王波 刘阿静 刘志业 张航 白兴斌 刘元春 崔凤云 解迎双

王 波 ¹ 刘阿静 ¹ 刘志业 ¹ 张 航 ^2,3 白兴斌 ¹ 刘元春 ^2,3 崔凤云 ⁴ 解迎双 ^{1 *}

摘 要 本研究采用响应面法对淫羊藿样品前处理过程进行优化，建立指纹图谱并进行相似程度评价，以此分析淫羊藿不同采收期与特征组分含量的相关性。采用SPSS 25.0软件进行聚类分析和主要成分分析，收集淫羊藿特征组分在不同采收时间内含量的数据。研究表明，响应面优化后的技术可以有效地提取淫羊藿的特征成分，建立的指纹图谱更加精确，可对特征化合物信息进行综合反映。通过聚类及主要成分分析，甘肃省陇南市礼县淫羊藿在不同的采收期，其主成分含量呈现了较为明显的差异性。该研究结果可为淫羊藿质量评估提供科学依据。

关键词 淫羊藿；特征组分；采收期；相关性

The Detection of Characteristic Components of Epimedium Optimized by Using Response Surface Method and the Establishment of Fingerprints

WANG Bo¹ LIU A-Jing¹ LIU Zhi-Ye¹ ZHANG Hang^2,3

BAI Xing-Bin¹ LIU Yuan-Chun^2,3 CUI Feng-Yun⁴ XIE Ying-Shuang^1*

Abstract In this study, response surface methodology (RSM) was used to optimize the pre-treatment process of Herba epimedii, and to establish the fingerprint and evaluate the similarity of Herba epimedii samples. SPSS 25.0 software was used for cluster analysis and main component analysis, and the data of characteristic components of epimedium in different harvest periods were collected. The results showed that the optimized response surface methodology could effectively extract the characteristic components of epimedium, and the established fingerprint was more accurate, which could comprehensively reflect the information of the characteristic compounds. The main component content of Epimedium in Lixian, Longnan City, Gansu Province, showed significant differences at different harvest stages as revealed by clustering and principal component analysis. The results laid a scientific basis for the quality evaluation of epimedium.

Keywords epimedium; characteristic components; harvest time; correlation

本论文由1+X合作单位资助

基金项目：甘肃省科技计划项目（22CX8GA095）；海关总署科研项目（2023HK028）；兰州海关科技项目（LK-2023-005）

第一作者：王波（1982—），男，汉族，甘肃陇南人，博士，高级工程师，主要从事色谱分析工作，E-mail: wyy080214@163.com

通信作者：解迎双（1985—），女，汉族，河北邢台人，硕士，高级工程师，主要从事农产品质量及检测工作，E-mail: 173355905@qq.com

1. 兰州海关技术中心 兰州 730010

2. 甘肃科标检测有限责任公司 礼县 742200

3. 礼县春天药业有限责任公司 礼县 742200

4. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

1. Lanzhou Customs Technology Center, Lanzhou 730010

2. Gansu Kebiao Testing Co., LTD., Lixian 742200

3. Li County Spring Pharmaceutical Co., LTD., Lixian 742200

4. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

淫羊藿（Epimedii folium）主要产于安徽、河南、广西、甘肃、四川、贵州等地区^[1-2]。其中，甘肃以心形淫羊藿为主，主要分布于陇南、定西、兰州、甘南、临夏等地。随着人们养生保健意识的增强，医药和保健品行业发展迅速，淫羊藿市场需求量也随之增大。本课题组前期的调研与研究表明，甘肃为心叶淫羊藿的优势产区。我国淫羊藿药材的来源主要依赖于野生资源^[3-4]，加之物种分布区重叠、采收尚不规范及采收时间的随意性等诸多原因，导致淫羊藿资源短缺的同时，也存在药材市场品种混乱、质量参差不齐等问题^[5-6]。

目前常见的淫羊藿品质鉴定方法有性状及显微鉴定、薄层色谱技术、分子生物技术、红外光谱技术、高效液相色谱技术等。其中，性状及显微鉴定、薄层色谱技术、分子生物技术方法虽然具有操作简单、快速、重现性好、专属性强的特点，但主要应用于淫羊藿的种类鉴别，很难对其品质进行鉴定。因此，本研究以甘肃省陇南市礼县淫羊藿为样本，采用响应面法优化提取工艺，分析不同采收时期的淫羊藿药材，建立淫羊藿特征化合物的指纹图谱，经相似度评价，结合聚类分析、主成分分析对不同采收期的淫羊藿中特征组分含量的相关性进行分析，为淫羊藿质量评价及药效评估，以及淫羊藿质量标准制定、合理采摘时间的确定提供科学依据^[7]。

1 药材、仪器与试剂

1.1 样品来源及制备

淫羊藿样品均为采摘于甘肃省陇南市礼县中良村的野生淫羊藿，采收时间为2023年2—11月，时间间隔为1个月。样品的采集方式和范围为：在礼县中良村野生淫羊藿资源的主要产区进行样品采集；采样株树为100株，每一株每次采样5个叶片；在2月份第一次进行采样时，对100株被采集的淫羊藿植株进行标记，随后3—11月均在同一植株进行样品采集。采集后的样品混匀后进行样品阴干处理，粉碎后过60目筛，供检测。

1.2 实验用设备及试剂

UPLC液相色谱仪（美国，Waters公司）；SB25-12DTD超声波仪（中国，新芝生物公司）；3K30离心机（德国，Sigma公司）；XRS204电子天平（瑞士，梅特勒托利多科技（中国）有限公司）；BC-1000涡旋仪（中国，逗点公司）；Shiseido C₁₈色谱柱：3.1 μm 100 mm×4.6 mm，（美国，安捷伦科技（上海）有限公司）。标准物质：淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ、朝藿定B、朝藿定C、朝藿定A纯度均＞98%，（德国，默克生命科学（上海）有限公司）；乙腈、甲醇、乙醇、甲酸均为色谱纯（德国，默克生命科学（上海）有限公司）；纯净水（屈臣氏）。

1.3 标准物质制备

1.3.1 标准储备液的制备

分别称取淫羊藿苷0.0102 g、宝霍苷Ⅰ0.0102 g、朝藿定A 0.0101 g、朝藿定B 0.0102 g、朝藿定C0.0102 g于容量瓶中（50 mL），用甲醇溶解后定容至刻度。配制成标准储备溶液（200 μg/mL）。

1.3.2 标准工作液的制备

10 mL容量瓶中分别移入 1.0 mL标准储备液，用甲醇溶解、定容至刻度。配制成标准工作液（20 μg/mL）。

2 实验方法与结果

2.1 淫羊藿特征化合物检测方法的建立

2.1.1 样品前处理

精密称取过筛后的淫羊藿药材（2.00±0.01）g，加入70%甲醇-水溶液40 mL，涡旋1.0 min，于45℃、超声60 min，10000 r/min转速下于4℃离心5 min，准确移取1.0 mL上清液，过0.22 μm滤膜，供HPLC测定。

2.1.2 色谱条件

色谱柱为Shiseido C₁₈色谱柱（3.1 μm 100 mm×4.6 mm），流相A为0.2%的甲酸水，流相B为0.2%的甲酸乙腈，流速0.4 mL/min，检测波长220～350 nm，进样量2.0 μL。流动相比例梯度见表1。在该色谱条件下淫羊藿中5种特征化合物分离良好，所得色谱图如图1所示。

表1 流动相梯度表

Table 1 Mobile phase gradient table

2.1.3 线性关系考察

将1.3.2 项下制备的标准工作液用甲醇依次稀释为0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、40.0 μg/mL的浓度梯度后进行测定，以特征化合物的质量浓度作为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得到各化合物的线性方程。其中淫羊藿苷线性方程为：Y = 5986.9X - 2523.6，R² = 0.9996；宝霍苷Ⅰ线性方程为：Y = 7087.9X - 2719.8，R² = 0.9996；朝藿定A线性方程为：Y = 4369.9X - 2457.2，R² = 0.9991；朝藿定B线性方程为：Y = 4431.1X - 2138.6，R² = 0.9992；朝藿定C的线性方程为：Y = 9293.3X - 4853.9，R² = 0.9992。5个特性化合物线性良好，线性范围在0.5～40 μg/mL之间。

2.1.4 精密度考察

取礼县中良村5月份采摘淫羊藿药材样品按照2.1.1项下所设定的样品前处理方法对淫羊藿药材样品进行处理后，得到供试品溶液。5种特征化合物峰面积，按2.1.2项下设定的色谱条件（n = 6）进行重复测定，计算其峰面积的RSD范围为0.4%～0.6%，表明本研究的仪器方法精密度较好。

2.1.5 稳定性试验

取礼县中良村5月份采摘淫羊藿药材样品按照2.1.1项下得到的供试品溶液，将其放置于4℃冰箱内进行保存，在放置时间为0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h后，分别测定供试液。RSD范围为0.7%～0.9%，表明本研究的供试品溶液在48 h内是稳定的，可以满足测定的要求。

2.1.6 重复性试验

取过筛后的5月份采摘淫羊藿中药材，按2.1.1项下设定的样品前处理方法，精确等量取6份样品后进行检测。5个特征化合物峰面积的RSD范围为0.5%～0.8%，说明本研究方法重复性较好。

2.1.7 加样回收率试验

取已测定5种特征化合物含量的淫羊藿药材样品18份，准确加入200 μg/mL 5种特征化合物标准溶液2 mL、1 mL、0.5 mL。按本研究建立的方法进行测定，得到平均加标回收率范围为89.82%～102.19%，RSD范围为1.2%～2.3%。

2.2 提取工艺的单因素条件选择

2.2.1 提取试剂的选择

准确称取1.0 g淫羊藿药材粉末，只改变溶剂的种类（乙醇、甲醇、乙腈、水）进行单因素实验，按照本实验的操作方法进行测定，计算淫羊藿药材中特征化合物的总含量，考察提取试剂的提取效率，如图2所示，在其他条件不变的情况下，甲醇的提取效率最佳。

图2 不同提取试剂对淫羊藿药材中特征化合物总量

提取效率的影响

Fig.2 Effect of different extraction reagents on the extraction efficiency of the total amount of characteristic compounds in epimedium

2.2.2 甲醇体积分数的影响

准确称取1.0 g粉碎过筛后的淫羊藿中药材粉末，在超声时间、超声温度、超声功率、料液比固定不变的前提下，改变甲醇体积分数（30%、50%、70%、80%、100%）进行单因素实验。图3表明，随着甲醇体积分数增加，特征化合物的提取效率逐渐增加，在70%时达到最高，随后开始下降。

图3 不同甲醇体积分数对淫羊藿药材中特征化合物

总量提取效率的影响

Fig.3 Effect of different methanol volume fraction on extraction efficiency of total characteristic compounds from epimedium herbs

2.2.3 料液比的影响

准确称取1.0 g粉碎过筛后的淫羊藿中药材粉末，在其他考察因素固定不变的前提下，通过在1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35比例下进行单因素实验。由图4可知，在其他考察因素不变的情况下，随着提取液比例的增加，淫羊藿药材中特征化合物的提取效率呈现出先增加后降低的趋势，在料液比为1∶20时达到峰值。

图4 不同料液比对淫羊藿药材中特征化合物

总量提取效率的影响

Fig.4 Effect of the same material-liquid ratio on the extraction efficiency of total characteristic compounds from epimedium

2.2.4 超声温度的影响

精确称取1.0 g粉碎过筛的淫羊藿中药材粉末，改变超声温度（20℃、30℃、50℃、60℃、80℃），在固定其他考察因素的前提下进行单因子实验。如图5所示，随着超声温度的增加，各化合物的提取效率迅速增加，在50℃时提取效率最高，随后开始下降。

图5 不同超声温度对淫羊藿药材中特征化合物

总量提取效率的影响

Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction efficiency of total characteristic compounds in epimedium

2.2.5 超声时间的影响

准确称取1.0 g粉碎过筛后的淫羊藿中药材粉末，在其他考察因素固定不变的前提下，在10～120 min范围内改变超声时间进行单因素实验，结果如图6所示。随着超声时间的增加，各化合物的响应逐渐增加，在60 min时达最高，随后开始下降。

图6 不同超声时间对淫羊藿药材中特征化合物

总量提取效率的影响

Fig.6 Effect of different ultrasound time on extraction efficiency of total characteristic compounds in epimedium

2.2.6 超声功率的影响

准确称取1.0 g粉碎过筛后的淫羊藿中药材粉末，固定其他考察因素不变，在超声功率为20%～90%的梯度范围内进行单因素实验。由图7可知，随着超声功率的增加，各化合物的响应逐渐增加，在30%～90%范围内，超声功率对各化合物的响应不产生显著影响。

图7 不同超声功率对淫羊藿药材中特征化合物总量

提取效率的影响

Fig.7 Effect of different ultrasonic power on the extraction efficiency of total amount of characteristic compounds in epimedium

在固定提取溶剂为甲醇、超声功率为90%条件下，通过对本研究的单因素实验结果进行分析，选择料液比1∶20，提取溶液的比例为甲醇∶水= 7∶10，超声时间60 min，超声温度50℃，作为响应面试验设计的中心点。

2.3 响应面法优化淫羊藿特征化合物最佳提取方法

2.3.1 响应面实验

以单因素实验结果为基础，以淫羊藿药材中特征化合物的含量（R₁）之和作为判别指标，应用Design-Expert 13统计软件设计4因素3水平响应面试验对本研究的样品前处理过程进行优化，确定最优方案，实验方案及结果见表2。

2.3.2 模型拟合及方差分析

采用Design-Expert 13软件，以淫羊藿药材中特征化合物含量（R₁）为响应参数对因素A：料液比，B：甲醇体积分数，C：超声时间，D：超声温度进行2次多项式回归方程拟合，得拟合方程分别为R₁ = 130.97-18.80A+0.5867B-2.44C+2.45D-1.18AB+2.87AC-2.57AD-1.98BC+2.55BD-1.82CD-21.55A²-13.46B²-21.08C²-10.76D²（R² = 0.9418，ρ＜0.0001），该拟合方程显示，R² = 0.9418，ρ＜0.0001说明回归方程的关系是极显著的，可用于该研究前处理实验的预测和分析，见表3。对于ρ模型方程，A、A²、B²、C²、D²都是显著项，是R₁的显著影响因素，交互影响因素3D效果图与等高线图如图8所示。

表3 回归模型的方差分析

Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.3 响应面优化与预测

本研究通过对2D等高线及3D响应面图进行分析，最终确定最优样品前处理条件为A = 20，B = 70，C = 60，D = 45。

2.3.4 优化后的方法验证

分别精密称取相同采收时期的10批次淫羊藿样品，按本实验确定的最优提取方法进行提取，按照本实验的色谱条件进行测定。将检测结果与拟合方程的预测值进行对比，按公式[相对偏差＝(预测值-实测值)/预测值]计算相对偏差，以评估模型方程的可靠性。各批样品特征化合物总含量的预测峰面积总和为128.61 μV/min×10⁵，实测值为126.90～134.64 μV/min×10⁵之间，实测平均值为131.05 μV/min×10⁵，实测值与预测值之间的相对偏差＜5%。说明该方法稳定可行。

2.4 淫羊藿中特征组分HPLC指纹图谱的建立

供试品溶液的制备同2.1.1所述方法，色谱条件同2.1.2所述方法。

2.4.1 指纹图谱的建立

取2—11月范围内采收的淫羊藿样品，按本研究建立的样品前处理方法和仪器方法进行检测。将采集结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，分析生成淫羊藿活性成分的叠加图谱和对照图谱，如图9所示。对淫羊藿指纹图谱中色谱峰响应较强的共有指纹峰，对应淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C标准物色谱图的保留时间和吸收波长谱图进行化合物确认。

2.4.2 指纹图谱的相似度确认

通过保留时间和对淫羊藿药材指纹图谱中的共有峰进行确认，结果表明，有17个指纹峰为各色谱图所共有，确定为共有指纹峰。其中，不同采收时期淫羊藿药材相似度大于0.998，但共有峰相对峰面积的RSD为17.46%～30.95%，相差较大。相似度评价结果表明，不同采收时期淫羊藿药材中的特征组分虽一致，但淫羊藿中活性成分含量存在较大的差异，说明不同采收时期淫羊藿药材质量存在一定的差异性。

2.5 聚类分析

采用系统聚类法结合欧氏距离（d）为测度对2—11月范围内采收的淫羊藿中药材样品中17个共有化合物的峰面积进行分析。由图10可知，欧氏距离（d）为25时，2—11月范围内采收的淫羊藿中药材样品可聚为2类，其中5月份（S4）、6月份（S5）聚为一类，其余采收期样品可聚为一类；欧氏距离（d）为7时，2—11月范围内采收的淫羊藿中药材样品可聚为3类，其中2月份（S1）、11月份（S10）、3月份（S2）、10月份（S9）样品聚为一类，4月份（S3）、7月份（S6）、8月份（S7）、9月份（S8）样品聚为一类，5月份（S4）、6月份（S5）样品聚为一类。

图10 不同采收期10批淫羊藿样品聚类分析树状图

Fig.10 Dendrogram of cluster analysis of 10 batches of epimedium samples collected in different periods

2.6 主成分分析

采用SPSS 26.0软件对2—11月范围内采收的淫羊藿样品中的17个共有指纹峰的相对峰面积进行标准化处理，计算其特征值和方差贡献率。以特征值＞1，累积方差贡献率＞80%为标准，得到2—11月范围内采收的淫羊藿药材样品质量评价的主要因子，其贡献因子的特征值分别为14.206、1.299；2个主成分因子的累积方差贡献率为91.206%，结果见表4。选择提取该2个主成分因子对10批不同采收时期淫羊藿样品进行综合评分。得出10批不同采收时期淫羊藿样品的综合得分由高到低依次为5月（S4）、6月（S5）、9月（S8）、7月（S6）、4月（S3）、8月（S7）、11月（S10）、3月（S2）、10月（S9）、2月（S1）、10月（S9）。

表4 2个主成分因子的特征值和方差贡献率

Table 4 Eigenvalues and variance contribution rates of two principal component factors

表5 淫羊藿药材特征组分经主成分分析后的主成分因子得分及排序

Table 5 Principal component factor scores and ranking of the characteristic components of epimedium by principal component analysis (PCA)

3 讨论

本研究采用Box-Behnken效应面法对样品前处理过程进行优化，克服了单因素实验及正交实验不能够计算全因素的最佳组合方式这一问题，弥补了均匀实验设计在线性模型过程中精密度较低的缺陷，可以对实验过程中的自变量和因变量之间的关系进行科学表征^[8-9]。

本研究以淫羊藿药材中的主要药效成分黄酮类化合物为指标，通过单因素实验确定了4个能够影响结果的主要因素，并通过Box-Behnken响应面进行实验方案设计后对本研究得到的回归方程、2D等高线图、3D响应面分别进行分析，明确淫羊藿中5种特征化合物提取过程中的4个影响因素的主次关系。最终得到了5种特征化合物提取效果最优的实验条件为：提取溶剂为85%的甲醇、料液比为1∶15，超声时间60 min，超声温度45℃。为证明响应面法所构建的实验模型的准确性，本研究进行验证试验，结果表明淫羊藿特征组分含量实测值与理论值相近，经响应面法优化后实验条件下5种淫羊藿特征组分能够达到最高的提取效率。本研究构建的10批不同采收时期的淫羊藿中药材的指纹图谱相似度为大于0.998，共有峰化合峰面积的RSD范围差异较大，为17.46%～30.95%。说明随着季节的变化，光照、降水、温度等条件各不相同，对淫羊藿中特征组分的含量差异性影响较大。实验中获得的相应的指纹图谱信息数据，能够较好地从整体上反映淫羊藿药材的化学成分，为淫羊藿对用2020年版《中华人民共和国药典》的质量标准的建立及淫羊藿药材采收时间的标准化建立提供实验依据。通过方法学考察后表明，所建立的指纹图谱具有应用范围广、重现性好、操作简单、稳定性好等特点^[10-11]。

本研究将所得到的数据进行聚类分析后，结果为：当d = 25时，2—11月不同采收时期淫羊藿药材样品可聚为2类，即采收时期为5月、6月的聚为一类，其余聚为一类；当d = 7时，采收时期为4、7、8、9月份的聚为一类；淫羊藿中特征组分含量较少的 S1、S2、S9、S10聚为一类，即采收时期为2月、3月、10月、11月的聚为一类。上述结果表明基于淫羊藿药材中特征化合物含量差异性，能够有效判断淫羊藿质量的差异并明确其质量与其采收期的相关性。

对淫羊藿化学组分的图谱进行主成分分析，获取2个主成分，其因子的特征值分别为14.206、1.299，累积方差贡献率为91.206%。采用主成分分析法提取2个主成分因子对不同采摘时期的10批样品进行评分，通过对综合得分进行排序来判断最佳采收期，S4综合得分为所有样品中最高，S5综合得分次之。因此，可判断淫羊藿的最佳采收期为5月和6月。主成分分析结果与聚类分析结果存在一致性，说明本研究采用的数据分析方法在对淫羊藿的质量和采收期判断过程中具有科学性，能够作为不同采摘时期的淫羊藿药材质量评价的方法和依据。

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图1 淫羊藿中5种特征组分标准物质混合标准谱图

Fig.1 Mixed standard spectrum of five characteristic components in epimedium

表2 响应面实验设计及结果

Table 2 Experimental design and results of response surface

表3（续）

60

90

80

54

70

48

60

42

50

超声温度D (℃)

超声时间C (min)

36

40

30

30

响应值R₁ (μV/s)

140

130

120

110

100

90

80

70

80

60

54

75

48

70

42

超声温度D (℃)

甲醇体积分数B (%)

65

36

30

60

响应值R₁ (μV/s)

140

130

120

110

100

90

80

70

80

90

80

75

70

70

60

超声时间C (min)

50

甲醇体积分数B (%)

65

40

30

60

图8 自变量A、B、C、D与应变量R₁的效应面图

Fig.8 Effect surface diagram of independent variables A, B, C, D and strain variable R₁

140

图8 自变量A、B、C、D与应变量R₁的效应面图

Fig.8 Effect surface diagram of independent variables A, B, C, D and strain variable R₁

图9 淫羊藿药材指纹图谱

Fig.9 Fingerprint of Herba epimedii