张柏瑀 董鸿竺 杜姗姗 张彤 万建春 姜莉 耿庆华 刘瑜

张柏瑀 ¹ 董鸿竺 ² 杜姗姗 ² 张 彤 ² 万建春 ³ 姜 莉 ² 耿庆华 ^{2 *} 刘 瑜 ^{2 *}

摘 要 本研究采用改进的QuEChERS前处理技术与超高效液相色谱-串联质谱仪，建立了水产养殖环境中32种农药同时测定的分析方法。试样经乙腈提取，改进的QuEChERS净化，采用C₁₈色谱柱分离，流动相为乙腈+甲酸水，质谱扫描模式为多反应监测（MRM），外标法定量。结果显示，该方法的检出限为0.003～0.015 mg/L，定量限为0.01～0.05 mg/L，回收率为75%～113%，相对标准偏差为0.132%～6.73%。结果表明，该方法简便、快速、准确，适用于水产养殖环境中32种农药的同时检测。

关键词 农药；液相色谱-串联质谱；水产养殖环境；改进的QuEChERS

Study on Detection Methods for Multiple Pesticide Residues in Aquaculture Environment

ZHANG Bo-Yu¹ DONG Hong-Zhu² DU Shan-Shan² ZHANG Tong²

WAN Jian-Chun³ JIANG Li² GENG Qing-Hua^2* LIU Yu^2*

Abstracts This study developed an analytical method for the simultaneous determination of 32 pesticides in aquaculture environments using an improved QuEChERS pre-treatment technology coupled with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry by optimizing pre-treatment and instrument conditions. The sample was extracted with acetonitrile, purified with improved QuEChERS method, and separated using a C₁₈ chromatographic column. The mobile phase consisted of acetonitrile and formic acid water, with mass spectrometry scanning mode operated in multi reaction monitoring (MRM). Quantification was performed using the external standard method. The detection limit of this method ranged from 0.003 to 0.015 mg/L, with a quantification limits from 0.01-0.05 mg/L, recovery rate 75%-113%, relative standard deviation 0.132%-6.73%. This method is simple, fast, and accurate, making it suitable for the simultaneous detection of 32 pesticides in aquaculture environments.

Keywords pesticides; UPLC-MS/MS; aquaculture environments; improved QuEChERS

基金项目：海关总署科研计划项目（2022HK021，2024HK113）；辽宁省自然科学基金项目（2022HK021）

第一作者：张柏瑀（1981—），男，汉族，河北衡水人，硕士，副主任技师，主要从事卫生检验工作，E-mail: 1981zby@sina.com

通信作者：刘瑜（1982—），女，汉族，辽宁锦州人，硕士，高级工程师，主要从事药物残留检测工作，E-mail: 99555629@163.com

共同通信作者：耿庆华（1977—），女，汉族，辽宁本溪人，博士，研究员，主要从事动物检疫工作，E-mail: genghua77@163.com

1. 沈阳市和平区疾病预防控制中心 沈阳 110005

2. 沈阳海关技术中心 沈阳 110016

3. 南昌海关技术中心 南昌 330000

1. Shenyang Heping District Center for Disease Prevention and Control , Shenyang 110005

2. Technology Center of Shenyang Customs, Shenyang 110016

3. Technology Center of Nanchang Customs, Nanchang 330000

农药在水果、蔬菜等多种农作物的种植过程中被广泛应用，其中有机磷农药是使用量较大的杀虫剂，如甲胺磷、乐果、马拉硫磷等。有机磷农药主要是通过抑制生物体内胆碱酯酶活性，可引起出汗、震颤、供给失调、精神紊乱等一系列神经毒性的表现。慢性中毒主要表现在对神经系统、血液系统和视觉的损伤。农药的不合理使用会对土壤、地表水、地下水和农产品造成污染^[1-2]。水产养殖严重依赖于水体环境，水产品体内的农药残留与养殖环境中的沉积物污染密切相关，检测水产养殖环境中农药情况是控制水产品中农药残留的重要方法^[3-4]。

研究表明，现行国家标准、行业标准以及文献中大多针对水果、蔬菜、粮谷等植物源性产品建立农药残留检测方法^[5-7]，而针对水产养殖环境中农药的多残留检测方法报道较少^[8-11]。本研究采用改进的QuEChERS净化技术，建立了水产养殖水环境中32种农药的快速检测方法。通过监测水产养殖环境中农药残留情况，使水产品中农药残留得到有效控制，为水产品质量安全及健康饲养提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

UPLC-MS/MS-8060超高效液相色谱串联质谱仪（日本岛津公司)；Genie PURIST TOC 超纯水系统（乐枫公司）；BSA2202S电子天平（德国赛多利斯公司）；MGS-2200氮吹仪（东京理化公司）；X1离心机（德国赛默飞世尔公司）；MX-S涡混仪（北京大龙公司）。

1.1.2 试剂

甲胺磷、杀虫脒、硫环磷、磷铵、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、甲磺隆、氯磺隆、克百威、3-羟基克百威、胺苯磺隆、内吸磷-S、内吸磷-O、特丁硫磷、特丁硫磷砜、特丁硫磷亚砜、水胺硫磷、苯线磷、苯线磷砜、苯线磷亚砜、氯唑磷、灭线磷、硫线磷、甲基异柳磷、蝇毒磷、治螟磷、地虫硫磷、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜、久效磷（农业农村部环境质量监督检验测试中心）；乙腈（色谱纯）、甲酸（优级纯）、乙酸铵（优级纯）、PSA、GCB、C₁₈填料（美国迪马公司）；乙酸（分析纯）、乙酸钠（分析纯）、无水硫酸镁（分析纯）（国药集团化学试剂有限公司）；QuEChERS试剂盒（青云实验耗材有限公司）。

1.2 样品的制备

选取辽宁省盘锦市某水产养殖厂的养殖用水，将其收集于50 mL具塞离心管中，4℃避光密封保存。

1.3 样品提取与净化

1.3.1 提取

准确吸取2 mL（精确至0.01 mL）样品，置于50 mL萃取管中，加入10 mL 1%醋酸乙腈溶液，涡旋振荡3 min，将盐包全部加入萃取管中，均质提取1 min，5000 r/min离心5 min。

1.3.2 净化

上清液转移至净化管中，涡旋振荡1 min，5000 r/min离心5 min，取5 mL上清液氮吹至近干，加1.0 mL乙腈∶水（1∶1）复溶，涡混，过0.22 μm滤膜，待测。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：岛津C₁₈（100 mm×2.1 mm，2.0 μm）；样品室温度：4℃；柱温：40℃；进样体积：2.0 μL；流速：0.30 mL/min；流动相梯度：A为乙腈，B为0.1%甲酸的5mmol/L 乙酸铵溶液，15+85（0 min）→ 95+5（12 min）→95+5（13 min）→15+85（14 min）→15+85（16 min）。

1.4.2 质谱条件

离子源：ESI（+）；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；接口温度：300℃；接口电压：4.0 kV；雾化气流量：3.0 L/min；干燥气流量：10.0 L/min；加热气流量：10.0 L/min。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择优化

对比了有机相（甲醇和乙腈）和水相（水、5 mmol/L乙酸铵、0.1%甲酸、含0.1％甲酸的5 mmol/L乙酸铵水溶液）的不同组合对32种农药分离度的影响。试验结果表明，乙腈+0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相时，32种农药经梯度洗涤完全分离且具有更好的峰值形状和更高的灵敏度。因此，本研究选择乙腈+0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相，此流动相条件下32种农药的保留时间和色谱图如图1所示。

2.1.2 质谱条件的优化

首先对浓度为0.1 μg/mL的32种农药的单标标准液进行母离子扫描、子离子扫描，然后在MRM模式下，对Q1 Pre Bias、Q3 Pre Bias和CE进行参数优化，最终确定质谱参数，见表1。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

对于农药检测来说，常用的提取溶剂有乙腈、甲醇、乙酸乙酯等，以上提取溶剂都可以获得较高的回收率和较宽的农药选择范围。但采用甲醇提取，无法进行后续的盐析除水步骤，甲醇提取后的样品提取液中含有较高浓度的盐分，不适合直接进样分析。与乙腈相比，乙酸乙酯作为提取溶剂，样品提取液中的杂质较多、颜色深，在色谱图上杂质峰较多，因此选择乙腈作为提取溶剂。不同溶剂的提取回收率如图2所示。

图2 不同提取液条件下部分农药的回收率

Fig.2 Recovery rates of pesticide drugs under different extraction conditions

2.2.2 净化方法的选择

农药的多残留检测中目前最常用的方法是QuEChERS法，净化填料包括PSA、GCB、C₁₈、PSA，应用普通的QuEChERS方法时，有必要再进一步进行混合填料的比较研究。本方法采用国家标准GB 23200.113—2018《食品安全国家标准 植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》的QuEChERS方法和高效QuEChERS样品前处理试剂盒的净化方式进行了比较，通过对12种农药回收率的测定来确定样品净化的最佳条件，不同净化方式的药物回收率如图3所示。

图3 不同净化方法下部分农药的回收率

Fig.3 Recovery rates of pesticide drugs under different purification methods

传统的QuEChERS方法需先加入乙腈再加入硫酸铵。而高效QuEChERS样品前处理试剂盒在萃取管中先添加有硫酸铵，还设置了用于在提取后续步骤中加入的单独包装的盐包。其中，萃取管中的硫酸铵可以保证溶液的pH值与传统QuEChERS法中的醋酸-醋酸钠缓冲体系结果一致，保证了不同种类待测物在体系中的化学稳定性并能够提高提取效率。专有的盐包，不仅使用方便，更加避免了直接称量、导入时化合物洒出，操作方便，有利于环境且有利于方法的重复性。不仅如此，还避免了传统QuEChERS法在提取过程中先加入无水硫酸镁/钠与无机盐，硫酸镁结块且发热量过大，尤其是在化合物种类多、性质各异的情况下，容易引起易挥发待测物的损失。

实验结果表明，经高效QuEChERS样品前处理试剂盒净化后，各化合物得到了较好的回收率，普遍比经传统的QuEChERS方法净化后的回收率高，并且操作简便。因此，本研究选择高效QuEChERS样品前处理试剂盒的净化方式。

2.3 方法学验证

将空白基质按1.2所述处理，并绘制混合工作曲线。以被测组分的浓度为横坐标，被测组分的峰面积为纵坐标拟合工作曲线。向空白样品中添加不同质量的标准溶液，以3倍信噪比和10倍信噪比分别计算出方法的检出限和定量限。向空白样品中分别添加32种农药的混合标准溶液，分别制成3个浓度水平的模拟加标样品，每个浓度水平做6个平行样品，按上述样品前处理方法和液相色谱/质谱条件分别进行测定，并按照加标量和测定值计算回收率。

各化合物的线性回归方程、相关系数、检出限、定量限见表2。实验结果表明，32种农药的相关系数均高于0.9985，回收率为75%～113%，相对标准偏差为0.132%～6.73%，方法检出限为0.003～0.015 mg/L，方法定量限为0.01～0.05 mg/L。

2.4 实际样品检测

采用本方法检测养殖用水样品中32种农药残留，结果显示，水产养殖环境中32种农药的测定值均在合理范围内。

3 结论

本研究建立了水产养殖用水中同时测定32种农药的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，32种农药的方法检出限为0.003～0.015 mg/L，定量限为0.01～0.05 mg/L。采用改良的QuEChERS样品前处理试剂盒净化方法，有效避免了易挥发农药的损失，方法简便、快速、灵敏、重现性好，符合实验分析要求，为养殖用水中农药残留监控及畜禽动物的安全饲养提供了技术支持。

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强度 (cps)

保留时间 (min)

图1 32种农药的保留时间和色谱图

Fig.1 Retention time and chromatograms of 32 pesticide drugs

表1 32种农药的质谱参数

Table 1 Mass spectrum parameters of 32 pesticide drugs

注: “*”代表定量离子

表2 32种农药的线性范围、相关系数、方法定量限、回收率、相对标准偏差

Table 2 Curve range, correlation coefficient, method quantification limit, recovery rate and relative standard

deviation of 32 pesticide drugs

表2（续）