黄夏宁 覃鑫 周洁 卢玲敏 梁方芳 覃杨光 郭枫 刘彬

覃海文 ^1,2 孙 涛 ^1,2 孔德英 ^1,2 滕少娜 ^1,2 周 林 ^1,2 高文娜 ³ 郑春生 ³ 石 娟 ^{4 *}

摘 要 随着第二代测序技术的发展，简化基因组测序已成为一种高效、低成本的开发基因组遗传资源的方法。基因分型测序（Genotyping-By-Sequencing，GBS）技术基于DNA限制性内切酶对植物基因组进行简化，不依赖于参考基因组开发的SNP标记，为非模式植物的基因组研究提供了快速、精准、高通量和高性价比的工具，在动物基因组遗传研究领域也得到了快速发展。本文重点介绍GBS的主要操作步骤、技术类型、研究进展及其应用情况。

关键词 基因分型测序；研究进展；应用

Research Progress of Genotyping-by-sequencing

QIN Hai-Wen^1,2 SUN Tao^1,2 KONG De-Ying^1,2 TENG Shao-Na^1,2

ZHOU Lin^1,2 GAO Wen-Na³ ZHENG Chun-Sheng³ SHI Juan^4*

Abstract With the development of second-generation sequencing technology, simplified genome sequencing has become an efficient and low-cost method to develop genetic resources of plant genomes. Genotyping-By-Sequencing (GBS) technology is based on DNA restriction endonuclease to simplify the plant genome, and does not rely on SNP markers developed from reference genomes, which provides a rapid, precise, high-throughput and cost-effective tool for genomic studies of non-model plants, and it has seen rapid development in the field of animal genomic genetic studies in these years. This paper mainly focuses on the main operational steps, types of technologies, research progress and the application of GBS.

Keywords Genotyping-By-Sequencing (GBS); research progress; application

第二代测序技术是从第一代测序——Sanger法测序发展起来的高通量、高速度、高精度和低成本的测序技术，它可以一次对数百万个DNA片段进行快速测序，提供有关基因组结构、遗传变异、基因表达谱和表观遗传修饰等信息^[1]。广泛使用的测序平台包括Roche 454测序平台^[2]、离子激流测序平台（Ion Torrent）^[3]和Illumina测序平台^[4]。相对于一代测序，第二代测序技术大大降低了测序成本并大幅度提高了测序速度，显著提高了DNA测序的通量、速度和精准度，在基因组学研究和临床诊断中应用广泛，如突变体的定位、检测SNP位点、全基因组甲基化测序等^[5]。

随着第二代测序技术的发展，简化基因组测序（Reduced-Representation Genome Sequencing，RRGS）已成为一种高效、低成本的开发动植物基因组遗传资源的方法，其主要利用限制性内切酶（Restriction Endonuclease，RE）打断基因组DNA，对特定片段进行高通量测序，从而获得大量遗传多态性序列来充分代表目标物种全基因组信息。此方法实验步骤简单、成本低，而且可不依赖参考基因组就能获得全基因组范围内的遗传多态性信息，因而广泛应用于生态学、进化学和基因组学等领域。其中，基因分型测序（Genotyping-By-Sequencing，GBS）是专为Illumina测序技术而开发的，它是根据整个基因组的简化表示来识别SNP，是一项应用前景广阔的技术，为筛选基因组资源匮乏的非模式标本的大型未定性基因库提供了巨大潜力^[6]。与其他降低复杂性的方法相比，GBS是一种相对简单快捷的方法，可生成大量SNP数据^[7-8]。它生成基因分型文库的方案简单，无须特定的凝胶粒度选择步骤，避免了使用不同的Y-适配体，并可通过手动或自动液体处理方法实现并行化^[9]。GBS通过使用适当选择的限制性内切酶来降低基因组的复杂性，从而避免在测序过程中针对基因组中无信息的重复区域^[6]。由于参考基因组的可用性不是GBS实施的必要条件，且成本较低、实验操作简单，并能实现高通量测序获得的SNP丰富的全基因组信息，因而目前广泛用于植物遗传多样性分析、系统进化、分子标记定位和高密度遗传图谱构建等研究^[10]。

1 GBS技术的主要操作步骤

GBS技术的主要操作步骤包括以下三点：

（1）GBS文库构建：利用限制性内切酶进行酶切，酶切后的DNA片段两端用T4连接酶加上接头和barcode，之后进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物纯化后立即进行荧光定量分析，确保其浓度符合后续测序要求。

（2）上机测序。

（3）数据质控与比对：使用FastQC^[11]对原始测序序列（Raw Reads）进行质控，再采用Burrows-Wheeler-Alignment（BWA）^[12]将剪切Reads与参考基因组进行比对，如果没有参考基因组，可通过Reads聚类建立Mock Reference，该流程可以最大程度地利用GBS数据并在没有参考基因组的情况下执行SNP基因分型分析；接着使用samtools mpileup^[13]准备所有BAM文件的叠加文件，以便用PLATYPUS^[14]进行遗传变异调用；然后使用VCFtools^[15]过滤双等位基因SNP和低频等位基因，之后生成最终的VCF文件，并使用R^[16]中的adegenet进行主成分分析等数据分析。

2 GBS技术类型

如今已有研究开发出了多种GBS技术类型，重点集中于优化测序文库构建和DNA片段大小选择。这些测序方法在对限制性内切酶的选择、DNA片段大小范围和特定接头的使用上存在一定的差异^[17]。

通常从GBS中调用SNP数据的软件包括两类生物信息学管道：（1）不需要参考基因组的管道，如UNEAK^[18]或GBS-SNP-CROP^[19]；（2）基于参考基因组进行SNP检测的管道，如TASSEL-GBS^[20]、IGST^[8]和Fast-GBS^[21]。最近对这些工具的比较表明，两种类型的管道都可以成功地从GBS的读取数据中提取SNPs，但第二种类型的管道通常产生更多的SNPs^[22]。此外，由于检测到的SNP精确定位在参考基因组上，因此所得信息更有用。

2.1 无参考基因组的GBS管道

对于一些缺乏参考基因组的高度杂合多倍体（四倍体和八倍体）植物物种，早期的检测SNP的方法很难实现，如今有基于网络的UNEAK方法和GBS-SNP-CROP可高效检测出SNP，无论是否有参考基因组，都可使用任意读取长度的对端GBS数据来促进遗传表征。它们与常规的GBS操作过程相似，但在与参考基因组比对的步骤，会直接将GBS原始数据经过解析和质量过滤后的Reads来构建特定于GBS的简化表示引用，以启用GBS读取映射并促进SNP的检测。这一阶段依赖于基于相似性的聚类策略来对GBS reads进行分组，以便为全套GBS片段生成具有代表性的参考序列。而且GBS-SNP-CROP与TASSEL-UNEAK相比，该管道有较好的效果，不仅鉴定的SNP数量显著增加，而且平均读取深度增加，且大大降低了基因分型错误率^[19]。

2.2 基于参考基因组进行SNP检测的管道

现在大多数研究是基于物种的参考基因组来进行GBS分析，但会根据研究的物种去选择合适的限制性内切酶，以及选择合适的参数，如所需的覆盖深度、读映射的质量或允许的发散度等，以获得成功的映射^[21]。而且尽管有些GBS生物信息学管道是为具有参考基因组的物种设计的，但可以使用由许多contigs组成的不完整基因组组装作为替代参考^[20]。

3 GBS研究及应用进展

3.1 构建高密度遗传图谱

连锁图谱的构建对于植物遗传研究和标记辅助育种计划至关重要^[23]。GBS可以产生高密度的连锁图谱，特别是在缺乏广泛基因组资源的非模式物种中。通常可以利用GBS技术对植物群体进行全基因组SNP检测和基因分型，生成单种群连锁图谱，并使用共同的SNP标记作为桥梁，将它们合并成一个高密度的综合遗传图谱^[24-25]。

3.2 遗传多样性研究

GBS可精确检测种群和野生种群亲缘关系的杂合SNP，尤其是应用于农作物和其他树种上，已成功应用于玉米Zea mays、水稻Oryza sativa、大豆Glycine max、马铃薯Solanum tuberosum、大麦Hordeum vulgare、小麦Triticum aestivum、绿豆Vigna radiata、木薯Manihot esculenta、乌头叶豇豆Vigna aconitifolia、黄秋葵Abelmoschus esculentus、马尾松Pinus massoniana、宽杯杜鹃Rhododendron sinofalconeri、落叶松属Larix spp.等物种的遗传多样性研究中^[8,10,26-38]，为获取品质优良的高产品种和抗性育种提供理论依据。

近年来，GBS在动物遗传多样性的研究也逐渐增多，已成为家畜等常见动物基因分型的一种经济实惠的替代方法。例如，利用GBS揭示了来自秘鲁安第斯山脉6个不同地区传统饲养的豚鼠种群遗传多样性和遗传距离^[39]；采用GBS技术对三角鲂Megalobrama terminalis、翘嘴鲌Culter alburnus、蒙古鲌C. mongolicus及其杂交子代的遗传结构进行分析，为鲂鲌鱼类的杂交选育提供更多的遗传学数据^[40]。

此外，GBS应用于昆虫遗传多样性的研究领域越来越广泛，特别是亚种以下的鉴定，例如使用GBS来检测新西兰石蝇种群（Zelandoperla fenestrata, Z. tillyardi和Z. pennulata）的全翅和退化翅个体的SNP位点，发现几个群体的基因组中可能存在形态类型之间的高度分化^[41]；利用GBS技术并结合声学和生态学数据对枯蝉Subpsaltria yangi不同地理种群的遗传分化和适应性分化等进行研究^[42]；采用GBS研究巴西和阿根廷农业区的草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda种群的遗传多样性等^[43]。

3.3 种质鉴定

GBS适用于对基因组复杂且未测序的植物种质进行分子鉴定。有学者利用GBS分析了24个不同黄芥子Sinapis alba品种的遗传多样性，发现品种之间、黄籽类型和黑籽类型之间存在变异，这体现了GBS在植物种质基因组鉴定中的实用性，也揭示了精英育种品系之间的遗传关系，对黄芥改良的亲本选择具有价值意义^[44]。

4 结语

在过去的10多年里，基因测序技术研究取得了显著的进展，特别是随着第二代测序技术的快速发展，以高通量、高精度、低成本的方式提供了很多分析DNA和RNA的技术工具。这种变革性技术迅速推动了基因组学在各个领域的进步。GBS是一种有发展前景、低成本且可靠的常规筛选技术，随着样品制备方法的改进、测序深度的增加、单碱基测序成本的降低，GBS的可靠性与实用性在逐步提高，该技术展现出巨大的潜力，为基因组资源相对匮乏的非模式作物的构建和基因库的筛选提供强有力的支持，同时实现动物或植物亚种之间的快速精准鉴定。

参考文献

[1] Satam H, Joshi K, Mangrolia U, et al. Next-generation sequencing technology: Current trends and advancements[J]. Biology-Basel, 2023, 12(7): 997.

[2] Ronaghi M, Karamohamed S, Pettersson B, et al. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 242(1): 84-89.

[3] Rothberg J M, Hinz W, Rearick T M, et al. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing[J]. Nature, 2011, 475(7356): 348-352.

[4] Slatko B E, Gardner A F, Ausubel F M. Overview of Next-generation sequencing technologies[J]. Current Protocols in Molecular Biology, 2018, 122(1): e59.

[5] Pervez M T, Hasnain M, Abbas S H, et al. A comprehensive review of performance of next-generation sequencing platforms[J]. Biomed Research International, 2022, 2022: 3457806.

[6] Elshire R J, Glaubitz J C, Sun Q, et al. A robust, simple genotyping-by-sequencing (GBS) approach for high diversity species[J]. PLoS One, 2011, 6(5): e19379.

[7] Davey J W, Hohenlohe P A, Etter P D, et al. Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation sequencing[J]. Nature Reviews Genetics, 2011, 12(7): 499-510.

[8] Sonah H, Bastien M, Iquira E, et al. An improved genotyping by sequencing (GBS) approach offering increased versatility and efficiency of SNP discovery and genotyping[J]. PLoS One, 2013, 8(1): e54603.

[9] Velmurugan J, Mollison E, Barth S, et al. An ultra-high density genetic linkage map of perennial ryegrass (Lolium perenne) using genotyping by sequencing (GBS) based on a reference shotgun genome assembly[J]. Annals of Botany, 2016, 118(1): 71-87.

[10] 张序, 张秀姣, 马永鹏, 等. 基于GBS简化基因组技术的宽杯杜鹃遗传多样性分析[J]. 植物研究, 2021, 41(3): 429-435.

[11] Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data[Z]. Cambridge, United Kingdom, 2010.

[12] Li H, Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform[J]. Bioinformatics, 2010, 26(5): 589-595.

[13] Li H, Handsaker B, Wysoker A, et al. The sequence alignment/map format and SAMtools[J]. Bioinformatics, 2009, 25(16): 2078-2079.

[14] Rimmer A, Phan H, Mathieson I, et al. Integrating mapping-, assembly-and haplotype-based approaches for calling variants in clinical sequencing applications[J]. Nature Genetics, 2014, 46(8): 912-918.

[15] Danecek P, Auton A, Abecasis G, et al. The variant call format and VCFtools[J]. Bioinformatics, 2011, 27(15): 2156-2158.

[16] Team R C. R: A language and environment for statistical computing[J]. MSOR Connections, 2014, 1.

[17] 徐千淯. 马尾松GBS文库限制性内切酶优化及SNP标记开发研究[D]. 长沙: 中南林业科技大学, 2023.

[18] Lu F, Lipka A E, Glaubitz J, et al. Switchgrass genomic diversity, ploidy, and evolution: novel insights from a network-based SNP discovery protocol[J]. PLoS Genetics, 2013, 9(1): e1003215.

[19] Melo A T, Bartaula R, Hale I. GBS-SNP-CROP: a reference-optional pipeline for SNP discovery and plant germplasm characterization using variable length, paired-end genotyping-by-sequencing data[J]. BMC Bioinformatics, 2016, 17: 29.

[20] Glaubitz J C, Casstevens T M, Lu F, et al. TASSEL-GBS: a high capacity genotyping by sequencing analysis pipeline[J]. PLoS One, 2014, 9(2): e90346.

[21] Torkamaneh D, Laroche J, Bastien M, et al. Fast-GBS: a new pipeline for the efficient and highly accurate calling of SNPs from genotyping-by-sequencing data[J]. BMC Bioinformatics, 2017, 18(1): 5.

[22] Torkamaneh D, Laroche J, Belzile F. Genome-wide SNP calling from genotyping by sequencing (GBS) data: a comparison of seven pipelines and two sequencing technologies[J]. PLoS One, 2016, 11(8): e161333.

[23] 董雨青, 魏雪苹, 强亭燕, 等. 简化基因组测序技术在植物遗传分析中的应用[J]. 中国农学通报, 2022, 38(8): 25-32.

[24] Mathiazhagan M, Elangovan D, Chinnaiyan V, et al. A high-density linkage map construction in guava (Psidium guajava L.) using genotyping by sequencing and identification of QTLs for leaf, peel, and pulp color in an intervarietal mapping population[J]. Frontiers in Plant Science, 2024, 15: 1335715.

[25] Shaha M R F, Liew L P, Zaman Q F, et al. Genotyping by sequencing for the construction of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) genetic linkage map and mapping of yield related quantitative trait loci[J]. PeerJ, 2024, 12: e16570.

[26] 刘天宇. 马尾松种子园亲本GBS-SNP开发及群体遗传多样性研究[D]. 长沙: 中南林业科技大学, 2023.

[27] Alipour H, Bai G, Zhang G, et al. Imputation accuracy of wheat genotyping-by-sequencing (GBS) data using barley and wheat genome references[J]. PLoS One, 2019, 14(1): e208614.

[28] Arbelaez J D, Moreno L T, Singh N, et al. Development and GBS-genotyping of introgression lines (ILs) using two wild species of rice, O. meridionalis and O. rufipogon, in a common recurrent parent, O. sativa cv. Curinga[J]. Molecular Breeding, 2015, 35(2): 81.

[29] Escudero M, Eaton D A, Hahn M, et al. Genotyping-by-sequencing as a tool to infer phylogeny and ancestral hybridization: a case study in Carex (Cyperaceae)[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2014, 79: 359-367.

[30] Manching H, Sengupta S, Hopper K R, et al. Phased genotyping-by-sequencing enhances analysis of genetic diversity and reveals divergent copy number variants in maize[J]. G3-Genes Genomes Genetics, 2017, 7(7): 2161-2170.

[31] Poland J A, Brown P J, Sorrells M E, et al. Development of high-density genetic maps for barley and wheat using a novel two-enzyme genotyping-by-sequencing approach[J]. PLoS One, 2012, 7(2): e32253.

[32] Su C, Wang W, Gong S, et al. High density linkage map construction and mapping of yield trait QTLs in maize (Zea mays) using the genotyping-by-sequencing (GBS) technology[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 706.

[33] Uitdewilligen J G, Wolters A M, D’Hoop B B, et al. A next-generation sequencing method for genotyping-by-sequencing of highly heterozygous autotetraploid potato[J]. PLoS One, 2013, 8(5): e62355.

[34] Kohli M, Bansal H, Mishra P G, et al. Genome-wide association studies for earliness, MYMIV resistance, and other associated traits in mungbean (Vigna radiata L. Wilczek) using genotyping by sequencing approach[J]. PeerJ, 2024, 12: e16653.

[35] Orek C, Kyallo M, Oluwaseyi S, et al. Genotyping by sequencing reveals genetic relatedness and duplicates amongst local cassava (Manihot esculenta Crantz) landraces and improved genotypes in Kenya[J]. Biotechnology Journal International, 2023, 27(5): 29-46.

[36] Kumar A Y, Kumar C S, K. R K, et al. Genetic diversity, population structure, and genome-wide association study for the flowering trait in a diverse panel of 428 moth bean (Vigna aconitifolia) accessions using genotyping by sequencing[J]. BMC Plant Biology, 2023, 23(1): 228.

[37] Jian S, Gaowen X, Yudie H, et al. Genome-wide assessment of genetic diversity and association mapping for salt tolerance traits in okra (Abelmoschus esculentus L. Moench) using genotyping-by-sequencing[J]. Scientia Horticulturae, 2023, 313.

[38] Haupt S, Bernhardt N, Killing S, et al. Biogeography of larches in eastern Siberia-using single nucleotide polymorphisms derived by genotyping by sequencing[J]. Ecography, 2024, 7.

[39] Borja Lozano V M, Vigil Santillán B, More Montoya J M, et al. Genotyping-by-sequencing reveals a high number and quality of single nucleotide polymorphisms in guinea pigs (Cavia porcellus) from the Peruvian Andes[J]. Animal Genetics, 2023, 54(6): 792-797.

[40] 刘凯, 冯晓宇, 沈玉帮, 等. 基于基因分型测序(GBS)技术分析鲂鲌鱼类及其杂交子代的遗传结构[J]. 水产学报, 2021, 45(8): 1307-1316.

[41] Veale A J, Foster B J, Dearden P K, et al. Genotyping-by-sequencing supports a genetic basis for wing reduction in an alpine New Zealand stonefly[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 16275.

[42] 刘雲祥. 四种中国蝉科昆虫谱系地理学研究暨枯蝉适应性进化研究[D]. 咸阳: 西北农林科技大学, 2020.

[43] Ishizuka T K, Cordeiro E, Alves-Pereira A, et al. Population genomics of fall armyworm by genotyping-by-sequencing: Implications for pest management[J]. PLoS One, 2023, 18(4): e284587.

[44] Fu Y, Cheng B, Peterson G W. Genetic diversity analysis of yellow mustard (Sinapis alba L.) germplasm based on genotyping by sequencing[J]. Genetic Resources and Crop Evolution, 2014, 61(3): 579-594.

本论文由1+X合作单位资助

基金项目：重庆市科技计划项目（2022TIAD-GPX0186）；海关总署科研项目（2020HK176）

第一作者：覃海文（1993—），女，壮族，广西河池人，博士，农艺师，主要从事植物检疫工作，E-mail: qinhaiwen17@126.com

通信作者：石娟（1979—），女，汉族，山西新绛人，博士，教授，主要从事植物检疫工作，E-mail: BJshijuan@bjfu.edu.cn

1. 重庆海关技术中心 重庆 400020

2. 国家中药材物种鉴定及质量安全检测重点实验室（重庆） 重庆 400020

3. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

4. 北京林业大学 北京 100083

1. Chongqing Customs Technology Center, Chongqing 400020

2. State Key Laboratory for Species Identification and Quality Safety Inspection of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400020

3. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

4. Beijing Forestry University, Beijing 100083

第6卷 增刊

2024年11月

Monographs and Reviews / 专论综述

基于恒温扩增技术的病原体快速检测

研究进展

周 洁 ¹ 黄夏宁 ^1,2 卢玲敏 ¹ 万 旻 ³ 梁方芳 ¹ 梁中平 ¹ 郭 枫 ¹ 覃杨光 ^{1 *}

摘 要 本文综述了常见的恒温扩增（Isothermal Amplification Technologies，IAT）技术，包括环介导恒温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术、核酸序列扩增（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）技术、链置换扩增（Strand Displacement Amplification，SDA）技术、重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术、重组酶介导恒温扩增（Recombinase-Aided Amplification，RAA）技术等，并分别介绍了它们的原理、特点和在病原体精准检测中的应用。IAT 具有简便易行、高效灵敏等优点，可在现场条件下快速检测病原体。本文聚焦于IAT在病原体检验中的应用，可为口岸检疫工作的理论研究和实践应用提供参考。

关键词 核酸检测；恒温扩增技术；病原体快速检测；口岸检疫

Advances in Isothermal Amplification Technologies for Rapid Detection of Pathogens

ZHOU Jie¹ HUANG Xia-Ning^1,2 LU Ling-Min¹ WAN Min³ LIANG Fang-Fang¹

LIANG Zhong-Ping¹ GUO Feng¹ QIN Yang-Guang^1*

Abstract This article reviews the common Isothermal Amplification Technologies (IATs), including Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP), Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA), Strand Displacement Amplification (SDA), Recombinase Polymerase Amplification (RPA), and Recombinase-Aided Amplification (RAA). It details their principles, characteristics, and applications in the precise detection of pathogens. IATs, characterized by their simplicity, convenience, efficiency, and sensitivity, offer a robust platform for rapid pathogen detection under field conditions. This review focuses on the application of IATs in pathogen detection and aims to provide reference for the theoretical research and practical application of port quarantine.

Keywords nucleic acid detection; isothermal amplification technologies; rapid pathogen detection; port quarantine

本论文由热带病监测1+X研究室资助

基金项目：海关总署科研项目（2024HK035）；中国海关科学技术研究中心自立科研课题（2024HX09，2024HX12）；广西壮族自治区卫健委西药类别自筹经费科研课题（Z-A20241171）

第一作者：周洁（1994—），女，汉族，广西河池人，博士，主要从事口岸卫生检疫工作，E-mail: zhoujie283@outlook.com

通信作者：覃杨光（1967—），男，壮族，广西贵港人，本科，主要从事卫生检疫工作，E-mail: 1227875939@qq.com

1. 广西国际旅行卫生保健中心（南宁海关口岸门诊部） 南宁 530028

2. 广西纳米抗体重点实验室/广西纳米抗体工程研究中心 南宁 530021

3. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

1. Guangxi International Travel Health Care Centre (Port Clinic of Nanning Customs District), Nanning, Guangxi 530028

2. Guangxi Key Laboratory of Nanobody Research/Guangxi Nanobody Engineering Research Center, Nanning 530021

3. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

核酸作为生物体遗传密码的基本物质，在生物识别领域扮演着至关重要的角色。脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）和核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）两种主要类型的核酸，凭借着互补配对的特性以及与离子、激素、蛋白质甚至整个细胞的高亲和力，已成为分子诊断和生物研究领域不可或缺的生物标志物。近几十年来，分子诊断技术突飞猛进^[1]，而其中大部分方法都依赖于核酸扩增（Nucleic Acid Amplifcation，NAA）技术。

核酸扩增技术是以围绕着核酸分子扩增为目的而开展的技术，根据温度变化情况，目前主要分为两大类：循环扩增（Thermocycling Amplification）和恒温扩增（Isothermal Amplification，IAT）。循环扩增技术历史悠久，应用成熟且广泛，其中最具代表性的技术是聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）。PCR利用聚合酶和特异性引物，能够对目标核酸信号进行百万倍的扩增，现已成为核酸检测领域的金标准。然而，由于其需要变温循环的特性，对温控仪器的要求较高，限制了其在基层检测中的应用。

口岸作为国家对外开放的重要窗口，是传染病防控的第一道防线。随着全球人员和货物流动日益频繁，口岸检疫工作面临着前所未有的挑战。已有研究表明，传统的检测方法在应对病原体的多样性和变异性时，存在检测速度缓慢、灵敏度较低、操作复杂等局限性^[2]。为了进一步保障国门安全，提高检疫效率，迫切需要引入更加先进、高效的检测技术。与传统PCR技术相比，IAT在现场应用中表现出更高的实用性和效率。本文系统总结了IAT的原理、分类、优缺点及在病原体检测中的应用，并探讨了IAT在口岸检疫中的应用前景，以期为推动IAT在口岸检疫领域的推广应用提供理论依据。

1 恒温扩增技术的概况

IAT是一种无需热循环仪即可在恒定温度下进行核酸扩增的技术，与传统的PCR相比，具有操作简单、快速、成本低等优点，近年来在分子诊断、病原体检测、基因分型等领域得到了广泛应用^[3-4]。IAT技术可以根据扩增机制、扩增产物和应用领域等不同标准进行分类。根据扩增机制的不同，IAT技术可分为两大类。一类是基于分析物浓度增加的IAT技术：主要包括环介导恒温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）、依赖核酸序列型扩增技术（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）、链置换扩增（Strand Displacement Amplification，SDA）、重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）和重组酶介导恒温扩增（Recombinase-Assisted Amplification，RAA）等。这类技术的特点是通过扩增产物的不断积累，使分析物的浓度得到显著提升，从而提高检测灵敏度。另一类是基于分析信号增加的IAT技术：主要包括滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）、核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大（Exonuclease Ⅲ-assisted Signal Amplification，EASA）、恒温圆链位移聚合（Isothermal Circular Strand Displacement Polymerization，ICSDP）等。这类技术的特点是将扩增产物转化为易于检测的信号，如荧光信号，从而实现灵敏的分析物检测。上述恒温扩增技术的主要特征见表1。

2 常见恒温扩增技术的种类及其应用

2.1 环介导恒温扩增（LAMP）技术

环介导恒温扩增（LAMP）技术是一种在恒温条件下以高灵敏度和特异性扩增目标DNA序列的分子生物学技术，由Nagamine等^[5]于2000年建立。该技术的核心在于利用链置换型DNA聚合酶和特异性引物设计，实现对目标DNA的高效扩增。针对目标DNA链上的6个区段，设计4个不同的引物，包括内引物（FIP/BIP）和外引物（F3/B3）。在60～65℃左右的恒温条件下，内引物与目标DNA链结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸形成新的DNA链；外引物与延伸后的DNA链结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸，形成具有哑铃结构的双链DNA；该哑铃结构DNA作为模板，在内引物和外引物的引导下进行循环扩增，最终生成大量目标DNA序列。Nagamine等^[5]通过引入两个环引物显著缩短了LAMP技术的反应时间^[5]，简化了操作流程，只需将样品DNA、引物、酶和反应缓冲液混合孵化即可，操作简便易行。

与传统PCR技术相比，LAMP具有显著的优势，使其成为核酸扩增和检测的有效工具。与需要复杂温循环操作和昂贵设备的PCR不同，LAMP可以在恒温条件下进行，使用简易仪器如水浴或加热块即可完成，操作简便易行^[6]。这种操作简便性源于LAMP独特的引物设计，它采用了4条引物识别靶基因中的6个特异性序列，从而确保了扩增反应的高特异性，最大程度地降低了非特异性扩增的干扰。此外，LAMP还具有卓越的灵敏度，可将几个拷贝的靶基因扩增到10⁹个拷贝水平，这种灵敏度远超传统PCR技术，使得LAMP成为检测痕量核酸的理想选择^[7-8]。LAMP通常可在30～60 min内完成反应^[9]，能够实现快速检测和分析。此外，LAMP结果可以使用多种方法可视化^[10]，包括肉眼观察、浊度分析、荧光检测和电泳，提供直观易懂的结果。

近年来，LAMP技术凭借其简单、快速、灵敏等优点，在多领域得到了广泛应用，尤其是在病原体检测方面展示出巨大潜力。早在2003年，LAMP技术就成功应用于流感病毒H5亚型的检测^[11]。在呼吸道传染病流行期间，LAMP技术为疾病的快速诊断提供了一种新的解决方案，整个检测流程不超过30 min，灵敏度高，特异性良好，可用于人群感染筛查^[12]。与传统的PCR技术相比，LAMP技术在检测疟原虫^[13]、真菌^[14]、耐药菌^[15]等病原体方面展现出更高的灵敏度和特异性，且操作更简便，更适合现场快速检测。随着技术的不断进步，LAMP技术的便携式、微型化、多重检测等新技术的开发，也将进一步提升LAMP技术的实用性和推广价值。

2.2 依赖核酸序列型扩增（NASBA）技术

依赖核酸序列型扩增（NASBA）技术由Compton^[16]于1991年建立，是一种基于转录依赖扩增系统的恒温扩增技术^[16]，它利用T7 RNA聚合酶、RNase H和AMV逆转录酶3种酶的活性和一对特异性引物，在恒温条件下进行核酸扩增^[17]。NASBA 是一种核酸扩增技术，主要用于 RNA 序列检测，但也可用于 DNA 检测，其工作原理是通过逆转录酶将 RNA 模板转录为互补DNA（ Complementary DNA，cDNA），再利用 T7 RNA聚合酶进行扩增。NASBA 与转录介导扩增 （Transcription-Mediated Amplification，TMA）同属恒温扩增方法，两者均采用逆转录酶合成 cDNA。两者的关键区别在于 NASBA 额外使用了核糖核酸酶 H降解 RNA 模板，提高了扩增效率和特异性。NASBA的主要步骤如下：利用逆转录酶将目标RNA转化为cDNA；T7 RNA聚合酶以cDNA为模板合成RNA反链；RNase H降解RNA反链，只剩下cDNA链；AMV逆转录酶利用cDNA链为模板合成新的cDNA链，并作为下一轮循环的模板。

NASBA技术与传统的PCR扩增技术相比具有以下优势：（1）NASBA在恒温条件下进行，无须热循环仪，可以在实验室外进行操作，更加灵活便捷；（2）实验可在41 ℃恒温条件下进行，经过1.5～2 h的扩增可将模板RNA放大至10⁹倍，扩增效率是PCR技术的1000倍以上^[18]；（3）可以扩增RNA和DNA模板，为检测RNA病毒和DNA病原体提供了有效工具^[19]；（4）受样品中其他物质的影响较小，扩增产物特异性强，可降低检测假阳率。

得益于上述优势，NASBA技术已被广泛应用于医学、农业等领域。例如，除了用于检测丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）^[20]、人免疫缺陷病毒Ⅰ型（Human Immunodeficiency Virus-1，HIV-1）^[21]等病毒、结核杆菌^[22]等细菌，还可用于检测植物病原体，如苹果锈果类病毒^[23]、肉类和牛奶中的沙门氏菌^[24]等；同样适用于检测水体、空气中的微生物^[25-26]等。NASBA技术的应用不仅限于传统实验室环境，研究人员已将其集成到微型化芯片实验室系统中，用于检测大肠杆菌O157:H7，该技术可在纳米级体积内实现了对荧光染料进行实时监测，大幅提高了检测效率和灵敏度^[27]。

2.3 链置换扩增（SDA）技术

链置换扩增（SDA）技术是由Walker等^[29-30]在1992年首次提出，是一种具有独特优势的恒温扩增技术^[28-29]。与传统的聚合酶链反应PCR技术相比，SDA技术无须预先加热变性模板DNA，也不需要复杂的热循环条件，操作简单，基本原理是利用特异性识别的限制性核酸内切酶在靶DNA的识别位点处切开双链DNA，形成缺口结构，在恒温条件下，具有链置换活性的DNA聚合酶以缺口为起点，沿3'方向延伸并置换下游链，实现靶DNA的指数扩增。具体而言，SDA技术的扩增过程可分为以下3个阶段：将靶DNA或RNA与特异性引火链（Priming Strand）进行退火杂交，引火链的3'端与靶核酸的5'端相配对，并留有一段未匹配的3'末端；DNA聚合酶沿引火链的3'末端进行延伸，合成新的DNA链；新合成的DNA链与靶核酸发生链置换反应，将靶核酸的原始链置换下来，形成新的双链DNA。在DNA聚合酶和限制内切酶的作用下，上述3个阶段可以重复循环进行，实现靶核酸的指数扩增。

SDA技术在病原体快速鉴定方面展现出广阔的应用前景。研究人员将SDA技术与压电DNA传感器技术相结合，成功研制了一种新型的SDA压电DNA传感器。该传感器在33份临床样本中对铜绿假单胞菌的检测表现出与荧光定量PCR一致的结果，但速度和灵敏度均显著优异^[18]。此外，SDA还可用于结核杆菌^[30-31]、流感病毒^[32]、HIV病毒^[33]等多种病原体。SDA技术的应用不仅限于病原体鉴定，还可扩展至mRNA和miRNA的检测。Hellyer等^[34]指出，与DNA和rRNA相比，mRNA的存在更能指示治疗性诊断的有效性^[34]。Shi等^[35]则开发了一种基于缺口酶和两个引物的策略，使miRNA靶点触发两次切割、聚合和位移反应，实现目标miRNA的指数级扩增，并生成可通过实时PCR中SYBRGreenI检测到的双链DNA^[36]。因此，SDA技术凭借其灵活性，可检测多种类型的核酸，成为病原体鉴定、基因表达分析等领域的重要工具。

2.4 重组酶聚合酶扩增（RPA）技术

重组酶聚合酶恒温扩增（RPA）技术是Piepenburg等^[36]于2006年开发并获得专利的一项恒温核酸扩增的技术^[36]，原理是通过重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶等多种蛋白酶，在恒温条件下（通常为37～42℃）对目标DNA进行指数级扩增。RPA无须加热和降温循环，可在恒温条件下进行扩增，操作简单，仪器设备要求低；扩增速度快，通常可在30 min内完成扩增，且灵敏度高，可检测到极少量的目标DNA。

RPA的反应主要分为以下几个步骤：UvsX重组酶蛋白与RPA引物结合形成复合物，并沿着DNA模板扫描识别同源序列；识别成功后，UvsX蛋白将引物插入模板链，形成D环（D-loop）结构；DNA聚合酶与引物的3'端结合，在dNTPs的存在下延伸链，并生成新的互补链；取代的模板链会与单链结合蛋白结合，维持单链的稳定性，防止插入的引物通过支链迁移而被排出；DNA聚合酶与引物的3'端结合，在dNTPs的存在下延伸链，并生成新的互补链^[37]。

目前，RPA已成功应用于检测多种病原体的检测。Rostron等^[38]利用RPA技术开发了一种针对基因组重复区检测血吸虫的荧光检测方法，灵敏度和特异性均优于传统方法^[38]；Hu等^[39]建立了一种基于RPA的LFD超灵敏检测大肠杆菌O157:H7的新方法，检测限低至4.4×10³ CFU/mL，显著优于PCR方法，为食品样品中大肠杆菌的检测提供了更为高效的工具^[39]。基于反转录RPA结合侧向流动试纸技术（RT-RPA-LFD）的RSV检测方法可同时检测RSV的A和B亚型，灵敏度达到10 copies/μL，并以可视化方式呈现结果，特异性强。RPA技术的优势体现在快速简便、设备通用和容错率高。容许碱基错配这一特点虽然有利于快速检测基因变异，但同时也带来了非特异性扩增的风险^[40]。RPA技术的独特优势使其十分适用于条件有限下的现场检测，因此有望成为强大的现场即时检测工具。

2.5 重组酶介导恒温扩增（RAA）技术

重组酶辅助扩增（RAA）是一种新型的核酸扩增技术，它利用来自大肠杆菌的重组酶RecA促进引物与目标DNA模板之间的同源链配对，并与单链结合蛋白和DNA聚合酶形成复合体，在恒温条件下进行核酸扩增^[41]。与RPA相似，RAA也具有快速便捷、高灵敏、高特异性等优点，两种技术在原理上也存在一些相似之处，但也有以下差异：RAA使用的是来自大肠杆菌的重组酶RecA，RPA使用的是T4噬菌体来源的重组酶；RAA反应需要RecA蛋白，而RPA反应不需要。目前，RAA技术在流感病毒^[42-43]、人类乳头瘤病毒^[44]、沙门氏菌^[45]、气单胞菌属^[46]等病原体的检测方面取得了较多的研究成果。随着研究的深入，RAA技术的灵敏度、特异性、反应速度等性能将进一步提高，其应用范围也将不断拓展。

2.6 其他恒温扩增技术

除了上述技术之外，还有其他几种恒温扩增技术在病原体检测领域也得到了广泛应用。滚环扩增（RCA）技术仿照自然界中环状DNA的复制机制，在恒温条件下（约30℃），以环状DNA为模板，利用DNA聚合酶不断合成与模板互补的长链DNA^[47-48]。RCA技术具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，近年来被广泛应用于多种病原体检测，包括李斯特菌^[49]、沙门菌^[50]、埃博拉病毒^[51]和流感病毒^[52]等。核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大（EASA）是一种不改变分析物浓度，而是通过酶促反应实现信号放大的技术。EASA技术利用外切酶Ⅲ的非特异性3'→5'外切酶活性，逐步去除DNA探针3'末端的单核苷酸，如果探针标记有报告基团（如荧光染料），则分析物释放后，报告基团会脱离淬灭基团，产生明显的光信号^[9]。EASA技术可用于检测多种核酸，包括DNA^[53]、RNA^[54]和miRNA^[55]。恒温圆链位移聚合技术（ICSDP）是一种于2009年提出的恒温扩增技术，反应体系简单，仅需发卡DNA探针、短引物和DNA聚合酶即可实现信号放大^[56]，目前已在多种检测领域中得到了应用^[57-58]。

3 总结和展望

随着国际交流与合作的日益密切，口岸病原体传入风险也有所上升。传统的病原体检测方法在灵敏度、检测速度和操作便捷性方面存在一定的局限性，难以满足口岸日益增长的检疫需求。因此，开发更加高效、精准的检测技术迫在眉睫。IAT技术的引入为口岸检疫提供了全新的检测思路，可在30 min至1 h内完成核酸扩增，显著提高了检测效率，对口岸检疫工作具有重要意义。此外，IAT技术具有高灵敏度和特异性，能够检测到极低浓度的病原体核酸，这对于口岸传染病的预防具有重要意义。便携性和现场检测也是IAT技术的一大优势，便携式设备的开发使得IAT技术能够在资源有限的口岸环境中应用，提供即时检测结果，提升检疫效率。同时，IAT技术可以实现多重检测，即在一次反应中同时检测多种病原体，这对于应对多种潜在威胁的口岸检疫尤为重要。IAT技术突破了传统检测方法的局限性，展现出快速便捷、灵敏精准和广谱性强的优势，使其成为快速检测和现场检测的理想技术手段，在入境人员健康筛查和进出口货物检疫等多个口岸检疫环节展现出广阔的应用前景。

但与此同时，IAT技术也面临一些挑战。该技术虽然具有高特异性，但在实际操作中可能会出现非特异性扩增的问题，导致假阳性结果，从而影响检测的准确性。此外，口岸环境较为复杂，样品来源多样且可能受到污染，这对IAT技术的灵敏度和特异性提出了更高要求，而且IAT技术在不同实验室和应用场景中的标准化程度不高，可能导致结果的可比性和重复性较差。因此，建立统一的技术标准和操作规范，以确保检测结果的一致性和可靠性，是亟待解决的问题。虽然IAT技术在设备和操作上要求相对简单，但试剂和耗材的成本较高。通过技术改进和规模化生产降低成本，将有助于促进IAT技术的广泛应用。目前，IAT技术仍处于起步阶段，标准化、规范化、商品化等方面亟待完善，需要加强研究，不断提高技术的性能和稳定性，以完善相关标准和规范。

综上所述，IAT技术在口岸检疫中的应用，能够提升检测效率和准确性。然而，仍需持续攻关，克服一些技术和应用上的局限性，以充分发挥其潜力，为口岸检疫工作提供更为有效的技术支持。

参考文献

[1] Martzy R, Kolm C, Krska R, et al. Challenges and Perspectives in the Application of Isothermal DNA Amplification Methods for Food and Water Analysis[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2019, 9: 1695-1702.

[2] Liu Q, Jin X, Cheng J, et al. Advances in the Application of Molecular Diagnostic Techniques for the Detection of Infectious Disease Pathogens (Review)[J]. Molecular Medicine Reports, 2023, 5.

[3] Srivastava P, Prasad D. Isothermal Nucleic Acid Amplification and its Uses in Modern Diagnostic Technologies[J]. 3 Biotech, 2023, 6: 200.

[4] Chang C, Chen C, Wei S, et al. Diagnostic Devices for Isothermal Nucleic Acid Amplification[J]. Sensors, 2012, 6: 8319-8337.

[5] Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated Reaction by Loop-Mediated Isothermal Amplification Using Loop Primers[J]. Molecular and Cellular Probes, 2002, 3: 223-229.

[6] 杨柳, 张一, 边忠博, 等. Lamp技术在食源性致病菌检测中的应用现状[J]. 食品安全导刊, 2016, 12: 103.

[7]张海艳. 环介导等温扩增技术及其在食品检测中的应用[J]. 安徽农学通报, 2018, 21: 41-43.

[8] 王静, 许鑫, 王雪雨, 等. 环介导等温扩增技术检测食品安全的研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2018, 11: 84-91.

[9] Bodulev OL, Sakharov IY. Isothermal Nucleic Acid Amplification Techniques and their Use in Bioanalysis[J]. Biochemistry (Moscow), 2020, 2: 147-166.

[10] 李向梅, 刘志威, 陈晓敏, 等. 食品安全免疫层析检测技术研究进展[J]. 食品安全质量检测学报, 2020, 15: 4939-4955.

[11] Imai M, Ninomiya A, Minekawa H, et al. Rapid Diagnosis of H5N1 Avian Influenza Virus Infection by Newly Developed Influenza H5 Hemagglutinin Gene-Specific Loop-Mediated Isothermal Amplification Method[J]. Journal of Virological Methods, 2007, 2: 173-180.

[12] 殷宏, 金涌, 邹明强, 等. 建立新型冠状病毒实时荧光逆转录环介导等温扩增快速检测方法[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2020, 6: 381-384+392.

[13] Mohon AN, Toppings N, Castaneda-Mogollon D, et al. Ultrasensitive Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal Amplification (US-LAMP)-Based Detection of Malaria Infection From Dried Blood Spots[J]. Methods in Molecular Biology, 2023: 325-337.

[14] Zhang X, Xu G, Tang H, et al. Development of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for the Rapid Detection of Alternaria Alternata[J]. Journal of Aoac International, 2017, 1: 99-103.

[15] Abusheraida N, AlBaker A, Aljabri A, et al. Rapid Visual Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus in Human Clinical Samples Via Closed LAMP Assay Targeting MecA and Spa Genes[J]. Microorganisms, 2024, 1: 157.

[16] Compton J. Nucleic Acid Sequence-Based Amplification[J]. Nature, 1991, 6313: 91-92.

[17] Zhai L, Liu H, Chen Q, et al. Development of a Real-Time Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Assay for the Rapid Detection of Salmonella Spp. From Food[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2019, 1: 255-261.

[18] 梁海燕, 刘文鑫, 杨志刚. 等温核酸扩增技术进展[J]. 中国医学创新, 2017, 16: 145-148.

[19] Ivanov AV, Safenkova IV, Zherdev AV, et al. The Potential Use of Isothermal Amplification Assays for in-Field Diagnostics of Plant Pathogens[J]. Plants-Basel, 2021, 11: 2424.

[20] Guichon A, Chiparelli H, Martinez A, et al. Evaluation of a New NASBA Assay for the Qualitative Detection of Hepatitis C Virus Based On the NucliSens Basic Kit Reagents[J]. Journal of Clinical Virology, 2004, 2: 84-91.

[21] Bremer J, Nowicki M, Beckner S, et al. Comparison of Two Amplification Technologies for Detection and Quantitation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA in the Female Genital Tract. Division of AIDS Treatment Research Initiative 009 Study Team[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2000, 7: 2665-2669.

[22] Telenti A, Marchesi F, Balz M, et al. Rapid Identification of Mycobacteria to the Species Level by Polymerase Chain Reaction and Restriction Enzyme Analysis[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1993, 2: 175-178.

[23] Heo S, Kim HR, Lee HJ. Development of a Quantitative Real-Time Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) Assay for Early Detection of Apple Scar Skin Viroid[J]. Plant Pathology Journal, 2019, 2: 164-171.

[24] Zhai L, Liu H, Li J, et al. A Duplex Real-Time NASBA Assay Targeting a Serotype-Specific Gene for Rapid Detection of Viable Salmonella Paratyphi C in Retail Foods of Animal Origin[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2022, 4: 259-268.

[25] Brenier-Pinchart M, Abaibou H, Berendsen T, et al. Usefulness of Pan-Fungal NASBA Test for Surveillance of Environmental Fungal Contamination in a Protected Hematology Unit[J]. Medical Mycology (Oxford), 2014, 4: 433-437.

[26] Hønsvall BK, Robertson LJ. Real-Time Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) Assay Targeting MIC1 for Detection of Cryptosporidium Parvum and Cryptosporidium Hominis Oocysts[J]. Experimental Parasitology, 2017: 61-67.

[27] Wang J, Kreutz JE, Thompson AM, et al. SD-Chip Enabled Quantitative Detection of HIV RNA Using Digital Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (DNASBA)[J]. Lab On a Chip, 2018, 22: 3501-3506.

[28] Walker GT, Fraiser MS, Schram JL, et al. Strand Displacement Amplification--An Isothermal, in Vitro DNA Amplification Technique[J]. Nucleic Acids Research, 1992, 7: 1691-1696.

[29] Walker GT, Little MC, Nadeau JG, et al. Isothermal in Vitro Amplification of DNA by a Restriction Enzyme/DNA Polymerase System[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 1: 392-396.

[30] Walker GT, Nadeau JG, Linn CP, et al. Strand Displacement Amplification (SDA) and Transient-State Fluorescence Polarization Detection of Mycobacterium Tuberculosis DNA[J]. Clinical Chemistry, 1996, 1: 9-13.

[31] McHugh TD, Pope CF, Ling CL, et al. Prospective Evaluation of BDProbeTec Strand Displacement Amplification (SDA) System for Diagnosis of Tuberculosis in Non-Respiratory and Respiratory Samples[J]. Journal of Medical Microbiology, 2004, Pt 12: 1215-1219.

[32] Lee H, Kim DM, Kim DE. Label-Free Fluorometric Detection of Influenza Viral RNA by Strand Displacement Coupled with Rolling Circle Amplification[J]. Analyst, 2021, 24: 8002-8007.

[33] Deng X, Wang C, Gao Y, et al. Applying Strand Displacement Amplification to Quantum Dots-Based Fluorescent Lateral Flow Assay Strips for HIV-DNA Detection[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2018: 211-217.

[34] Hellyer TJ, DesJardin LE, Teixeira L, et al. Detection of Viable Mycobacterium Tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of MRNA[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1999, 3: 518-523.

[35] Shi C, Liu Q, Ma C, et al. Exponential Strand-Displacement Amplification for Detection of MicroRNAs[J]. Analytical Chemistry (Washington), 2014, 1: 336-339.

[36] Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, et al. DNA Detection Using Recombination Proteins[J]. Plos Biology, 2006, 7: e204.

[37] Lobato IM, O’Sullivan CK. Recombinase Polymerase Amplification: Basics, Applications and Recent Advances[J]. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 2018: 19-35.

[38] Reboud J, Xu G, Garrett A, et al. Paper-Based Microfluidics for DNA Diagnostics of Malaria in Low Resource Underserved Rural Communities[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2019, 11: 4834-4842.

[39] Hu J, Wang Y, Su H, et al. Rapid Analysis of Escherichia Coli O157:H7 Using Isothermal Recombinase Polymerase Amplification Combined with Triple-Labeled Nucleotide Probes[J]. Molecular and Cellular Probes, 2020: 101501.

[40] Tan M, Liao C, Liang L, et al. Recent Advances in Recombinase Polymerase Amplification: Principle, Advantages, Disadvantages and Applications[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2022: 1019071.

[41] 毛迎雪, 刘蒙达, 张皓博, 等. 重组酶介导等温扩增技术(Raa)在病原微生物检测中的应用进展[J]. 中国动物检疫, 2024, 01: 60-66.

[42] 安柏霖, 郭悦, 刘丹丹, 等. 逆转录重组酶介导的等温扩增技术快速检测甲型H1N1流感病毒[J]. 病毒学报, 2023, 1: 45-51.

[43] Wang S, Zhuang Q, Jiang N, et al. Reverse Transcription Recombinase-Aided Amplification Assay for Avian Influenza Virus[J]. Virus Genes, 2023, 3: 410-416.

[44] He A, Fang C, Ming Y, et al. Development of Field-Applicable Endogenous Internally Controlled Recombinase-Aided Amplification (EIC-RAA) Assays for the Detection of Human Papillomavirus Genotypes 6 and 11 Using Sample Releasing Agent[J]. Heliyon, 2022, 11: e11323.

[45] Wang Y, Du P, Shao Y, et al. An Innovative and Efficient Fluorescent Detection Technique for Salmonella in Animal-Derived Foods Using the CRISPR/Cas12a-HCR System Combined with PCR/RAA[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 15: 8831-8839.

[46] Lin Z, Lu J, Wu S, et al. A Novel Detection Method for the Pathogenic Aeromonas Hydrophila Expressing AerA Gene and/Or HlyA Gene Based On Dualplex RAA and CRISPR/Cas12a[J]. Frontiers in Microbiology, 2022: 973996.

[47] 高晓怡, 李景虹. 滚环扩增技术在生物传感和细胞成像领域的研究进展[J]. 中国科学:化学, 2022, 09: 1609-1626.

[48] Goo NI, Kim DE. Rolling Circle Amplification as Isothermal Gene Amplification in Molecular Diagnostics[J]. BioChip Journal, 2016, 4: 262-271.

[49] Ndraha N, Lin H, Wang C, et al. Rapid Detection Methods for Foodborne Pathogens Based On Nucleic Acid Amplification: Recent Advances, Remaining Challenges, and Possible Opportunities[J]. Food Chemistry. Molecular Sciences, 2023: 100183.

[50] Chu Z, Chen J, Zhang J, et al. Cyclic Multiple Primer Generation Rolling Circle Amplification Assisted Capillary Electrophoresis for Simultaneous and Ultrasensitive Detection of Multiple Pathogenic Bacteria[J]. Analytical Chemistry, 2024, 4: 1781-1788.

[51] Ciftci S, Neumann F, Abdurahman S, et al. Digital Rolling Circle Amplification–Based Detection of Ebola and Other Tropical Viruses[J]. The Journal of Molecular Diagnostics, 2020, 2: 272-283.

[52] 郭恒新. 基于环适体与滚环扩增的H1N1型流感病毒快速检测方法的建立与应用[D]. 华侨大学, 2021.

[53] 袁丹. 核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大荧光生物传感器检测DNA[D]. 湘潭大学, 2018.

[54] Duan R, Li T, Duan Z, et al. Near-Infrared Light Activated Nucleic Acid Cascade Recycling Amplification for Spatiotemporally Controllable Signal Amplified MRNA Imaging[J]. Analytical Chemistry, 2020, 8: 5846-5854.

[55] Wu H, Wang H, Liu Y, et al. Fluorometric Determination of MicroRNA by Using Target-Triggered Cascade Signal Amplification and DNA-Templated Silver Nanoclusters[J]. Microchimica Acta, 2019, 10: 669.

[56] Guo Q, Yang X, Wang K, et al. Sensitive Fluorescence Detection of Nucleic Acids Based On Isothermal Circular Strand-Displacement Polymerization Reaction[J]. Nucleic Acids Research, 2009, 3: e20.

[57] Xu H, Lin Y, Sun L, et al. An Integrated Target Recognition and Polymerase Primer Probe for MicroRNA Detection[J]. Talanta, 2020: 121302.

[58] Li S, Liu S, Xu Y, et al. Robust and Highly Specific Fluorescence Sensing of Salmonella Typhimurium Based On Dual-Functional Phi29 DNA Polymerase-Mediated Isothermal Circular Strand Displacement Polymerization[J]. Analyst, 2019, 16: 4795-4802.

表1 常见恒温核酸扩增技术的主要特征

Table 1 Main features of common isothermal nucleic acid amplification techniques

第6卷 增刊

2024年11月

专论综述 / Monographs and Reviews

基于纳米孔测序的病原基因组富集技术

研究进展与应用前景

黄夏宁 ^1,2 覃 鑫 ³ 周 洁 ¹ 卢玲敏 ¹ 梁方芳 ¹ 覃杨光 ¹ 郭 枫 ¹ 刘 彬 ^{4 *}

摘 要 纳米孔测序技术以其独特的单分子测序能力、无须聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增、实时测序、长读长及高灵敏度检测等优势，在病原检测领域展现出巨大潜力。本文综述了基于纳米孔测序的病原基因组富集技术的最新研究进展，包括其检测原理、宿主核酸去除与病原核酸富集技术、微生物选择性测序技术等。纳米孔测序技术不仅提高了传染病检测的速度和准确性，也为生物学、医学等领域提供了新工具，促进了学科发展。未来，随着技术的不断完善，纳米孔测序有望在传染病快速诊断、现场检测、病原体监测与溯源、新药与疫苗开发等方面发挥更重要作用，助力构建高效、精准的病原检测与响应机制。

关键词 纳米孔测序；病原基因组；核酸富集技术

Research Progress and Application Prospects of Pathogen Genome Enrichment Technology Based on Nanopore Sequencing

HUANG Xia-Ning^1,2 Qin Xin³ ZHOU Jie¹ LU Ling-Min¹

LIANG Fang-Fang¹ QIN Yang-Guang¹ GUO Feng¹ LIU Bin^4*

Abstract Nanopore sequencing technology has shown great potential in the field of pathogen detection duet to its unique advantages of single-molecule sequencing capability, PCR-free amplification, real-time sequencing, long read lengths, and high sensitivity detection. This paper reviews the latest research progress of nanopore sequencing-based pathogen genome enrichment technology, including its detection principles, host nucleic acid removal and pathogen nucleic acid enrichment techniques, and microbial selective sequencing technology. Nanopore sequencing technology not only improves the speed and accuracy of infectious disease detection but also provides new tools for biology, medicine, and other fields, promoting the development of these disciplines. In the future, with the continuous improvement of technology, nanopore sequencing is expected to play a more important role in rapid diagnosis of infectious diseases, on-site detection, pathogen monitoring and tracing, new drug and vaccine development, and other aspects, helping to build efficient and precise pathogen detection and response mechanisms.

Keywords nanopore sequencing; pathogen genome; nucleic acid enrichment technology

本论文由热带病监测1+X研究室资助

基金项目：海关总署科研项目（2024HK035）；海科中心自立科研项目（2024HX09，2024HX12）；广西壮族自治区卫健委西药类别自筹经费科研课题（Z-A20241171）

第一作者：黄夏宁（1985—），女，汉族，广西桂林人，博士，副主任医师，主要从事卫生检疫工作，E-mail: 397893122@qq.com

通信作者：刘彬（1982—），女，汉族，山东文登人，本科，工程师，主要从事卫生检疫工作，E-mail: 32686830@qq.com

1. 广西国际旅行卫生保健中心（南宁海关口岸门诊部） 南宁 530021

2. 广西纳米抗体重点实验室/广西纳米抗体工程研究中心 南宁 530021

3. 广西医科大学 南宁 530021

4. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

1. Guangxi International Travel Health Care Centre (Port Clinic of Nanning Customs District), Nanning 530021

2. Guangxi Key Laboratory of Nanobody Research/Guangxi Nanobody Engineering Research Center, Nanning 530021

3. Guangxi Medical University, Nanning 530021

4. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

传染病是全球公共卫生领域所面临的重大挑战之一。从历史上曾发生的大规模流行病到近年来频发的传染病，如严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS）、中东呼吸综合征（Middle East Espiratory Syndrome，MERS）、埃博拉病毒病（Ebola Virus Disease）等，对准确诊断和有效治疗提出了更高要求。因此，快速且精准地识别病原体，对于及时采取有效的防控措施、阻止疫情蔓延具有重要意义。

传统的病原检测方法，如培养法、免疫学检测及聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）等技术，虽然在临床诊断中发挥了重要作用，但在面对新发病原体或需要高通量、快速响应的场景时，具有一定局限性。近年来，随着高通量测序技术的飞速发展，特别是纳米孔测序技术的出现，为病原体的快速精准识别提供了新的解决方案。纳米孔测序技术以其独特的单分子测序能力和无须PCR扩增的直接测序特点，显著缩短了测序时间，提高了测序通量，降低了样本处理复杂度，在病原检测领域展现出巨大的潜力。其核心优势包括实时测序能力、长度长，以及对低丰度病原体的高灵敏度检测，这些特性使得纳米孔测序技术在应对突发传染病、复杂感染病例及病原监测等方面具有显著优势。

本文旨在综述基于纳米孔测序的病原基因组富集技术的最新研究进展，探讨其在提升传染病检测效率、促进病原体监测与溯源、加速新药与疫苗开发等方面的应用前景。通过深入分析该技术的检测原理、技术挑战、优化策略及实际案例，为传染病防控提供有力的技术支撑，助力口岸公共卫生体系构建更加高效、精准的病原检测与响应机制。

1 纳米孔测序的病原宏基因检测技术的现状分析

基于纳米孔测序技术的病原宏基因检测方法在传染病监测工作中的应用日益广泛，并在现场工作中充分展现了其实时测序、长度长、高通量等独特优势，为疫情的迅速、精准防控提供了高效支持。尽管纳米孔测序技术在疫情防控工作中展现出良好的应用前景，但在实际应用于疫情防控现场的过程中，最关键的病原基因组高效富集问题，仍然面临着样本处理、数据分析等方面的挑战。

1.1 样本处理技术的挑战

在现场实际样本中，病原体的含量往往较低，且存在大量背景微生物的干扰，这些问题限制了纳米孔测序技术在检测传染病复杂样本时的优势。在应用纳米孔技术开展病原宏基因组测序前，对样本进行有效的病原富集是提高检测灵敏度和准确性的关键步骤之一。针对不同类型的样本，需研发更高效、特异的病原富集技术，同时可去除非目标背景微生物的干扰。样本处理过程中需要考虑如何保持病原体的完整性，避免在富集过程中造成病原体核酸的丢失，充分发挥纳米孔测序技术长度长的优点。

1.2 生物信息分析的挑战

纳米孔测序会产出庞大的数据，包含丰富的生物学信息，如何对原始数据进行质量控制、去噪和校正，精准解析病原体的基因组信息，进行有效的拼接组装，是基于纳米孔测序的病原宏基因检测技术所面临的另一重要挑战。因未经培养、PCR富集等步骤，现场传染病样本中包含了大量宿主核酸，大量宿主序列会导致测序数据量的巨大浪费，增加测序成本，降低病原相对丰度，影响病原检测的灵敏度。在混合感染等情况下，样本中包含多种病原体或某些复杂基因组的病原体，增加了准确检测不同病原体的难度，需要开发更加高效和精准的生物信息学算法和分析工具。因此，研究者们在应用纳米孔技术开展病原宏基因组测序科学研究时，目前的关注重点为病原富集技术，并在样本处理、数据分析等方面进行深入广泛的研究。

2 纳米孔测序平台的病原体基因组富集技术

传统的病原体分离培养是诊断临床传染病的“金标准”，由于对病毒、非典型病原体和寄生虫培养的要求很高，阳性率低，培养期长，不利于临床快速诊断^[1]。这些病原体在大多数临床微生物学实验室中无法进行常规鉴定，研究者们据此进一步提出了开发利用分子生物学方法。基于多重聚合酶链反应的核酸检测是目前应用最广泛的病原体检测方法之一，具有周转时间短、特异性和灵敏度高、操作流程简单、成本相对较低等优点。然而，它需要对目标病原体有先验知识，且无法检测未知的病原体^[2]。由于病毒基因组的可突变性，以及可感染人类病毒的全部情况尚未被揭示，因此，对于区分密切相关的病毒物种的高度特异性的PCR检测越来越难以研发，其中所需要的试剂盒和引物，也都只能针对已知病原，无法应对罕见或新发未知病原体的检测。另外，这些方法只能有效地检测单一类型的病原体，无法满足所有类型病原体的同步检测^[3]。

2.1 宿主核酸去除技术

目前已有研究报道了使用不同的方法进行宿主核酸的去除，利用微生物与宿主细胞密度和尺寸的差异，可通过过滤、离心等物理方法进行分离；物理分离通常是纯化病毒颗粒的第一步，后续可结合核酸裂解试剂或降解试剂来进一步去除宿主DNA。这两种方式都是利用宿主细胞和目标核酸在化学性质和/或物理性质上的差异，通过不同的裂解条件选择性地破坏宿主细胞或核酸酶等有选择性地降解宿主细胞中的核酸，而不影响目标核酸的完整性和稳定性。

Charalampous等^[4]开发了一种用于宏基因组学测序的呼吸道样本制备方法，并将其纳入纳米孔宏基因组测序方案中，对呼吸道痰液和肺泡灌洗液样本的宿主核酸去除使用了一种基于皂苷的差异裂解方法。皂苷是在哺乳动物细胞使用中最广泛的裂解试剂，因为它对宿主细胞的裂解效率高，对细菌、真菌甚至无包膜的裸露病毒的影响最小^[5]。一旦质膜被裂解试剂破坏，宿主细胞中的DNA就会被释放出来。同时，该研究在样本制备过程中还使用离心法分离病原体和宿主细胞，以达到提升微生物序列占比的目的。更值得注意的是，对于已经通过皂苷和渗透休克裂解的样品，研究人员还使用热不稳定盐活性核酸酶（Heat-Labile Salt Active Nuclease，HL-SAN）使人类DNA量减少为千分之一，整个过程做到了差异裂解与核酸降解酶联合使用，以达到在最大程度上去除宿主核酸的目的。通过荧光定量PCR证明了该方法可以去除高达99.9%的宿主DNA，结合纳米孔测序对病原检测达到了96.6%的灵敏度和41.7%的特异度，并能将检测周期缩短至6 h以内^[4]。

核酸降解试剂除了上述提到的HL-SAN外，裂解后消化宿主核酸的试剂常用的还有叠氮溴化丙锭（Propidium Monoazide，PMA）。PMA具有叠氮化物基团，是一种细胞膜不渗透的DNA嵌入染料，可在黑暗中共价修饰DNA，使DNA无法进一步扩增，剩余的PMA可通过光照灭活，该特点使PMA成为了良好的DNA核酸酶替代试剂^[6]。与传统的酶降解相比，PMA具有多种优势，包括成本更低、耗时更少、样品处理步骤更少。Ayumu Ohno等^[7]利用DNA结合染料PMA和基于纳米孔原理的基因测序仪对耐药细菌进行快速分析，建立了一种可同时快速识别样本的细菌组成检测耐药菌及其耐药性特征的诊断检测技术。研发中需要注意的是，PMA无偏倚地消化暴露的DNA，基于PMA的宿主耗竭处理的选择性影响很大程度上取决于裂解方法和微生物细胞膜的通透性。

甲基化是原核生物和真核生物主要的表观遗传事件，但微生物和人类表观遗传学具有不同的特征和功能，因此可基于这一特性区分宿主核酸和病原体核酸。对于高等真核生物，5-甲基胞嘧啶是甲基化DNA的主要形式^[8]。在人体DNA中，甲基化胞嘧啶主要发生在二核苷酸（Cytosine-phosphate Guanine，CpG）的背景下，估计发生率为60%～90%^[9]。NEBNext 微生物组DNA富集试剂盒采用甲基-CpG结合蛋白结构域，自带的MBD2-Fc磁珠可与宿主甲基-CpG的双链DNA选择性结合，然后通过吸附磁珠来捕获宿主DNA。Feehery George R等^[10]使用该试剂盒后，与宿主基因组对齐的序列读长减少为五十分之一，而细菌和疟原虫的DNA序列读长增加了8～11.5倍。

除了上述提到的几种去除宿主核酸方法外，还可通过去除rRNA的方式降低宿主核酸的占比，如使用RNA探针杂交结合核酸酶、使用针对人源和线粒体rRNA的抗体等方法都可以去除rRNA。这些方法与长测序相结合可以更加有效地去除不需要的序列。

2.2 病原核酸富集技术

核酸富集是一种关键的预处理步骤，测序前需要从复杂的样品中寻找或检测特定的核酸序列，而这些序列可能是罕见的、低丰度的，或者混杂在大量非目标序列中。因此，有研究提出了靶向测序的方法。靶向测序是一种选择性富集和测序感兴趣的基因组区域或特定基因的技术。这种方法与全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）相对，后者会对整个基因组进行广泛的测序。

靶向测序最常用的方法是针对基因组中高度保守的序列区间设计针对性引物进行通用PCR扩增，从而检测临床样本中特定类型的所有微生物。通过对扩增后的PCR产物进行测序，检测临床样本中对应类型的微生物并进行病原诊断。靶向扩增技术具有高特异性、低样品要求、相对简单的实验室程序和更低的成本等优势，它们不受人类遗传信息的影响，实验工作流程和生物信息学分析都很容易标准化。纳米孔靶向测序（Nanopore Targeting Sequencing，NTS）方法将纳米孔测序技术与靶向扩增相结合，如细菌16S rRNA基因、真菌的18S rRNA和真菌内部转录间隔区。NTS有望克服培养、PCR和宏基因组二代测序的局限性^[11]。Lin等^[12]以配对方式对常规微生物检测、宏基因组二代测序和纳米孔靶向测序进行了系统比较，评估NTS在肺炎患者支气管肺泡灌洗液中的诊断价值，发现纳米孔靶向测序优于传统微生物检测，鉴定出更多的病原体，灵敏度提高了47.9%，与宏基因组二代测序相当。但是NTS比宏基因组二代测序检测效率更高，成本更低。

规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR）和CRISPR相关核酸酶组成的CRISPR-Cas系统为靶标富集提供了又一个思路。CRISPR-Cas系统经常用于高精度和准确度靶向DNA片段。主要包括两个关键成分：识别靶序列的向导RNA（guide RNA，gRNA）和切割靶序列的CRISPR相关核酸内切酶^[13]。其中，感兴趣的区域通过Cas酶切割切除，然后通过大小选择富集，但该方法的低回收率导致需要扩增才能从人类基因组富集。因此，可能受到扩增偏倚的影响，并丢失有关修饰核苷酸的任何信息。

Gilpatrick T等^[14]提出了纳米孔Cas9靶向测序（nanopore Cas9-Targeted Sequencing，nCATS）富集策略，即有选择性地将测序接头连接到由活性Cas9/向导RNA核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein Complex，RNP）产生的新鲜切割位点来富集。该方法可以同时评估单倍型分辨的单核苷酸变异（Nucleotide Variation，NV）、结构变异（Structural Variation，SV）和CpG甲基化，这使得纳米孔测序在研究或临床中使用更加广泛。

2.3 微生物选择性测序技术

Oxford Nanopore Technologies利用纳米孔测序长读长和实时数据分析，开放了一种选择性测序功能，又被称为“自适应采样（Adaptive Sampling）”^[15]。自适应采样是纳米孔测序平台独有的一种软件控制富集方法。在核酸分子进入纳米孔后，对信号进行实时分析，序列链的开头被快速映射到提供的参考序列。如果序列位于目标区域，则允许核酸分子继续测序。如果序列不是目标序列，则将核酸分子从纳米孔中弹出。选择性测序实现了实时对人或微生物序列进行判断，并通过序列弹出机制实现对特定序列的富集，为从测序层面实现病原序列富集和宿主序列去除提供了新的方法，提升纳米孔测序组测序的时效性^[16]。

选择性测序为富集宏基因组样品中感兴趣的物种提供了一种潜在的解决方案。该方法无须专门的样品制备，在建立文库时只需要简单处理，在测序控制软件上进行相关设置，对于可能无法获得专业实验室设备的研究人员来说非常便利。此外，它还保持了纳米孔测序的优势，例如速度快、读长长、使用原始纳米孔信号检测甲基化和其他表观遗传修饰，以及在现场进行实验的可能性^[17]。因此，该方法可用于去除宿主DNA或富集低丰度微生物。自适应测序可以产生比标准纳米孔测序更多的微生物相关数据^[18]。

Cheng等^[19]基于高效的选择性“人类宿主去除”自适应测序、实时物种鉴定和物种特异性抗性基因预测，将所有21个测序的临床支气管肺泡灌洗液样品的微生物序列产量提高了至少8倍，并在物种水平上准确检测了抗生素耐药基因，真正实现了从临床样本中对细菌病原体和抗生素耐药基因进行超灵敏诊断。同样地，Marquet等^[20]也证明了使用选择性“人类宿主耗竭”自适应测序方法在人类阴道样本中能高效去除人类宿主，在不改变微生物组成的情况下总测序深度增加1.70倍。还有研究基于酶的宿主耗竭与自适应测序方法相结合，发现组合方法显著富集了微生物序列，并显著增加了微生物的多样性，此结果为临床宏基因组学提供了一种新的微生物富集策略^[17]。

虽然选择性“人类宿主耗竭”自适应测序方法效果很好，但并非没有局限性。一方面，自适应采样依赖于读长，平均分子长度较高的文库的富集度更高，因此增加读长将提高目标物种的丰度；另一方面，自适应测序潜在的限制是需要固定目标基准电压源，即在开始时选择自适应采样基准电压源，并在运行过程中保持不变。但有研究提出了将贝叶斯（BOSS-RUNS）工具应用在自适应测序中，它在整个运行过程中跟踪覆盖率，并根据覆盖率或物种丰度保持自适应采样目标列表的更新，并为纳米孔测序生成动态更新的决策策略^[21]。因此，增加读长、使用BOSS-RUNS工具或即将可能出现的新的生物信息学调整等方法使自适应采样在未来更具吸引力。

3 基于纳米孔测序的病原基因组富集技术的应用前景

随着纳米孔测序技术的不断发展和完善，其在传染病快速诊断中的应用前景将更为广阔，基于纳米孔测序的病原基因组富集技术有望在未来取得更大的突破和应用进展，进一步提升测序速度和准确性，实现更快速、更精准的病原检测，为疫情防控赢得宝贵的时间窗口。

随着研究的进一步深入，基于纳米孔测序的病原基因组富集技术将不断优化和改进。当前的病原基因组富集技术仍需复杂的样本处理步骤，不仅增加了操作难度，还可能存在误差。因此，开发更加简便、高效的样本处理方法，降低技术难度，提高应用的便捷性，简化处理流程是未来技术发展的方向之一。同时，通过建立统一的技术标准，可确保不同实验室之间的数据可比性和可重复性，提高研究的整体质量和效率。

基于纳米孔测序的病原基因组富集技术将广泛应用于临床检测、疫情现场和公共卫生等诸多领域。在临床病原检测方面，基于纳米孔测序的病原基因组富集技术将实现对未知病原体的快速鉴定，为临床医生提供更加准确、全面的病原诊断信息，指导确定临床用药和治疗方案。在公共卫生监测方面，基于纳米孔测序的病原基因组富集技术可扩展应用于对环境中病原体的实时监测。通过对水源、食品、空气等环境样本的测序分析，可以及时发现潜在的病原体污染，为公共卫生决策提供科学依据。在传染病防控方面，该技术可以实现对病原体的溯源追踪，为疫情的快速响应和防控提供有力支持，并通过监测病原体的变异情况，及时发现新的耐药基因或变异菌株，为疫情防控策略的制定提供科学依据。

随着基于纳米孔测序的病原基因组富集技术的不断进步和创新应用扩展，将推动微生物组学、生态学和进化生物学等交叉学科的发展，为生命科学研究提供有力支持。与此同时，研究者们需要关注技术发展过程中可能面临的挑战和问题，如生物信息数据隐私保护、技术伦理等，确保该技术的健康、可持续发展，为人类健康和社会经济发展作出更大贡献。

参考文献

[1] Simner P J, Miller S, Carroll K C. Understanding the Promises and Hurdles of Metagenomic Next-Generation Sequencing as a Diagnostic Tool for Infectious Diseases[J]. Clinical Infectious Diseases, 2018, 66(5): 778-788.

[2] H. Chen, Y. Yin, H. Gao, et al. Clinical Utility of In-house Metagenomic Next-generation Sequencing for the Diagnosis of Lower Respiratory Tract Infections and Analysis of the Host Immune Response[J]. Clinical Infectious Diseases, 71(2020): 416-426.

[3] Geng S, Mei Q, Zhu C, et al. Metagenomic next-generation sequencing technology for detection of pathogens in blood of critically ill patients[J]. International Journal of Infectious Diseases, 2021(2): 81-87.

[4] Charalampous T, Kay G.L, Richardson H, et al. Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection[J]. Nature Biotechnology, 2019(37): 783-792.

[5] Hasan M.R., Rawat A, Tang P, et al. Depletion of human DNA in spiked clinical specimens for improvement of sensitivity of pathogen detection by next-generation sequencing[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2016(54): 919-927.

[6] Shi Y, Wang G, Lau HC, Yu J. Metagenomic Sequencing for Microbial DNA in Human Samples: Emerging Technological Advances[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(4): 2181.

[7] Ohno A, Umezawa K, Asai S, et al Rapid profiling of drug-resistant bacteria using DNA-binding dyes and a nanopore-based DNA sequencer[J]. Scientific Reports, 2021, 11(1): 3436.

[8] Willbanks A, Leary M, Greenshields M., et al. The evolution of epigenetics: From prokaryotes to humans and its biological consequences[J]. Genetics & Epigenetics, 2016(8): 825-836.

[9] Bird A.P. CpG-rich islands and the function of DNA methylation[J]. Nature, 1986(321): 209-213.

[10] R G F ,Erbay Y ,O S O , et al.A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA.[J].PloS one, 2013, 8(10): e76096.

[11] Jain M, Koren S, Miga KH, et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads[J]. Nature Biotechnology, 2018, 36(4): 338-345.

[12] Lin Q, Yao Y, Li X, et al. The application of nanopore targeted sequencing for pathogen diagnosis in bronchoalveolar lavage fluid of patients with pneumonia: a prospective multicenter study[J]. Infectious diseases (London, England), 2024, 56(2): 128-137.

[13] Littleford-Colquhoun B, Kartzinel TR. A CRISPR-based strategy for targeted sequencing in biodiversity science[J]. Molecular Ecology Resources, 2024, 24(3): e13920.

[14] Gilpatrick T, Lee I, Graham JE, et al. Targeted nanopore sequencing with Cas9-guided adapter ligation[J]. Nature Biotechnology, 2020, 38(4): 433-438.

[15] 林彦锋. 基于纳米孔测序的宿主基因组去除和病原基因组富集技术研究[D]. 北京: 军事科学院, 2023.

[16] Gan M, Wu B, Yan G, et al. Combined nanopore adaptive sequencing and enzyme-based host depletion efficiently enriched microbial sequences and identified missing respiratory pathogens[J]. BMC Genomics, 2021, 22(1): 732. DOI: org/10.1186/s12864-021-08023-0.

[17] Martin S, Heavens D, Lan Y, et al. Nanopore adaptive sampling: a tool for enrichment of low abundance species in metagenomic samples[J]. Genome Biology, 2022, 23(1): 11. DOI: org/10.1186/s13059-021-02582-x.

[18] Ong CT, Ross EM, Boe-Hansen GB, et al. Technical note: overcoming host contamination in bovine vaginal metagenomic samples with nanopore adaptive sequencing[J]. Journal of Animal Science, 2022, 100(1): 344. DOI: org/10.1093/jas/skab344.

[19] Cheng H, Sun Y, Yang Q, et al. A rapid bacterial pathogen and antimicrobial resistance diagnosis workflow using Oxford nanopore adaptive sequencing method[J]. Briefings in Bioinformatics, 2022, 23(6): 453. DOI: org/10.1093/bib/bbac453.

[20] Marquet M, Zöllkau J, Pastuschek J, et al. Evaluation of microbiome enrichment and host DNA depletion in human vaginal samples using Oxford Nanopore’s adaptive sequencing[J]. Scientific Reports, 2022, 12(1): 4000. DOI: org/10.1038/s41598-022-08003-8.

[21] Hewel C, Schmidt H, Runkel S, et al. Nanopore adaptive sampling of a metagenomic sample derived from a human monkeypox case[J]. Journal of Medical Virology, 2024, 96(5): e29610. DOI: org/10.1002/jmv.29610.