邓丛良 张伟 白子龙 杜思乐 任彤 宋春风 江伟 史喜菊

邓丛良 ¹ 张 伟 ¹ 白子龙 ¹ 杜思乐 ¹ 任 彤 ¹ 宋春风 ² 江 伟 ³ 史喜菊 ^{1 *}

摘 要 本研究采用广域照射拉曼光谱技术与簇类独立软模式法，结合多元散射校正、光谱仪降噪和波长标定降噪技术，建立了猪、牛、羊、鸡和鸭5种动物生鲜肉类的定性识别模型。结果显示，经多元散射校正、光谱仪降噪和波长标定降噪技术处理后，5种动物肉类之间分析结果具有明显的聚类趋势，在此基础上建立了5种肉类定性分类模型，对不同产地的455份原料肉样品种属进行定性鉴别，可以在3 min内快速鉴定5种动物肉类脂类成分，平均准确率达到90%以上。结果表明，拉曼光谱分析技术结合有效的数据前处理方法可对猪、牛、羊、鸭和鸡肉种属进行鉴别，与常规方法相比，检测过程简便、快速，且无损伤，适用于口岸动物肉类种属的快速无损鉴别。

关键词 拉曼光谱；检测；简便；鉴定；动物；脂类

Study on Rapid Identification Technology of Common Animal Meat Species by Raman Spectroscopy

DENG Cong-Liang¹ ZHANG-Wei¹ BAI Zi-Long¹ DU Si-Le¹

REN Tong¹ SONG Chun-Feng² JIANG-Wei³ SHI Xi-Ju^1*

Abstract This study used wide-field illumination Raman spectroscopy technology combined with cluster-independent soft pattern method, along with multiple scattering correction, spectrometer noise reduction, and wavelength calibration noise reduction techniques, to establish a qualitative identification model for five types of fresh meat from pigs, cattle, sheep, chickens, and ducks. The results showed that after treatment with multiple scattering correction, spectrometer noise reduction, and wavelength calibration noise reduction, there was a clear clustering trend in the analysis results between the five types of animal meat. Based on this, a qualitative classification model for the five types of meat was established, which could rapidly identify the species of 455 raw meat samples from different origins within 3 minutes, with an average accuracy rate of over 90%. The results indicate that Raman spectroscopy analysis technology, combined with effective data preprocessing methods, can be used for the identification of the species of pork, beef, mutton, duck, and chicken meat. Compared with conventional methods, the detection process is simple, fast, and non-destructive, suitable for rapid and non-destructive identification of animal meat species at ports.

Keywords Raman spectrum; detection; portable; identification; animal; lipids

基金项目：国家重点研发计划课题（2021YFF0703804）；北京市科技计划（Z181100009318010）

第一作者：邓丛良（1969—），男，汉族，山东海阳人，博士，研究员，主要从事进出口动植物检验工作， E-mail: Smile299@sohu.com

通信作者：史喜菊(1975—），女，汉族，山西乡宁人，博士，研究员，主要从事出入境动物检疫工作， E-mail: shixijubjciq@163.com

1. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

2. 北京化工大学 北京 100029

3. 西派特（北京）科技有限公司 北京 100195

1. China Customs Science and Technology Research Center, Beijing 100026

2. Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029

3. CSEPAT (Beijing) Technology Co., Ltd., Beijing 100195

目前，肉制品中动物源性成分的鉴别主要采用蛋白质分析法^[1]、PCR电泳分析法^[2]和实时荧光PCR方法^[3-5]，这些方法表现出更高的准确度、灵敏度和重复性，但是对仪器和人员技术要求高，对大批量样品进行筛选时耗时较长，不适宜在现场进行快速检测。拉曼光谱技术是基于非弹性散射原理建立起来的分子结构表征光学测量技术^[6]。拉曼光谱对物质的分子键和分子结构非常敏感，可以被用来表征化学物质的分子结构，鉴定其功能性分子基团，进而对分子或样品实现指纹识别。自20世纪60年代将激光引入到拉曼光谱仪作为光源以来，拉曼光谱技术得到迅速发展，其在动物肉类食品检测研究成果丰硕^[7-9]。

本研究立足于动物源性食品动物种属特性快速鉴定，以常见生鲜肉为研究对象，利用分子光谱可从分子水平上反映物质结构与信息的技术优势，建立快速、经济、简便、精准的鉴别动物种属成分鉴定技术，从而满足口岸生鲜食品快速通关的需求。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

肉类动物种属鉴别仪由中国海关科学技术研究中心、北京化工大学和西派特（北京）科技有限公司研发，激光波数为785 nm，激光功率为500 mW，光谱范围为200～3000 cm^-1，激光照射距离为0.8 cm，积分时间10 s，连续测量5次取最后一张测量谱图为样本点代表谱图。

1.2 样品

猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉为实验室样品。

1.3 方法

1.3.1 谱图数据采集方法

取厚度1～2 mm，表面积2～4 cm²的肉脂肪组织，使得激光孔恰好处于充满状态。而后，使用激光拉曼光谱仪光纤探头对准样品直接进行照射测试，收集信号，即得到样品的拉曼光谱数据。调节激光照射距离，照射积分时间、扫描点数、扫描部位等条件下获取试验样品的拉曼光谱数据，用以构建三维拉曼光谱图。

1.3.2 谱图数据分析方法

研发的拉曼光谱仪自带软件，软件基于Visual Studio 2010平台，使用微软基础类库（Microsoft Foundation Classes，MFC）框架、SQLite轻型数据库、多线程技术，实现了数据采集、消荧光、降噪、分辨率增强、存储、输出等功能。该软件可以进行动态拉曼光谱数据的二维相关分析，进而得到样品的二维相关拉曼光谱图。

2 结果与分析

2.1 拉曼光谱信号采集方法优化

2.1.1 激光照射距离

激光探头与样本间的距离会影响采集光谱的拉曼强度。如图1所示，以白条鸭背脂肪为研究对象，拉曼探头距样本分别为0.6 cm、0.7 cm、0.8 cm、0.9 cm、1.0 cm的拉曼谱图，可以看出，拉曼强度在一定范围内随着距离的增大而增强，到0.8 cm处拉曼强度最大，之后的拉曼强度随着距离的增大而减小，这表明激光探头距样品距离0.8 cm处时采集的拉曼谱图的强度最大，因此，选择0.8 cm为激光照射距离。

2.1.2 曝光积分时间

试验分别研究了曝光积分时间为5 s、10 s、20 s、30 s对拉曼光谱的影响。如图2所示，积分时间为5 s时，采集的拉曼光谱某些特征峰不明显，拉曼强度较弱，无法完全展示出脂肪信息。积分时间10 s时，采集的拉曼光谱特征峰明显，拉曼强度较强，可以较好地表达脂肪组成信息。积分时间为20 s时，虽然特征峰与特征峰强度高于积分时间为10 s时的谱图，但是在低波数区荧光效应过大，超出了仪器测量极限，并且对生物样本进行长时间激光照射，会破坏生物样本，表明积分时间20 s并不合适。因此，选用积分时间10 s作为测量肉制品样品的积分时间。

图2 不同激光照射时间获取的拉曼光谱

Fig.2 Raman spectra acquired at different laser irradiation times

2.1.3 利用荧光漂白效应抑制拉曼光谱背景信号

试验了不同的采集次数对拉曼光谱重复性的影响，分别试验了5次、10次、15次的采集次数，选取采集过程中最后2张谱图进行偏差对比。图3展示了连续测量5次、10次、15次的最后2张谱图的偏差，结果表明连续测量5次的偏差最小，因此，选定连续测量5次取最后一张谱图为该点的代表性谱图。

图3 连续测量次数的影响

Fig.3 Effect of the number of consecutive measurements

研究结果表明生鲜肉及制品的拉曼光谱采集条件：激光波数为785 nm，激光功率为500 mW，光谱范围为200～3000 cm^-1，激光照射距离为0.8 cm，积分时间10 s，连续测量5次取最后一张测量谱图为样本点代表谱图，脂肪样本以相同的测量条件采集5个不同点的拉曼光谱，以此来代表该脂肪样本的拉曼谱图。

2.2 生鲜肉种属及制品拉曼光谱信号信息提取方法的研究

2.2.1 5种动物脂肪光谱特征研究

图4中可以看到5种动物脂肪均在位置1384～1514 cm^-1、1586～1820 cm^-1、2753～3014 cm^-1相同的拉曼光谱带观察到拉曼光谱峰。1384～1514 cm^-1处对应着C-H的剪切变形，1586～1820 cm^-1处对应着C-C拉伸变形和C-O拉伸变形，2753～3014 cm^-1处对应着C-H的对称拉伸和= C-H的不对称拉伸。这些拉曼峰的位置相同，但在强度上会有差异，如在1586～1820 cm^-1处的不同物种脂肪两个峰的比值有明显的不同，这是由于物种脂肪不饱和脂肪酸（Unsaturated Fatty Acid，UFA）的含量决定的，这些峰值强度的差异造成不同物种脂肪光谱的差异。5种脂肪光谱主要差异集中在800～1361 cm^-1处，在这一区间中峰的形状和峰的位置有着较大的不同。1126 cm^-1和1061～1086 cm^-1代表了C-C的拉伸，1298 cm^-1和1265 cm^-1分别代表了C-H的畸变与= C-H的变形。在1265 cm^-1处，鸡、鸭、猪这三种动物脂肪的拉曼光谱图中有明显的峰，而在牛、羊这两种动物脂肪的拉曼光谱图中无明显的峰。1265 cm^-1处峰的强度代表脂肪中顺式不饱和度，反刍动物（羊、牛）脂肪的顺式不饱和度较低，这与拉曼光谱在1265 cm^-1处脂肪峰的强度关系一致。上述5种不同动物脂肪拉曼强度及拉曼峰形状及位置的差异表明了5种动物肉制品实现正确区分的可行性。

在猪肉测量过程中，原始光谱经过预处理后共得到9条有差异的拉曼光谱；牛肉测量过程中，原始光谱经过预处理共得到8条有差异的拉曼光谱；羊肉测量过程中，原始光谱经过预处理后共得到8条有差异的拉曼光谱；鸡肉的测量过程中，原始光谱经过预处理后共得到4条有差异的拉曼光谱；鸭肉的测量过程中，原始光谱经过预处理后共得到4条有差异的拉曼光谱，这些有差异的光谱组成了物种的基础库。5种物种差异谱图如图5所示。

2.2.2 5种动物生鲜肉脂肪的拉曼光谱相似度分析

主成分分析（Principle Component Analysis，PCA）被用作一种无监督的多元数据分析，用来对脂肪数据分类的可行性进行可视化。PCA的中心目的是将数据降维，将原变量进行转换，使少数几个新变量是原变量的线性组合，同时这些新变量要尽可能多地表达原变量的数据特征而不丢失信息。通过累计方差贡献率确定最佳的主成分数，通常使累计方差贡献率大于85%～95%所需的主成分数能代表原始变量所能提供的大部分信息。绘制所有样本的得分图，观察同一种类样本的聚集情况和不同种类样本的分离情况。图6展示了图5中5种物种的拉曼光谱的聚集与分离的情况。可以发现，鸡肉和鸭肉与牛肉和羊肉差距较大，分离得较为清楚。但牛肉与羊肉之间仍有重叠，羊肉与猪肉、猪肉与鸡肉也存在着距离较近的分布状态。经过PCA处理后得到的前两个主成分得分图展现了区分5种不同物种的可行性。

图6 5种动物脂肪的PCA前两个主成分得分图

Fig.6 Scores of the first two principal components of PCA for five animal fats

使用相似性对比法将上述5种不同物种的有差异的拉曼光谱经过预处理后分成了5种物种基础库，将198个猪肉验证样本、88个牛肉验证样本、68个羊肉验证样本、45个鸡肉验证样本、46个鸭肉验证样本进行验证，得到了以下结果：198个猪肉验证样本中有194个被判别为猪肉，有4个被错误识别为鸡肉，正确率98.00%；88个牛肉验证样本中有76个被判别为牛肉，有12个被判别为羊肉，正确率86.36%；68个羊肉验证样本中有60个被正确识别为羊肉，8个被错识别为牛肉，正确率88.23%；45个鸡肉样本中有38个被正确识别为鸡肉，7个被错误识别为鸭肉，准确率84.44%；46个鸭肉样本中有40个被正确识别为鸭肉，6个被错误识别为鸡肉，准确率87.00%。具体见表1。由结果可见，牛肉与羊肉易混淆，鸭肉与鸡肉易混淆，PCA主成分得分图也反映了这一现象，牛肉与羊肉的光谱主成分得分点同样也有部分混淆在一起，鸭肉与鸡肉的光谱主成分得分点有部分混淆在一起。猪肉不会误判为鸭肉或牛肉，同样在PCA主成分得分图里反映出了这一现象。

图6和表1的结果表明，使用相似性对比法建立模型的分辨肉类具有耗时短的特点，只需要得到物种脂肪不同的光谱进行处理并建立基础库即可得到结果，同时模型也具有很强的灵活性，可以随时补充未在基础库中的物种光谱，适应未知的样本谱图变化。

3 讨论

物种属鉴定技术经过了从显微结构观察、高效液相色谱、免疫化学法到高灵敏度、强特异性的分子生物学检测。这些方法各有利弊，有的虽然操作简便，但是容易误判；有的虽然灵敏度较高，但在使用中会受到一定的限制；有的对仪器设备要求高，在推广使用中容易受限；还有部分方法对复杂的样品在前处理和分析时所需时间较长，不适宜进行快速检测或者大批量样品检测。

拉曼光谱技术是基于非弹性散射原理建立起来的分子结构表征光学测量技术，由于拉曼光谱法在测定以碳键为基础的化学指纹图谱方面敏感性更强，且检测结果不受样品或测定环境中水分含量的影响，因此，在肉类掺假检测方面较其他方法更具优势。本研究使用广域拉曼等分子光谱技术、基体拉曼荧光背景消除新方法和复杂体系成分种属分子光谱辨识新技术，研发动物食品种类属性鉴定的快速设备，建立5种动物源性食品种属拉曼光谱数据库，使用分析仪检测一个样本所有性质的时间少于3 min，与使用现行鉴定方法所用时间相比，显著提高了分析效率。检测过程中，由于无需对样品进行预处理，可在3 min内完成从取样到识别不同种属肉类样品，克服了其他检测方法现场快速检测的诸多限制，兼顾了快速性、简便性和稳定性，不受场地限制，有利于口岸现场肉类快速检测的应用和推广。

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图1 不同激光照射距离获取的拉曼光谱

Fig.1 Raman spectra acquired at different laser irradiation distances

(a): 猪; (b): 牛;(c): 羊; (d): 鸡; (e): 鸭

图4 5种动物同一部位（腹部）的脂肪原始光谱

Fig.4 Raw fat spectra of the same part (abdomen) of five animals

图5 5种动物脂肪差异光谱（物种基础库光谱）

Fig.5 Differential spectra of five animal fats (species-based library spectra)

表1 5种动物脂肪拉曼光谱相似性对比法结果分类表

Table 1 Classification of Raman spectral similarity of five animal fats