聂丹丹 刘佳琦 隋冬梅 马丹 杨爱馥 翟亚楠 于淼淼 姜佳颖

聂丹丹 ¹ 刘佳琦 ¹ 隋冬梅 ¹ 马 丹 ² 杨爱馥 ³ 翟亚楠 ¹ 于淼淼 ¹ 姜佳颖 ^{1 *}

摘 要 本研究采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）对不同产地的哈蟆油样品及其伪品进行1-甲基海因、胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的测定。鉴于基因组DNA中^5m C的含量能够体现DNA甲基化水平，因此可通过计算积分面积^5mC/(^5mC+C)的百分数来测定。结果显示，应用HPLC测定1-甲基海因含量和样品基因组胞嘧啶含量，可用于区分哈蟆油和其他伪品，不同产地间无显著性。

关键词 高效液相色谱法；哈蟆油；1-甲基海因；DNA甲基化水平

Study on Traceability System of Ranae Oviductus HPLC

NIE Dan-Dan¹ LIU Jia-Qi¹ SUI Dong-Mei¹ MA Dan²

YANG Ai-Fu³ ZHAI Ya-Nan¹ YU Miao-Miao¹ JIANG Jia-Ying^1*

Abstract The determination of 1-methylhydantoin, cytosine and 5-methylcytosine of Ranae Oviductus and its forgeries from different origin was carried out by HPLC (High Performance Liquid Chromatography). The content of ^5mC in genomic DNA can reflect the level of DNA methylation, which can be determined by calculating the percentage of ^5mC/ (^5mC+C) integral area. The results showed that the content of 1-methylhydantoin and cytosine in genome could be determined by HPLC and hemethylation level determined by HPLC was not significant in different regions.

Keywords High Performance Liquid Chromatography (HPLC); Ranae Oviductus ; 1-methylhydantoin; DNA methylation levels

哈蟆油（Ranae Oviductus）是雌性东北林蛙（Rana dybowskii）^[1]输卵管的干制品，是一种名贵的中药材。《中华人民共和国药典》于1985年将哈蟆油收载在册，2005版《中华人民共和国药典》^[2]初步认定纯正的哈蟆油仅分布在吉林省蛟河、桦甸、敦化等23个市县^[3]。1-甲基海因（1-Methylhydantoin）是名贵中药材的有效成分之一，可在哈蟆油、独角莲等中药材中提取到，这也是对哈蟆油进行鉴定的指定方法^[4]。DNA甲基化（DNA methylation）是一种化学修饰形式，可以对DNA进行化学修饰，参与调控细胞分化、基因表达、胚胎发育等过程。一般情况下，DNA 链上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶（^5mC），并且有能力在不更改 DNA顺序的情况下对基因进行改变^[5]。自1980年Kuo等^[6]第一次发现利用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）在全基因组范围内实现对全基因组DNA甲基化的定量检测之后^[7]，许多研究都采用了这种方法来进行 DNA甲基化的测定。

本研究采用 HPLC方法，在酸性或者相关酶促条件下，可将DNA水解为胸腺嘧啶（Thymine，T）、腺嘌呤（Adenine phosphate，A）、鸟嘌呤（Guanine，G）、胞嘧啶（Cytosine，C）和5-甲基胞嘧啶。哈蟆油DNA根据水解物在极性溶液中溶解度的差异，经过柱层析后，由于不同水解产物离开柱的时间也不同，可以将其分开，从而可以确定5种单核苷酸的含量^[8]。采用270 nm波段光谱测量，通过计算积分面积^5mC/(^5mC+C)的百分数，来获得全基因组 DNA的甲基化程度^[9-10]。本研究通过针对不同产地哈蟆油DNA的5甲基胞嘧啶、1-甲基海因或胞嘧啶的峰面积，结合DNA甲基化水平建立起一套针对不同产地哈蟆油进行产地溯源的方法体系和数据库，旨在明确哈蟆油的优良品种选育，有效利用和深加工林蛙产品，促进林蛙养殖业的发展，建立哈蟆油品质分析的评判标准和理论依据^[11]。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究共收集到哈蟆油样品24份，包括吉林省20份、黑龙江省1份和辽宁省3份。

1.2 试剂

哈蟆油标准品：1-甲基海因（CAS：616-04-6）、5-甲基胞嘧啶（CAS：554-01-8）、胞嘧啶（CAS：71-30-7）、乙醇（色谱纯），购自美国Fisher 公司；三氯甲、异丙醇、异戊醇、高氯酸、氢氧化钾、甲酸、磷酸氢二铵，购自北京化工厂；2% CTAB、TE，购自华诚生物；蛋白酶K，购自德国QIAGEN公司；实验用水为超纯水。

1.3 仪器

高效液相色谱仪（E2695），配紫外检测器（美国Waters 公司）；超声波清洗器（KQ-1000KDB），（中国昆山市超声仪器有限公司）；超纯水系统（Milli-Q）（美国MilliPore公司）；涡旋混匀器（Vortex-Genie）（美国Scientific Industries公司）；电子分析天平（AL204）（瑞士梅特勒-托利多公司）；高速冷冻离心机（X-22R）（美国Beckman公司）；组织研磨仪（MM400）（德国莱驰公司）；酶标仪（M200）（奥地利TECAN公司）；水浴锅（瑞士BUCHI公司）。

1.4 样品DNA的提取

将哈蟆油用MM400组织研磨仪磨成粉末，精确称取0.1 g置于1.5 mL离心管中，加入20 µL蛋白酶K和1 mL CTAB裂解液，混匀，56℃，温育60 min；冷却至室温，加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1），充分均质后，常温条件下12000 rpm，15 min；将上清液立即转移到新的1.5 mL离心管中，加入2/3体积的异丙醇（预冷），充分均质后，在-10～4℃条件下静置30 min，常温条件下离心，12000 rpm，10 min；轻轻倒掉上清，使异丙醇挥发净，加入600 μL 75%乙醇，4℃漂洗；在常温条件下12000 rpm，10 min离心，弃上层乙醇，且将DNA风干，但需注意切忌太干燥^[12-13]。加入1倍TE 200 μL，室温条件下使DNA完全溶解；DNA质量鉴定和DNA浓度估测，用M200酶标仪检测DNA质量和估测浓度。质量合格的DNA稀释为相同浓度置于-20℃冰箱中并将用于PCR检测分析。也可按说明使用DNA提取试剂盒提取制备模板DNA。

1.5 DNA的水解

取50 μL的DNA溶液，加入25 μL的75%的高氯酸，在95℃条件下水解1 h ，取1 mol/L的KOH 220 μL，调pH值至3～5，形成KClO₄沉淀后，-20℃冷冻过夜，在12000 r/min条件下，离心30 min，吸取上清液后-20℃冷冻过夜，经沉淀后，再在12000 r/min条件下，离心30 min，吸取上清液，-20℃保存以备使用。

1.6 1-甲基海因的检测方法

使用高效液相色谱仪E2695，Hyper Clone BDS C₁₈色谱柱进行测定。色谱柱：Hyper Clone BDS C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A为5 %甲酸水，B为95% 50 mmol/L磷酸氢二铵（pH = 3.5）；进样量：10 μL；柱温：35℃；流速：0.7 mL/min。紫外波长：235 nm，时间为12 min。使用1-甲基海因作为标准样品，对样品的1-甲基海因含量进行测定。

1.7 DNA甲基化的检测方法

使用高效液相色谱仪E2695，Hyper Clone BDS C₁₈ 色谱柱进行测定。色谱柱：Hyper Clone BDS C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A为5 %甲酸水，B为95% 50 mmol/L磷酸氢二铵（pH = 3.5）；进样量：10 μL；柱温：35℃；流速：0.7 mL/min。紫外波长：270 nm，时间为12 min。标准样品用胞嘧啶（C）和5-甲基胞嘧啶（^5mC），测定样品的DNA甲基化含量。

1.8 数据处理以及标志物鉴定方法

应用Excel 2016和SPSS 20.0进行数据整理和统计分析。当p＜0.05为差异，p＜0.01为极差异，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 1-甲基海因、胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的检测

以1号样品为例，记录进样10 μL 1号样品（蛟河）供试液和进样10 μL 1-甲基海因对照品的色谱图。通过比较保留时间，确定4.784 min为1-甲基海因，因其与相邻峰基本分离，且保留时间适中，适合作为参照物峰。结果显示系统无干扰且确定测定时间为12 min，具体情况如图1所示。

记录进样10 μL 1号样品（蛟河）供试液、进样10 μL 胞嘧啶和进样10 μL 5-甲基胞嘧啶对照品的色谱图。通过比较保留时间，确定3.978 min为胞嘧啶，4.724 min为5-甲基胞嘧啶，胞嘧啶与5-甲基胞嘧啶与相邻峰均达到基线分离，且保留时间适中，适合作为参照物峰。结果显示系统无干扰且确定测定时间为12 min，具体情况如图2所示。

2.2 哈蟆油及伪品中1-甲基海因、胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶含量的比较

哈蟆油DNA提取样本中富含胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，1-甲基海因是哈蟆油中的主要活性物质和评价哈蟆油质量的重要指标。因此，本文通过对吉林省内和省外的哈蟆油进行研究，经上述方法分析后，鉴定出24个地区哈蟆油和4种伪品中1-甲基海因和 DNA甲基化水平的关系。

不同产地哈蟆油样品间的甲基化水平无显著差异；吉林省内哈蟆油中胞嘧啶与1-甲基海因具有显著回归关系（p＜0.01）但无线性关系（图3）；哈蟆油中胞嘧啶及1-甲基海因显著低于伪品（黑龙江林蛙油、中华蟾蜍油、牛蛙油和黑斑侧褶蛙油）（p_胞嘧啶＜0.0001，p_{1-甲基海因}＜0.0001）。

本研究中1-甲基海因在吉林省（mg/g）测得最高值为0.201，最低值为0.105；外省最高值为0.200，最低值为0.118；伪品最高值为1.504，最低值为0.171。甲基化水平（%）在吉林省测得最高值为21.1，最低值为2.86；外省最高值为13.6，最低值为2.86；伪品最高值为22.9，最低值为9.02。5-甲基胞嘧啶（ μg/g）测得最高值为0.019，最低值为0.001；外省最高值为0.008，最低值为0.001；伪品最高值为0.056，最低值为0.008。胞嘧啶（ μg/g）吉林省测得最高值为0.074，最低值为0.027；外省最高值为0.051，最低值为0.029；伪品最高值为0.189，最低值为0.054（见表1）。由此可以得出结论，吉林省内哈蟆油除甲基化水平和5-甲基胞嘧啶的最高值及最低值外，无一致性；省外的最高值都出现在丹东，最低值出现在伊春（除甲基化水平外）；伪品最高值为牛蛙（除1-甲基海因外），最低值为黑龙江林蛙（除甲基化水平外）。所有检测指标平均值伪品均高于哈蟆油，见表2。

2.3 哈蟆油产地区分

哈蟆油的DNA提取物，单从HPLC的谱图中，区分产地较难。不同产地哈蟆油中1-甲基海因和甲基化水平无显著回归关系，吉林省哈蟆油和4种伪品中1-甲基海因和胞嘧啶运用多元统计分析技术可以有效识别不同组别之间的特征差异。将数据导入SPSS 20.0软件进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），考察数据整体分布的情况，而这些结果与本研究前期工作中利用扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）方法同样可以鉴别哈蟆油和用红色框标记的伪品^[11]。

3 结论

有报道指出基因组总甲基化水平受品种的影响，产地也是影响甲基化水平的一个因素，即DNA甲基化受品种和地理因素的影响^[14]。该方法虽未能同甲基化敏感扩增多态性技术（Methylation Sensitive Amplification Polymor- phism，MSAP）一样准确地鉴定特定的甲基化位点，但操作简单，实用性强，可实现全基因组DNA甲基化测定。虽然本研究尝试通过HPLC方法分析不同产地哈蟆油DNA甲基化水平以对其产地进行溯源未能取得预期效果，但通过对样品1-甲基海因含量、样品基因组胞嘧啶含量和AFLP检测可建立真伪鉴定方法。

哈蟆油样本中富含1-甲基海因，1-甲基海因是哈蟆油中的主要活性物质和评价哈蟆油质量的重要指标。哈蟆油（中国林蛙油）作为地理标志产品，属于吉林省特有珍稀中药材，其微量元素和氨基酸含量与本研究中1-甲基海因、全基因组DNA甲基化水平的相关性有待进一步分析。由于东北林蛙人工育种和半放养的实际情况，从DNA序列分析地区种群差异越来越困难，本团队将在未来研究中加入特定营养成分分析，在真伪鉴定的基础上找到区分产地的地理标记方法。

参考文献

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本论文由1+X合作单位资助

基金项目：吉林省中医药科技项目（2024149，2023181）

第一作者：聂丹丹（1982—），女，汉族，吉林长春人，博士，高级工程师，主要从事食品真伪鉴定工作，E-mail: 67254954@qq.com

通信作者：姜佳颖（1991—），女，汉族，吉林延边人，本科，工程师，主要从事食品、水产品实验室检测工作，E-mail: 359107730@qq.com

1. 长春海关技术中心 长春 130062

2. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

3. 大连海关技术中心 大连 116001

1. Changchun Customs Technology Center, Changchun 130062

2. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

3. Dalian Customs Technology Center, Dalian 116001

A: 1-甲基海因标准品HPLC图; B: 1号样品 (蛟河) 哈蟆油1-甲基海因HPLC图

图1 哈蟆油1-甲基海因HPLC图

Fig.1 HPLC diagram of Ranae Oviductus 1-methylhydantoin

A: 胞嘧啶标准品HPLC图; B: 1号样品哈蟆油胞嘧啶HPLC图; C: 5-甲基胞嘧啶标准品HPLC图; D: 1号样品哈蟆油5-甲基胞嘧啶HPLC图

图2 哈蟆油胞嘧啶与5-甲基胞嘧啶HPLC图

Fig.2 HPLC diagram of Ranae Oviductus cytosine and 5-methylcytosine

图3 胞嘧啶与1-甲基海因的相关性

Fig.3 Correlation between cytosine and 1-methylhydantoin

表1 所有样品各项指标比较

Table 1 Comparison of indexes of all samples

表2 所有样品各项指标组间关系

Table 2 Inter-group relationships of all indicators of the samples

注: p＜0.05用“*”表示; p＜0.01用“**”表示; p＜0.001用“***”表示.