组的简化表示来识别SNP，是一项应用前景广阔的技术，为筛选基因组资源匮乏的非模式标本的大型未定性基因库提供了巨大潜力^[6]。与其他降低复杂性的方法相比，GBS是一种相对简单快捷的方法，可生成大量SNP数据^[7-8]。它生成基因分型文库的方案简单，无须特定的凝胶粒度选择步骤，避免了使用不同的Y-适配体，并可通过手动或自动液体处理方法实现并行化^[9]。GBS通过使用适当选择的限制性内切酶来降低基因组的复杂性，从而避免在测序过程中针对基因组中无信息的重复区域^[6]。由于参考基因组的可用性不是GBS实施的必要条件，且成本较低、实验操作简单，并能实现高通量测序获得的SNP丰富的全基因组信息，因而目前广泛用于植物遗传多样性分析、系统进化、分子标记定位和高密度遗传图谱构建等研究^[10]。

1 GBS技术的主要操作步骤

GBS技术的主要操作步骤包括以下三点：

（1）GBS文库构建：利用限制性内切酶进行酶切，酶切后的DNA片段两端用T4连接酶加上接头和barcode，之后进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物纯化后立即进行荧光定量分析，确保其浓度符合后续测序要求。

（2）上机测序。

（3）数据质控与比对：使用FastQC^[11]对原始测序序列（Raw Reads）进行质控，再采用Burrows-Wheeler-Alignment（BWA）^[12]将剪切Reads与参考基因组进行比对，如果没有参考基因组，可通过Reads聚类建立Mock Reference，该流程可以最大程度地利用GBS数据并在没有参考基因组的情况下执行SNP基因分型分析；接着使用samtools mpileup^[13]准备所有BAM文件的叠加文件，以便用PLATYPUS^[14]进行遗传变异调用；然后使用VCFtools^[15]过滤双等位基因SNP和低频等位基因，之后生成最终的VCF文件，并使用R^[16]中的adegenet进行主成分分析等数据分析。

2 GBS技术类型

如今已有研究开发出了多种GBS技术类型，重点集中于优化测序文库构建和DNA片段大小选择。这些测序方法在对限制性内切酶的选择、DNA片段大小范围和特定接头的使用上存在一定的差异^[17]。

通常从GBS中调用SNP数据的软件包括两类生物信息学管道：（1）不需要参考基因组的管道，如UNEAK^[18]或GBS-SNP-CROP^[19]；（2）基于参考基因组进行SNP检测的管道，如TASSEL-GBS^[20]、IGST^[8]和Fast-GBS^[21]。最近对这些工具的比较表明，两种类型的管道都可以成功地从GBS的读取数据中提取SNPs，但第二种类型的管道通常产生更多的SNPs^[22]。此外，由于检测到的SNP精确定位在参考基因组上，因此所得信息更有用。

2.1 无参考基因组的GBS管道

对于一些缺乏参考基因组的高度杂合多倍体（四倍体和八倍体）植物物种，早期的检测SNP的方法很难实现，如今有基于网络的UNEAK方法和GBS-SNP-CROP可高效检测出SNP，无论是否有参考基因组，都可使用任意读取长度的对端GBS数据来促进遗传表征。它们与常规的GBS操作过程相似，但在与参考基因组比对的步骤，会直接将GBS原始数据经过解析和质量过滤后的Reads来构建特定于GBS的简化表示引用，以启用GBS读取映射并促进SNP的检测。这一阶段依赖于基于相似性的聚类策略来对GBS reads进行分组，以便为全套GBS片段生成具有代表性的参考序列。而且GBS-SNP-CROP与TASSEL-UNEAK相比，该管道有较好的效果，不仅鉴定的SNP数量显著增加，而且平均读取深度增加，且大大降低了基因分型错误率^[19]。

2.2 基于参考基因组进行SNP检测的管道

现在大多数研究是基于物种的参考基因组来进行GBS分析，但会根据研究的物种去选择合适的限制性内切酶，以及选择合适的参数，如所需的覆盖深度、读映射的质量或允许的发散度等，以获得成功的映射^[21]。而且尽管有些GBS生物信息学管道是为具有参考基因组的物种设计的，但可以使用由许多contigs组成的不完整基因组组装作为替代参考^[20]。

3 GBS研究及应用进展

3.1 构建高密度遗传图谱

连锁图谱的构建对于植物遗传研究和标记辅助育种计划至关重要^[23]。GBS可以产生高密度的连锁图谱，特别是在缺乏广泛基因组资源的非模式物种中。通常可以利用GBS技术对植物群体进行全基因组SNP检测和基因分型，生成单种群连锁图谱，并使用共同的SNP标记作为桥梁，将它们合并成一个高密度的综合遗传图谱^[24-25]。

3.2 遗传多样性研究

GBS可精确检测种群和野生种群亲缘关系的杂合SNP，尤其是应用于农作物和其他树种上，已成功应用于玉米Zea mays、水稻Oryza sativa、大豆Glycine max、马铃薯Solanum tuberosum、大麦Hordeum vulgare、小麦Triticum aestivum、绿豆Vigna radiata、木薯Manihot esculenta、乌头叶豇豆Vigna aconitifolia、黄秋葵Abelmoschus esculentus、马尾松Pinus massoniana、宽杯杜鹃Rhododendron sinofalconeri、落叶松属Larix spp.等物种的遗传多样性研究中^[8,10,26-38]，为获取品质优良的高产品种和抗性育种提供理论依据。

近年来，GBS在动物遗传多样性的研究也逐渐增多，已成为家畜等常见动物基因分型的一种经济实惠的替代方法。例如，利用GBS揭示了来自秘鲁安第斯山脉6个不同地区传统饲养的豚鼠种群遗传多样性和遗传距离^[39]；采用GBS技术对三角鲂Megalobrama terminalis、翘嘴鲌Culter alburnus、蒙古鲌C. mongolicus及其杂交子代的遗传结构进行分析，为鲂鲌鱼类的杂交选育提供更多的遗传学数据^[40]。

此外，GBS应用于昆虫遗传多样性的研究领域越来越广泛，特别是亚种以下的鉴定，例如使用GBS来检测新西兰石蝇种群（Zelandoperla fenestrata, Z. tillyardi和Z. pennulata）的全翅和退化翅个体的SNP位点，发现几个群体的基因组中可能存在形态类型之间的高度分化^[41]；利用GBS技术并结合声学和生态学数据对枯蝉Subpsaltria yangi不同地理种群的遗传分化和适应性分化等进行研究^[42]；采用GBS研究巴西和阿根廷农业区的草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda种群的遗传多样性等^[43]。

3.3 种质鉴定

GBS适用于对基因组复杂且未测序的植物种质进行分子鉴定。有学者利用GBS分析了24个不同黄芥子Sinapis alba品种的遗传多样性，发现品种之间、黄籽类型和黑籽类型之间存在变异，这体现了GBS在植物种质基因组鉴定中的实用性，也揭示了精英育种品系之间的遗传关系，对黄芥改良的亲本选择具有价值意义^[44]。

4 结语

在过去的10多年里，基因测序技术研究取得了显著的进展，特别是随着第二代测序技术的快速发展，以高通量、高精度、低成本的方式提供了很多分析DNA和RNA的技术工具。这种变革性技术迅速推动了基因组学在各个领域的进步。GBS是一种有发展前景、低成本且可靠的常规筛选技术，随着样品制备方法的改进、测序深度的增加、单碱基测序成本的降低，GBS的可靠性与实用性在逐步提高，该技术展现出巨大的潜力，为基因组资源相对匮乏的非模式作物的构建和基因库的筛选提供强有力的支持，同时实现动物或植物亚种之间的快速精准鉴定。

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本论文由1+X合作单位资助

基金项目：重庆市科技计划项目（2022TIAD-GPX0186）；海关总署科研项目（2020HK176）

第一作者：覃海文（1993—），女，壮族，广西河池人，博士，农艺师，主要从事植物检疫工作，E-mail: qinhaiwen17@126.com

通信作者：石娟（1979—），女，汉族，山西新绛人，博士，教授，主要从事植物检疫工作，E-mail: BJshijuan@bjfu.edu.cn

1. 重庆海关技术中心 重庆 400020

2. 国家中药材物种鉴定及质量安全检测重点实验室（重庆） 重庆 400020

3. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

4. 北京林业大学 北京 100083

1. Chongqing Customs Technology Center, Chongqing 400020

2. State Key Laboratory for Species Identification and Quality Safety Inspection of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400020

3. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

4. Beijing Forestry University, Beijing 100083

第6卷 增刊

2024年11月

Monographs and Reviews / 专论综述

基于恒温扩增技术的病原体快速检测

研究进展

周 洁 ¹ 黄夏宁 ^1,2 卢玲敏 ¹ 万 旻 ³ 梁方芳 ¹ 梁中平 ¹ 郭 枫 ¹ 覃杨光 ^{1 *}

摘 要 本文综述了常见的恒温扩增（Isothermal Amplification Technologies，IAT）技术，包括环介导恒温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术、核酸序列扩增（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）技术、链置换扩增（Strand Displacement Amplification，SDA）技术、重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术、重组酶介导恒温扩增（Recombinase-Aided Amplification，RAA）技术等，并分别介绍了它们的原理、特点和在病原体精准检测中的应用。IAT 具有简便易行、高效灵敏等优点，可在现场条件下快速检测病原体。本文聚焦于IAT在病原体检验中的应用，可为口岸检疫工作的理论研究和实践应用提供参考。

关键词 核酸检测；恒温扩增技术；病原体快速检测；口岸检疫

Advances in Isothermal Amplification Technologies for Rapid Detection of Pathogens

ZHOU Jie¹ HUANG Xia-Ning^1,2 LU Ling-Min¹ WAN Min³ LIANG Fang-Fang¹

LIANG Zhong-Ping¹ GUO Feng¹ QIN Yang-Guang^1*

Abstract This article reviews the common Isothermal Amplification Technologies (IATs), including Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP), Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA), Strand Displacement Amplification (SDA), Recombinase Polymerase Amplification (RPA), and Recombinase-Aided Amplification (RAA). It details their principles, characteristics, and applications in the precise detection of pathogens. IATs, characterized by their simplicity, convenience, efficiency, and sensitivity, offer a robust platform for rapid pathogen detection under field conditions. This review focuses on the application of IATs in pathogen detection and aims to provide reference for the theoretical research and practical application of port quarantine.

Keywords nucleic acid detection; isothermal amplification technologies; rapid pathogen detection; port quarantine

本论文由热带病监测1+X研究室资助

基金项目：海关总署科研项目（2024HK035）；中国海关科学技术研究中心自立科研课题（2024HX09，2024HX12）；广西壮族自治区卫健委西药类别自筹经费科研课题（Z-A20241171）

第一作者：周洁（1994—），女，汉族，广西河池人，博士，主要从事口岸卫生检疫工作，E-mail: zhoujie283@outlook.com

通信作者：覃杨光（1967—），男，壮族，广西贵港人，本科，主要从事卫生检疫工作，E-mail: 1227875939@qq.com

1. 广西国际旅行卫生保健中心（南宁海关口岸门诊部） 南宁 530028

2. 广西纳米抗体重点实验室/广西纳米抗体工程研究中心 南宁 530021

3. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

1. Guangxi International Travel Health Care Centre (Port Clinic of Nanning Customs District), Nanning, Guangxi 530028

2. Guangxi Key Laboratory of Nanobody Research/Guangxi Nanobody Engineering Research Center, Nanning 530021

3. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

核酸作为生物体遗传密码的基本物质，在生物识别领域扮演着至关重要的角色。脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）和核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）两种主要类型的核酸，凭借着互补配对的特性以及与离子、激素、蛋白质甚至整个细胞的高亲和力，已成为分子诊断和生物研究领域不可或缺的生物标志物。近几十年来，分子诊断技术突飞猛进^[1]，而其中大部分方法都依赖于核酸扩增（Nucleic Acid Amplifcation，NAA）技术。

核酸扩增技术是以围绕着核酸分子扩增为目的而开展的技术，根据温度变化情况，目前主要分为两大类：循环扩增（Thermocycling Amplification）和恒温扩增（Isothermal Amplification，IAT）。循环扩增技术历史悠久，应用成熟且广泛，其中最具代表性的技术是聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）。PCR利用聚合酶和特异性引物，能够对目标核酸信号进行百万倍的扩增，现已成为核酸检测领域的金标准。然而，由于其需要变温循环的特性，对温控仪器的要求较高，限制了其在基层检测中的应用。

口岸作为国家对外开放的重要窗口，是传染病防控的第一道防线。随着全球人员和货物流动日益频繁，口岸检疫工作面临着前所未有的挑战。已有研究表明，传统的检测方法在应对病原体的多样性和变异性时，存在检测速度缓慢、灵敏度较低、操作复杂等局限性^[2]。为了进一步保障国门安全，提高检疫效率，迫切需要引入更加先进、高效的检测技术。与传统PCR技术相比，IAT在现场应用中表现出更高的实用性和效率。本文系统总结了IAT的原理、分类、优缺点及在病原体检测中的应用，并探讨了IAT在口岸检疫中的应用前景，以期为推动IAT在口岸检疫领域的推广应用提供理论依据。

1 恒温扩增技术的概况

IAT是一种无需热循环仪即可在恒定温度下进行核酸扩增的技术，与传统的PCR相比，具有操作简单、快速、成本低等优点，近年来在分子诊断、病原体检测、基因分型等领域得到了广泛应用^[3-4]。IAT技术可以根据扩增机制、扩增产物和应用领域等不同标准进行分类。根据扩增机制的不同，IAT技术可分为两大类。一类是基于分析物浓度增加的IAT技术：主要包括环介导恒温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）、依赖核酸序列型扩增技术（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）、链置换扩增（Strand Displacement Amplification，SDA）、重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）和重组酶介导恒温扩增（Recombinase-Assisted Amplification，RAA）等。这类技术的特点是通过扩增产物的不断积累，使分析物的浓度得到显著提升，从而提高检测灵敏度。另一类是基于分析信号增加的IAT技术：主要包括滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）、核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大（Exonuclease Ⅲ-assisted Signal Amplification，EASA）、恒温圆链位移聚合（Isothermal Circular Strand Displacement Polymerization，ICSDP）等。这类技术的特点是将扩增产物转化为易于检测的信号，如荧光信号，从而实现灵敏的分析物检测。上述恒温扩增技术的主要特征见表1。

2 常见恒温扩增技术的种类及其应用

2.1 环介导恒温扩增（LAMP）技术

环介导恒温扩增（LAMP）技术是一种在恒温条件下以高灵敏度和特异性扩增目标DNA序列的分子生物学技术，由Nagamine等^[5]于2000年建立。该技术的核心在于利用链置换型DNA聚合酶和特异性引物设计，实现对目标DNA的高效扩增。针对目标DNA链上的6个区段，设计4个不同的引物，包括内引物（FIP/BIP）和外引物（F3/B3）。在60～65℃左右的恒温条件下，内引物与目标DNA链结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸形成新的DNA链；外引物与延伸后的DNA链结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸，形成具有哑铃结构的双链DNA；该哑铃结构DNA作为模板，在内引物和外引物的引导下进行循环扩增，最终生成大量目标DNA序列。Nagamine等^[5]通过引入两个环引物显著缩短了LAMP技术的反应时间^[5]，简化了操作流程，只需将样品DNA、引物、酶和反应缓冲液混合孵化即可，操作简便易行。

与传统PCR技术相比，LAMP具有显著的优势，使其成为核酸扩增和检测的有效工具。与需要复杂温循环操作和昂贵设备的PCR不同，LAMP可以在恒温条件下进行，使用简易仪器如水浴或加热块即可完成，操作简便易行^[6]。这种操作简便性源于LAMP独特的引物设计，它采用了4条引物识别靶基因中的6个特异性序列，从而确保了扩增反应的高特异性，最大程度地降低了非特异性扩增的干扰。此外，LAMP还具有卓越的灵敏度，可将几个拷贝的靶基因扩增到10⁹个拷贝水平，这种灵敏度远超传统PCR技术，使得LAMP成为检测痕量核酸的理想选择^[7-8]。LAMP通常可在30～60 min内完成反应^[9]，能够实现快速检测和分析。此外，LAMP结果可以使用多种方法可视化^[10]，包括肉眼观察、浊度分析、荧光检测和电泳，提供直观易懂的结果。

近年来，LAMP技术凭借其简单、快速、灵敏等优点，在多领域得到了广泛应用，尤其是在病原体检测方面展示出巨大潜力。早在2003年，LAMP技术就成功应用于流感病毒H5亚型的检测^[11]。在呼吸道传染病流行期间，LAMP技术为疾病的快速诊断提供了一种新的解决方案，整个检测流程不超过30 min，灵敏度高，特异性良好，可用于人群感染筛查^[12]。与传统的PCR技术相比，LAMP技术在检测疟原虫^[13]、真菌^[14]、耐药菌^[15]等病原体方面展现出更高的灵敏度和特异性，且操作更简便，更适合现场快速检测。随着技术的不断进步，LAMP技术的便携式、微型化、多重检测等新技术的开发，也将进一步提升LAMP技术的实用性和推广价值。

2.2 依赖核酸序列型扩增（NASBA）技术

依赖核酸序列型扩增（NASBA）技术由Compton^[16]于1991年建立，是一种基于转录依赖扩增系统的恒温扩增技术^[16]，它利用T7 RNA聚合酶、RNase H和AMV逆转录酶3种酶的活性和一对特异性引物，在恒温条件下进行核酸扩增^[17]。NASBA 是一种核酸扩增技术，主要用于 RNA 序列检测，但也可用于 DNA 检测，其工作原理是通过逆转录酶将 RNA 模板转录为互补DNA（ Complementary DNA，cDNA），再利用 T7 RNA聚合酶进行扩增。NASBA 与转录介导扩增 （Transcription-Mediated Amplification，TMA）同属恒温扩增方法，两者均采用逆转录酶合成 cDNA。两者的关键区别在于 NASBA 额外使用了核糖核酸酶 H降解 RNA 模板，提高了扩增效率和特异性。NASBA的主要步骤如下：利用逆转录酶将目标RNA转化为cDNA；T7 RNA聚合酶以cDNA为模板合成RNA反链；RNase H降解RNA反链，只剩下cDNA链；AMV逆转录酶利用cDNA链为模板合成新的cDNA链，并作为下一轮循环的模板。

NASBA技术与传统的PCR扩增技术相比具有以下优势：（1）NASBA在恒温条件下进行，无须热循环仪，可以在实验室外进行操作，更加灵活便捷；（2）实验可在41 ℃恒温条件下进行，经过1.5～2 h的扩增可将模板RNA放大至10⁹倍，扩增效率是PCR技术的1000倍以上^[18]；（3）可以扩增RNA和DNA模板，为检测RNA病毒和DNA病原体提供了有效工具^[19]；（4）受样品中其他物质的影响较小，扩增产物特异性强，可降低检测假阳率。

得益于上述优势，NASBA技术已被广泛应用于医学、农业等领域。例如，除了用于检测丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）^[20]、人免疫缺陷病毒Ⅰ型（Human Immunodeficiency Virus-1，HIV-1）^[21]等病毒、结核杆菌^[22]等细菌，还可用于检测植物病原体，如苹果锈果类病毒^[23]、肉类和牛奶中的沙门氏菌^[24]等；同样适用于检测水体、空气中的微生物^[25-26]等。NASBA技术的应用不仅限于传统实验室环境，研究人员已将其集成到微型化芯片实验室系统中，用于检测大肠杆菌O157:H7，该技术可在纳米级体积内实现了对荧光染料进行实时监测，大幅提高了检测效率和灵敏度^[27]。

2.3 链置换扩增（SDA）技术

链置换扩增（SDA）技术是由Walker等^[29-30]在1992年首次提出，是一种具有独特优势的恒温扩增技术^[28-29]。与传统的聚合酶链反应PCR技术相比，SDA技术无须预先加热变性模板DNA，也不需要复杂的热循环条件，操作简单，基本原理是利用特异性识别的限制性核酸内切酶在靶DNA的识别位点处切开双链DNA，形成缺口结构，在恒温条件下，具有链置换活性的DNA聚合酶以缺口为起点，沿3'方向延伸并置换下游链，实现靶DNA的指数扩增。具体而言，SDA技术的扩增过程可分为以下3个阶段：将靶DNA或RNA与特异性引火链（Priming Strand）进行退火杂交，引火链的3'端与靶核酸的5'端相配对，并留有一段未匹配的3'末端；DNA聚合酶沿引火链的3'末端进行延伸，合成新的DNA链；新合成的DNA链与靶核酸发生链置换反应，将靶核酸的原始链置换下来，形成新的双链DNA。在DNA聚合酶和限制内切酶的作用下，上述3个阶段可以重复循环进行，实现靶核酸的指数扩增。

SDA技术在病原体快速鉴定方面展现出广阔的应用前景。研究人员将SDA技术与压电DNA传感器技术相结合，成功研制了一种新型的SDA压电DNA传感器。该传感器在33份临床样本中对铜绿假单胞菌的检测表现出与荧光定量PCR一致的结果，但速度和灵敏度均显著优异^[18]。此外，SDA还可用于结核杆菌^[30-31]、流感病毒^[32]、HIV病毒^[33]等多种病原体。SDA技术的应用不仅限于病原体鉴定，还可扩展至mRNA和miRNA的检测。Hellyer等^[34]指出，与DNA和rRNA相比，mRNA的存在更能指示治疗性诊断的有效性^[34]。Shi等^[35]则开发了一种基于缺口酶和两个引物的策略，使miRNA靶点触发两次切割、聚合和位移反应，实现目标miRNA的指数级扩增，并生成可通过实时PCR中SYBRGreenI检测到的双链DNA^[36]。因此，SDA技术凭借其灵活性，可检测多种类型的核酸，成为病原体鉴定、基因表达分析等领域的重要工具。

2.4 重组酶聚合酶扩增（RPA）技术

重组酶聚合酶恒温扩增（RPA）技术是Piepenburg等^[36]于2006年开发并获得专利的一项恒温核酸扩增的技术^[36]，原理是通过重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶等多种蛋白酶，在恒温条件下（通常为37～42℃）对目标DNA进行指数级扩增。RPA无须加热和降温循环，可在恒温条件下进行扩增，操作简单，仪器设备要求低；扩增速度快，通常可在30 min内完成扩增，且灵敏度高，可检测到极少量的目标DNA。

RPA的反应主要分为以下几个步骤：UvsX重组酶蛋白与RPA引物结合形成复合物，并沿着DNA模板扫描识别同源序列；识别成功后，UvsX蛋白将引物插入模板链，形成D环（D-loop）结构；DNA聚合酶与引物的3'端结合，在dNTPs的存在下延伸链，并生成新的互补链；取代的模板链会与单链结合蛋白结合，维持单链的稳定性，防止插入的引物通过支链迁移而被排出；DNA聚合酶与引物的3'端结合，在dNTPs的存在下延伸链，并生成新的互补链^[37]。

目前，RPA已成功应用于检测多种病原体的检测。Rostron等^[38]利用RPA技术开发了一种针对基因组重复区检测血吸虫的荧光检测方法，灵敏度和特异性均优于传统方法^[38]；Hu等^[39]建立了一种基于RPA的LFD超灵敏检测大肠杆菌O157:H7的新方法，检测限低至4.4×10³ CFU/mL，显著优于PCR方法，为食品样品中大肠杆菌的检测提供了更为高效的工具^[39]。基于反转录RPA结合侧向流动试纸技术（RT-RPA-LFD）的RSV检测方法可同时检测RSV的A和B亚型，灵敏度达到10 copies/μL，并以可视化方式呈现结果，特异性强。RPA技术的优势体现在快速简便、设备通用和容错率高。容许碱基错配这一特点虽然有利于快速检测基因变异，但同时也带来了非特异性扩增的风险^[40]。RPA技术的独特优势使其十分适用于条件有限下的现场检测，因此有望成为强大的现场即时检测工具。

2.5 重组酶介导恒温扩增（RAA）技术

重组酶辅助扩增（RAA）是一种新型的核酸扩增技术，它利用来自大肠杆菌的重组酶RecA促进引物与目标DNA模板之间的同源链配对，并与单链结合蛋白和DNA聚合酶形成复合体，在恒温条件下进行核酸扩增^[41]。与RPA相似，RAA也具有快速便捷、高灵敏、高特异性等优点，两种技术在原理上也存在一些相似之处，但也有以下差异：RAA使用的是来自大肠杆菌的重组酶RecA，RPA使用的是T4噬菌体来源的重组酶；RAA反应需要RecA蛋白，而RPA反应不需要。目前，RAA技术在流感病毒^[42-43]、人类乳头瘤病毒^[44]、沙门氏菌^[45]、气单胞菌属^[46]等病原体的检测方面取得了较多的研究成果。随着研究的深入，RAA技术的灵敏度、特异性、反应速度等性能将进一步提高，其应用范围也将不断拓展。

2.6 其他恒温扩增技术

除了上述技术之外，还有其他几种恒温扩增技术在病原体检测领域也得到了广泛应用。滚环扩增（RCA）技术仿照自然界中环状DNA的复制机制，在恒温条件下（约30℃），以环状DNA为模板，利用DNA聚合酶不断合成与模板互补的长链DNA^[47-48]。RCA技术具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，近年来被广泛应用于多种病原体检测，包括李斯特菌^[49]、沙门菌^[50]、埃博拉病毒^[51]和流感病毒^[52]等。核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大（EASA）是一种不改变分析物浓度，而是通过酶促反应实现信号放大的技术。EASA技术利用外切酶Ⅲ的非特异性3'→5'外切酶活性，逐步去除DNA探针3'末端的单核苷酸，如果探针标记有报告基团（如荧光染料），则分析物释放后，报告基团会脱离淬灭基团，产生明显的光信号^[9]。EASA技术可用于检测多种核酸，包括DNA^[53]、RNA^[54]和miRNA^[55]。恒温圆链位移聚合技术（ICSDP）是一种于2009年提出的恒温扩增技术，反应体系简单，仅需发卡DNA探针、短引物和DNA聚合酶即可实现信号放大^[56]，目前已在多种检测领域中得到了应用^[57-58]。

3 总结和展望

随着国际交流与合作的日益密切，口岸病原体传入风险也有所上升。传统的病原体检测方法在灵敏度、检测速度和操作便捷性方面存在一定的局限性，难以满足口岸日益增长的检疫需求。因此，开发更加高效、精准的检测技术迫在眉睫。IAT技术的引入为口岸检疫提供了全新的检测思路，可在30 min至1 h内完成核酸扩增，显著提高了检测效率，对口岸检疫工作具有重要意义。此外，IAT技术具有高灵敏度和特异性，能够检测到极低浓度的病原体核酸，这对于口岸传染病的预防具有重要意义。便携性和现场检测也是IAT技术的一大优势，便携式设备的开发使得IAT技术能够在资源有限的口岸环境中应用，提供即时检测结果，提升检疫效率。同时，IAT技术可以实现多重检测，即在一次反应中同时检测多种病原体，这对于应对多种潜在威胁的口岸检疫尤为重要。IAT技术突破了传统检测方法的局限性，展现出快速便捷、灵敏精准和广谱性强的优势，使其成为快速检测和现场检测的理想技术手段，在入境人员健康筛查和进出口货物检疫等多个口岸检疫环节展现出广阔的应用前景。

但与此同时，IAT技术也面临一些挑战。该技术虽然具有高特异性，但在实际操作中可能会出现非特异性扩增的问题，导致假阳性结果，从而影响检测的准确性。此外，口岸环境较为复杂，样品来源多样且可能受到污染，这对IAT技术的灵敏度和特异性提出了更高要求，而且IAT技术在不同实验室和应用场景中的标准化程度不高，可能导致结果的可比性和重复性较差。因此，建立统一的技术标准和操作规范，以确保检测结果的一致性和可靠性，是亟待解决的问题。虽然IAT技术在设备和操作上要求相对简单，但试剂和耗材的成本较高。通过技术改进和规模化生产降低成本，将有助于促进IAT技术的广泛应用。目前，IAT技术仍处于起步阶段，标准化、规范化、商品化等方面亟待完善，需要加强研究，不断提高技术的性能和稳定性，以完善相关标准和规范。

综上所述，IAT技术在口岸检疫中的应用，能够提升检测效率和准确性。然而，仍需持续攻关，克服一些技术和应用上的局限性，以充分发挥其潜力，为口岸检疫工作提供更为有效的技术支持。

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表1 常见恒温核酸扩增技术的主要特征

Table 1 Main features of common isothermal nucleic acid amplification techniques