莫敏 郑文 明德旺 文方 谢娅芹 张梦婷 李贤良 郗存显

莫 敏 ¹ 郑 文 ¹ 明德旺 ¹ 文 方 ¹ 谢娅芹 ¹ 张梦婷 ² 李贤良 ¹ 郗存显 ^{1 *}

摘 要 本研究利用荧光共振能量转移原理（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET），合成功能化石墨烯荧光探针用于检测结球甘蓝中的马拉硫磷。通过自下而上的方法对丝氨酸（L-Ser）、赖氨酸（L-Lys）和柠檬酸的混合物进行热解反应，得到功能化石墨烯量子点（S-L-GQDs）。其与氨基修饰的马拉硫磷适配体（O-Apt_m）通过共价连接，生成O-Apt_m-S-L-GQDs连接物，表现出优异的荧光性能。氧化石墨烯（GO）与O-Apt_m-S-L-GQDs作用引起荧光淬灭，在目标物马拉硫磷存在下，使得GO从O-Apt_m-S-L-GQDs表面脱落而恢复荧光，进而指示体系中马拉硫磷的检测。本方法的线性范围为5～500 μg/L，相关系数R为0.9996，定量限为10.0 μg/kg，对结球甘蓝样品中马拉硫磷添加回收率为80.9%～107%，相对标准偏差（RSD）为6.1%～8.9%。研究结果表明O-Apt_m荧光探针法可用于马拉硫磷的快速检测，也为其他农药残留的快速检测提供了一种新的手段。

关键词 石墨烯量子点；马拉硫磷；荧光检测

Detection of Malathion in Cabbage by Graphene Quantum Dot Fluorescent Probe

Mo Min¹ Zheng Wen¹ Ming De-Wang¹ Wen Fang¹ Xie Ya-Qin¹

Zhang Meng-Ting² Li Xian-Liang¹ Xi Cun-Xian^1*

Abstract This study utilized the principle of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to synthesize a functional graphene fluorescent probe for detecting malathion in cabbage. Functional graphene quantum dots (S-L-GQDs) were obtained via the pyrolysis of a mixture of serine (L-Ser), lysine (L-Lys), and citric acid using a bottom-up approach. These S-L-GQDs were covalently connected to an amino modified malathion aptamer (O-Apt_m), forming O-Apt_m-S-L-GQDs linkers, exhibiting excellent fluorescence properties. The interaction between graphene oxide (GO) and O-Apt_m-S-L-GQDs results in fluorescence quenching. In the presence of the target substance malathion, GO falls off the surface of O-Apt_m-S-L-GQDs and restores fluorescence, indicating the detection of malathion in the system. The method demonstrated a linear range of 5-500 μg/L, with a correlation coefficient of 0.9996 and a quantification limit of 10.0 μg/kg. The recovery rate of malathion spiked in cabbage samples ranged from 80.9% to 107%, with relative standard deviations (RSD) between 6.1% and 8.9%. The research results indicate that the O-Apt_m fluorescent probe method can be used for rapid detection of malathion, and also provides a promising approach for rapid detection of other pesticide residues.

Keywords graphene quantum dots; malathion; fluorescence detection

基金项目：重庆市技术创新与应用发展专项面上项目（CSTB2022TIAD-GPX0030）

第一作者：莫敏（1987—），女，汉族，重庆江津人，硕士，工程师，主要从事食品安全检测工作，E-mail: 497040142@qq.com

通信作者：郗存显（1982—），男，汉族，山东省曹县人，硕士，研究员，主要从事食品安全检测工作，E-mail: cqxicx@163.com

1. 重庆海关技术中心 重庆 401000

2. 长江师范学院 重庆 408100

1. Technical Center of Chongqing Customs, Chongqing 401000

2. Yangtze Normal University, Chongqing 408100

在农业生产中，农药可以预防控制病虫草害，在维持高效的农业生产力方面发挥着重要作用。有机磷（OPPs）属于农药中使用最早且最多的一类，被广泛用作杀虫剂、杀菌剂等^[1-2]，但其易在水土环境及农作物中残留。国内外时有关于因农药残留引发食品安全问题的报道，是社会各界关注的问题之一^[3]。

食品中常见的有机磷农药残留检测技术有气相色谱法、气相色谱质谱法、液相色谱质谱法、电化学传感法等，其在食品安全检测方面发挥了重要作用，但普遍存在样品前处理复杂、设备成本高、检测周期长等问题。荧光分析法因其操作过程简单，以及其高选择性和高灵敏度等优点，被应用于食品安全、化学及生物分析领域^[4-8]。近年来，稀土上转换纳米粒子^[9]、金属纳米簇^[10]、石墨烯量子点（GQDs）^[11]等发光材料被应用于荧光分析中。GQDs集尺寸效应及量子限域于一体，还同时具有较好的光学稳定性及生物相容性。同时，GQDs的光学性质可通过引入功能化官能团及掺入杂原子或改变石墨烯片层的大小得到有效调控，为开发特殊功能的荧光探针带来可能^[12-17]。

本研究通过自下而上的方式将丝氨酸（L-Ser）、赖氨酸（L-Lys）和柠檬酸的比例混合物通过热解得到具有高荧光性能的功能化石墨烯量子点S-L-GQDs，其可与马拉硫磷适配体（O-Apt_m）通过共价连接生成拥有荧光性能的O-Apt_m-S-L-GQDs连接物荧光探针。该荧光探针通过π-π堆叠与氧化石墨烯（GO）结合，使得GO吸附在探针的表面，引起荧光猝灭。当目标物马拉硫磷出现时，因其与O-Apt_m的特异性结合，迫使GO从连接物表面脱落，从而恢复荧光。本研究基于OPPs、GO与O-Apt_m-S-L-GQDs之间的荧光共振能量转移，通过荧光的“turn-on-off-on”开发一种测定有机磷的荧光分析方法，旨在实现对马拉硫磷的快速检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

荧光分光光度计（RF-5301PC，日本）；丝氨酸（L-Ser）、赖氨酸（L-Lys）、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐（EDC）、磺化-羟基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）（上海麦克林生化科技有限公司）；马拉硫磷（Bepure）；柠檬酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、六水氯化镁、氯化钾（重庆川东化工（集团）有限公司）；氧化石墨烯（GO）（北京科德岛金科技有限公司）；无水磷酸氢二钠（成都市科隆化学品有限公司）；实验用水均为超纯水。马拉硫磷适配体：NH₂-C6-5′-ATCCGTCACACCTGCTCTTATACACAATTGTTTTTCTCTTAACTTCTTGACTGCTGGTGTTGGCTCCCGTA-3′（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.2 S-L-GQDs的合成

将L-Ser∶L-Lys∶柠檬酸＝3∶1∶3（摩尔比）置于250 mL烧杯中，加入10 mL超纯水后超声至完全溶解。于加热板上蒸发干后于180℃烘箱中恒温加热3 h，得到S-L-GQDs固体粗产品。将制得的粗产品用超纯水溶解，NaOH溶液调pH至7.0后透析24 h，其间每6 h更换一次水，去除未反应物，最后置于80℃真空烘箱干燥得到S-L-GQDs。

1.3 O-Apt_m-S-L-GQDs连接物的制备

O-Apt_m适配体经离心60 s后，加入适量的Tris/Mg/K缓冲液（pH 8.0；10 mmol/L Tris-HCl、4 mmol/L MgCl₂和15 mmol/L KCl）溶解，于-20℃冰箱避光储存。再将合成的S-L-GQDs溶于PBS缓冲液（0.1 mol/L）调节pH至5.0左右，促进S-L-GQDs的质子化。加入50 mg EDC和50 mg Sulfo-NHS于上述溶液中，室温搅拌0.5 h，活化S-L-GQDs的羧基。再将反应液用PBS调节pH至7后加入准备好的O-Apt_m适配体，室温下缩合反应2 h，得到O-Apt_m-S-L-GQDs复合物，再用透析袋透析24 h，4℃低温避光备用。

1.4 试样制备

从超市购买结球甘蓝样品，按照GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》取样部位执行，充分混匀，用组织捣碎机匀浆。称取5 g样品置于50 mL离心管中，并加入10.0 mL超纯水，摇匀，振荡30 min，然后于4000 r/min离心5 min。收集澄清的上清液，经滤膜过滤后待用。取适量滤液至GO/O-Apt_m-S-L-GQDs反应体系，经荧光分光光度计分析。

2 结果与分析

2.1 材料与表征

石墨烯片层通过柠檬酸分子间缩合形成sp²碳原子杂化，L-Ser和L-Lys中的氨基与石墨烯片层上的羧基发生分子间脱聚合形成酰胺键，增加石墨烯片层上的功能化官能团，有效提高其反应活性及光学特性。如图1所示，通过HRTEM表征图（图1A）可以看出所制得的石墨烯量子点具有良好的单分散性质，图像上看出S-L-GQDs外貌呈现球形，尺寸分布在10～20 nm。从SEM表征图（图1B）可以看出材料呈明显的片层结构。且AFM表征图（图1C）显示S-L-GQDs的高度为2.2 nm，由2～3个石墨烯片层组成；XRD表征图（图1D）中在2θ（Theta）＝20°处有相对较宽的峰，进一步证明了S-L-GQDs具有无序的石墨烯结构。FT-IR表征图（图1E）表明单属于柠檬酸、赖氨酸和丝氨酸的特征峰已经消失，在3300～3400 cm^-1附近出现的宽峰为N-H键及O-H键的伸缩振动，以及不单属于原料的振动峰的出现，分别位于1690 cm^-1属于C = O的特征峰，酰胺键的特征峰1569 cm^-1和1392 cm^-1，分别归属于酰胺中C = O和C-N伸缩振动。同时在1200 cm^-1出现的峰也表明酯键的存在，也是柠檬酸与氨基酸之前发生了分子间脱聚合，进一步表明功能化石墨烯量子点的成功制备。图1F是O-Apt_m、S-L-GQDs、O-Apt_m-S-L-GQDs的紫外吸收光谱图。O-Apt_m是蛋白质，在260 nm左右有特征吸收峰（图1F，黑线），与S-L-GQDs相比，O-Apt_m-S-L-GQDs在260 nm处也有特征吸收，证明O-Apt_m成功连接到S-L-GQDs上，O-Apt_m-S-L-GQDs连接物的成功制备。

2.2 S-L-GQDs和O-Apt_m-S-L-GQDs的荧光特性

本研究考察了不同激发波长与发射波长下S-L-GQDs及O-Apt_m-S-L-GQDs的荧光发射光谱与激发光谱（图2）。图2A和图2B显示S-L-GQDs在360 nm处有最大的激发波长，在450 nm处有最大的发射波长，图2C是S-L-GQDs的激发与发射光谱图重合图。图2D和图2E显示O-Apt_m-S-L-GQDs在370 nm处有最大的激发波长，在460 nm处有最大的发射波长，图2F是O-Apt_m-S-L-GQDs的激发与发射光谱图。与S-L-GQDs相比，O-Apt_m-S-L-GQDs的最大激发波长和发射波长均红移10 nm，间接证明O-Apt_m-S-L-GQDs连接物的成功制备。图3表明S-L-GQDs和O-Apt_m-S-L-GQDs在其最大激发波长和发射波长下，都表现出较强的荧光性能，且S-L-GQDs的荧光性能也未因O-Apt_m的引入而产生较大变化。

2.3 荧光探针传感机制

根据OPPs、GO与O-Apt_m-S-L-GQDs之间的荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）原理，设计了荧光量子点传感机理如图4所示。O-Apt_m-S-L-GQDs在370 nm的激发光下拥有较强的荧光性能。当体系中加入GO时，由于O-Apt_m与GO之间的π-π堆叠以及分子间氢键作用，使得O-Apt_m-S-L-GQDs连接物吸附在GO表面引起荧光的猝灭。当往体系中加入目标物OPPs时，目标物与O-Apt_m-S-L-GQDs特异性结合引起GO从O-Apt_m-S-L-GQDs表面脱落，从而实现荧光恢复。基于此荧光的“turn-on-off-on”现象，可对马拉硫磷开展荧光检测。

2.4 条件优化

通过考察GO淬灭O-Apt_m-S-L-GQDs荧光强度的浓度和时间来进行反应条件的优化。如图5A所示，体系的荧光强度随着GO的浓度增大而逐渐降低，当GO的浓度增加到80 μg/mL时，O-Apt_m-S-L-GQDs的荧光强度降低75%左右，之后体系的荧光强度并未随着GO浓度的增加而有较大的变化，最终选择GO淬灭浓度为80 μg/mL。当GO加入到反应溶液中时，O-Apt_m-S-L-GQDs荧光强度迅速下降，如图5B所示，在淬灭开始的1 min左右，荧光强度极速下降了78%，之后下降不明显趋于稳定，为优化分析时间，淬灭时间确定为3min。

2.5 马拉硫磷的检测

在最优检测条件下，当反应体系中目标物马拉硫磷的浓度逐渐增大，体系的荧光强度逐渐增大，如图6所示，体系荧光强度（Fluorescence Intensity，FL）和马拉硫磷浓度的对数值（logC）在5～500 μg/L之间存在较好的线性关系。荧光探针传感器检测结球甘蓝中的马拉硫磷采用标准溶液建立校准曲线方程为F = 101.66logC + 48.71，相关系数R为0.9996、定量限为10.0 μg/kg。本方法与现行有效或报道的检测方法进行方法对比性能相当，见表1。

2.6 选择性实验

为了考察本实验的特异性，选择敌敌畏、辛硫磷、甲基对硫磷等5种常见有机磷农药以待测物马拉硫磷10倍添加水平分别加入到GO/O-Apt_m-S-L-GQDs体系中，结果如图7所示，其他有机磷农药的加入并未使体系的荧光强度发生明显变化，表明其他有机磷农药不会与O-Apt_m进行特异性结合从而导致O-Apt_m-S-L-GQDs从GO表面脱落，只有体系存在目标物马拉硫磷时，因其与O-Apt_m之间的特异性结合，使得GO从O-Apt_m-S-L-GQDs的表面解吸下来，荧光恢复。因此，本实验可以证明GO/O-Apt_m-S-L-GQDs荧光探针传感器具有目标选择性，可以用于实际应用。

2.7 实际样品中马拉硫磷的检测

对本方法检测结果进行方法学验证，以结球甘蓝为基质，开展10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg基体加标实验，每水平重复6次。由表2可以看出，本方法添加回收率在80.9%～107%之间，相对标准偏差（RSD）在6.1%～8.9%之间。同时，采用GC-MS/MS进行方法比对，其添加回收率在81.3%～106%之间，相对标准偏差（RSD）在4.2%～8.8%之间。通过实验比对，两种方法对实际样品的检测结果保持一致。结果表明荧光探针传感器检测方法可用于实际检测。

3 结论

本研究通过自下而上热解L-Ser、L-Lys和柠檬酸的混合物，得到功能化的石墨烯量子点S-L-GQDs。该量子点与马拉硫磷适配体特异性结合生成荧光探针O-Apt_m-S-L-GQDs，具有优异的荧光性能。通过实验建立的有机磷荧光检测方法，特异好、检测范围宽、灵敏度高，在实验基质加标实验中与现行标准方法检测结果一致，可用于结球甘蓝的快速检测。

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图2 S-L-GQDs的激发波长光谱图（A）、发射波长光谱图（B）、激发波长与发射波长光谱重叠图（C）和O-Apt_m-S-L-GQDs的激发波长光谱图（D）、发射波长光谱图（E）、激发波长与发射波长光谱重叠图（F）

Fig.2 The excitation wavelength spectrum (A), emission wavelength spectrum (B), and excitation wavelength emission wavelength spectrum overlap graph (C) of S-L-GQDs, the excitation wavelength spectrum (D), emission wavelength spectrum (E), and excitation wavelength emission wavelength spectrum overlap graph (F) of O-Apt_m-S-L-GQDs

图3 S-L-GQDs和O-Apt_m-S-L-GQDs的荧光性能图

Fig.3 The fluorescence performance diagram of S-L-GQDs and O-Apt_m-S-L-GQDs

图4 荧光量子点传感机理图

Fig.4 Sensing mechanism diagram of fluorescent quantum dots

A

B

图5 GO的浓度优化（A）和时间优化（B）曲线图

Fig.5 Concentration optimization (A) and time optimization (B) curves of GO

荧光强度 (a.u.)

logC_马拉硫磷

图6 马拉硫磷荧光探针检测标准曲线图

Fig.6 Standard curve of malathion detection using the fluorescent prob

表1 不同方法检测马拉硫磷的性能比较

Table 1 Comparison of performance of different methods for detecting malathion

注: “/”表示无相关信息

表2 方法比对检测结球甘蓝中马拉硫磷的精密度和准确度

Table 2 Comparison of precision and accuracy of methods for detecting malathion in cabbage

图7 O-Apt_m-S-L-GQDs体系检测马拉硫磷的特异性实验

Fig.7 The specificity experiment of O-Apt_m-S-L-GQDs system for detecting malathion