任宇捷 王琳丽 侯颖 杨菲 王占坤 陈芊如 邱烨 王艺凯

任宇捷 ¹ 王琳丽 ¹ 侯 颖 ¹ 杨 菲 ¹ 王占坤 ² 陈芊如 ³ 邱 烨 ¹ 王艺凯 ^{1 *}

摘 要 灵敏、准确的检测方法是判断化妆品质量的必要手段。尽管传统的金标准培养法已得到优化，但在面对化妆品中复杂且微量的病原菌检测时，还有一定的提升空间。与此同时，新兴的核酸检测技术，特别是以高灵敏度、便捷性和时效性为特点的方法，如数字PCR（Digital Polymerase Chain Reaction，dPCR），正逐步成为化妆品病原菌检测的重要技术。本文综述了当前化妆品中病原菌检测技术的研究进展，并展望了新兴核酸检测技术特别是数字PCR在化妆品微生物质量检测方面的应用前景，可为未来化妆品安全检测提供技术参考与指导。

关键词 化妆品；病原菌；核酸检测技术

The Current Status and Prospect of Nucleic Acid Detection for Pathogenic Bacteria in Cosmetics

REN Yu-Jie¹ WANG Lin-Li¹ HOU Ying¹ YANG Fei¹

WANG Zhan-Kun² CHEN Qian-Ru³ QIU Ye¹ WANG Yi-Kai^1*

Abstract Sensitive and accurate detection methods are essential for assessing the quality of cosmetics. Although the traditional gold standard culture method has been optimized, its limitations are increasingly apparent when confronted with the complex and trace-level detection of pathogens in cosmetics. Concurrently, emerging nucleic acid detection technologies, particularly those renowned for their high sensitivity, convenience, and timeliness, such as Digital Polymerase Chain Reaction (dPCR), are gradually becoming the preferred choice for pathogen detection in cosmetics. This article reviews the current research progress in pathogen detection technologies for cosmetics and anticipates the application prospects of the latest nucleic acid detection technologies, particularly dPCR, in microbial quality control of cosmetics. The aim is to provide technical references and guidance for future cosmetics safety testing.

Keywords cosmetics; pathogenic bacteria; nucleic acid detection technologies

基金项目：海关总署科研项目（2024HK238）

第一作者：任宇捷（1994—），女，汉族，山西太原人，博士，工程师，主要从事海关仪器研发与验证评价工作，E-mail: renyujie168@163.com

通信作者：王艺凯（1982—），男，汉族，北京人，硕士，高级工程师，主要从事海关仪器研发与验证评价工作，E-mail: wangyikai_2001@163.com

1. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

2. 北京新羿生物科技有限公司 北京 102299

3. 清华大学医学院生物医学工程系 北京 100084

1. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

2. Xinyi Biotechnology (Beijing) Co., Ltd., Beijing 102299

3. Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084

化妆品成分复杂，若被微生物污染则可能出现色泽和气味等变化^[1]，且有传播致病微生物的风险^[5-12]。我国对化妆品的微生物质量有明确规定：（1）眼部、口唇、口腔黏膜用化妆品以及婴儿和儿童用化妆品细菌总数不得大于500 CFU/mL或500 CFU/g；（2）其他化妆品细菌总数不得大于1000 CFU/mL或1000 CFU/g；（3）霉菌和酵母菌总数不得大于1000 CFU/mL或1000 CFU/g；（4）每克或每毫升产品中不得检出粪大肠菌群、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌^[13]。美国个人护理产品协会（Personal Care Products Council，PCPC）和国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）规定不得检出病原菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌^[14-15]。

目前化妆品中病原菌的检测以传统的细菌学培养方法为主，该方法具有灵敏度高、可以区分活菌和死菌等优点，但所需时间长，操作复杂，且容易受化妆品中防腐剂影响，使其难以满足经济全球化趋势下化妆品快速流通的检测要求。同时，随着人们对化妆品质量要求的提高和科学技术的发展，对化妆品中病原菌检测方法的简捷性、灵敏度和特异性等提出了更高的要求^[16-18]。核酸检测以其特异性强、操作简便、耗时短的特点已经被广泛用于各种病原体的检测。数字PCR（Digital Polymerase Chain Reaction，dPCR）作为第三代PCR技术，以其在核酸检测中灵敏度高、定量性强、耐抑制性能好等特点受到生物检测领域业内人士越来越多的关注。

1 化妆品中病原菌传统检测方法

1.1 培养法

培养法是各种类型样本中微生物检测的金标准，也是《化妆品技术规范》（2015年版）和GB/T 7918《化妆品微生物标准检测方法》系列标准中采用的方法。培养法操作过程包括样品前增菌、选择性增菌、菌落计数等，一般需要4～7 d才能报告结果^[13]，检测方法繁琐，费时耗力，结果易受人员、试剂等因素影响。因此，相关研究人员对该种方法在样本处理、培养基组成等方面进行了改进，部分研究的具体改进步骤及效果见表1。

1.2 高灵敏仪器检测法

国标培养法的检测结果容易受人工操作和主观判断的影响，而且为了更易于人眼的判断，需要对样本进行较长时间的培养。荧光光电法等检测技术具有灵敏度高的优势，被用来检测化妆品中的微生物时只需要进行短时间的增菌，大大缩短了检测周期，仪器直接判读也降低了人为因素的干扰。此外，一些商品化的全自动、一体化的检测设备和相应的检测试剂盒也可以用来检测化妆品中的微生物，不但用时更短，而且简化了操作，进一步减少了人为因素影响。具体的检测技术和相应用时比较见表2。

改进后的病原菌检测方法有效提升了化妆品检测的操作简便性和结果准确度，而且高灵敏仪器的引入在一定程度上增加了检测的灵敏度和实效性，但这些方法只能够对微生物进行定性检测，无法对化妆品中的病原菌进行精确定量。而按照我国《化妆品安全技术规范》（2015年版），对病原菌的准确定量是判定化妆品是否合格的重要标准。

2 化妆品中病原菌核酸检测方法

由于病原菌的核酸在化妆品中不易受防腐剂等成分的影响，并且具有较好的种属特异性等特点，因此常被用来作为检测的靶标。以核酸为靶标的检测方法包括PCR法^[25]、多重PCR法^[26]、环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）法^[27]和荧光定量PCR（实时荧光PCR）法^[28]等。其中，PCR法和荧光定量PCR法因其较高的灵敏度和可重复性被海关检验标准所采用^[29-31]。

不同检测方法的性能比较见表3。LAMP法、PCR法和多重PCR法具有较高的灵敏度，且检测时间都在5 h以内，可用于特定病原菌的检测。然而，这些检测方法无法对病原核酸进行定量，因此不能满足对细菌、霉菌和酵母菌总数的检测要求。相比之下，荧光定量PCR法不但检测灵敏度较高且检测时间短，还能够对微生物进行定量分析，符合化妆品中病原菌检测的要求。但由于其需要标准品进行相对定量，导致其检测结果的稳定性和可重复性较低。

3 讨论与展望

随着食品、饮用水、环境卫生的改善和医疗水平的提高，我国居民人均预期寿命不断增长，病原菌对人民群众健康的威胁显著降低。在这一过程中，病原菌的精准检测起到了至关重要的作用。

随着生活水平的提高，化妆品已成为人们生活中重要的日常生活用品。根据相关研究，化妆品中的病原菌污染仍是影响产品质量和安全性的关键因素^[32-34]，亟需采取有效的检测方法加以控制。因此，建立更加高效、精准的化妆品病原菌检测技术显得尤为重要。

目前，作为化妆品病原菌检测的金标准，培养法已经得到了较大改进，同时荧光光电法、生化比色法和质谱法等高灵敏的检测技术也在应用中取得了良好效果，但这些方法仍无法实现微生物的准确定量，且检测结果的稳定性存在一定不足。相比之下，核酸检测法，包括PCR法、多重PCR法、LAMP法和荧光定量PCR法，以其操作简便、用时短等特点，被广泛用于化妆品病原菌检测中。但在灵敏度、检测结果的稳定性和定量的准确性等方面，核酸检测法仍有提升空间。

近年来，作为第三代PCR技术，数字PCR技术因其高灵敏度、高定量准确度、强耐抑制能力以及适合多重联检等特点，已成为化妆品病原菌检测的潜在新利器。虽然目前数字PCR技术在化妆品病原菌检测中的应用尚处于初级阶段，但研究初步表明数字PCR技术已能够在沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病原菌检测中发挥作用^[35-39]。未来，数字PCR技术有望成为我国化妆品病原菌检测的重要工具，为提升我国在该领域的技术水平提供支持，并推动化妆品病原菌检测标准和关键控制指标的完善。

参考文献

[1]李青彬, 赵晓军, 王香, 等. 化妆品微生物污染状况及其分析[J]. 中国卫生检验杂志, 2006, 16(2): 245-247.

[2]方光远, 周素兰, 彭国丽, 等. 毛囊炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定与药敏试验[J]. 金陵科技学院学报, 2006, 22(3): 83-86.

[3]杨增茹, 包东武, 王革新. 金黄色葡萄球菌所致疖病自身菌苗的制备及应用[J]. 新乡医学院学报, 2005, 22(4): 375-377.

[4]云波, 施玉英. 白内障术后绿脓杆菌性眼内炎[J]. 眼科, 1999, 8(3): 152-154.

[5]谢志杰. 社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌肺炎并血流感染1例[J]. 中国感染与化疗杂志, 2020, 20(3): 683-685.

[6]湛取鼎, 王其南. 金黄色葡萄球菌脑膜炎[J]. 四川医学, 1989, 10(4): 217-219.

[7]文强强, 刘岩, 苏子龙, 等. 金黄色葡萄球菌骨髓炎发病机制的研究进展[J]. 实用骨科杂志, 2020, 26(10): 901-905.

[8]王金玉. 金黄色葡萄球菌败血症55例临床分析[J]. 中国医疗前沿, 2011, 6(16): 21-22.

[9]郭宝俊, 张丽萍, 曹小燕. 产超超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌致胆管炎、脓毒症1例[J]. 中国感染控制杂志, 2012, 11(2): 152-153+157.

[10]常海岭, 李月芳, 曾玫, 等. 儿童致泻性大肠埃希菌腹泻临床与病原分布特点[J]. 中华传染病杂志, 2015, 33(3): 137-141.

[11]朱敏丽, 麦菁芸, 朱将虎, 等. 大肠埃希菌致新生儿化脓性脑膜炎31例临床分析[J]. 中国当代儿科杂志, 2012, 14(12): 910-912.

[12]邵娜. 静脉药瘾合并铜绿假单胞菌所致感染性心内膜炎1例[J]. 广东医学, 2011, 32(1): 24.

[13]国家食品药品监督管理总局. 化妆品安全技术规范(2015年版)[S]. 北京: 中国食品出版社, 2015.

[14] Personal Care Products Council. Technical Guidelines-2016 Microbiology Guidelines[S]. Washington D.C: Personal Care Products Council, 2016.

[15] International Organization for Standardization. ISO 18415:2017, Cosmetics-Microbiology-Detection of Specified and Non-Specified Microorganisms [S]. Geneva: ISO, 2017.

[16]陈庆森, 冯永强, 黄宝华. 食品中病原菌的快速检测技术的研究现状与进展[J]. 食品科学, 2003, 24(11): 148-152.

[17] Ricchi M, Bertasio C, Boniotti M B, et al. Comparison among the Quantification of Bacterial Pathogens by qPCR, dPCR, and Cultural Methods[J]. Frontiers in microbiology. 2017, 28(8): 1174.

[18] Nagarajan K, Loh KC. Molecular biology-based methods for quantification of bacteria in mixed culture: perspectives and limitations[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2014, 98(16): 6907-6919.

[19]关嵘. 化妆品中细菌总数、粪大肠菌群、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的快速检验方法[J]. 检验检疫科学, 2003, 13(1): 28-29.

[20]吴娇娇, 吕婷婷, 王皓, 等. 婴幼儿护肤品的微生物检验方法研究[J]. 质量安全与检验检测, 2021, 5(31): 23-26+42.

[21]朱世真, 王立芳, 王尊文. 大肠菌群测试片在化妆品微生物检测中的应用[J]. 中国药师, 2014, 17(9): 1601-1602.

[22]李婷, 沈颖, 蔡俊松, 等. ATP生物荧光增幅法在化妆品微生物检测中的适用性研究[J]. 日用化学工业, 2021, 51(6): 513-521+527.

[23]李萌, 高路, 张昕悦, 等. 荧光光电法检测化妆品中病原菌的研究[J]. 日用化学工业, 2013, 18(4): 321-324.

[24]陶明, 王媛, 郭琦, 等. 5种检测化妆品中金黄色葡萄球菌方法的比较[J]. 广东药科大学学报, 2019, 35(5): 679-683.

[25]高飞, 白东亭, 黄杰, 等. 化妆品中金黄色葡萄球菌的 PCR 快速检测[J]. 环境与健康杂志, 2016, 33(9): 814-816.

[26]杨秀茳, 郭晓苑, 文霞, 等. 多重PCR快速检测化妆品中三种病原菌的研究[J]. 工业微生物, 2016, 46(4): 123-124.

[27]文霞, 李彩玲, 刘静霞, 等. 化妆品中耐热大肠菌群快速检测方法的研究[J]. 日用化学工业, 2019, 49(6): 27-29.

[28]苏建晖, 蔡颖, 许如苏, 等. 以oprⅠ为靶基因实时荧光PCR法检测化妆品中绿脓杆菌[J]. 检验检疫学刊, 2014, 24(4): 45-49.

[29] SN/T 2206.10—2014 化妆品微生物检测方法 第10部分:金黄色葡萄球菌PCR法 [S]. 北京:中国出入境检验检疫出版社, 2014.

[30] SN/T 2206.11—2014 化妆品微生物检测方法 第11部分:金黄色葡萄球菌多重实时荧光PCR法 [S]. 北京:中国出入境检验检疫出版社, 2014.

[31] SN/T 2206.12—2014 化妆品微生物检测方法 第12部分:绿脓杆菌PCR法 [S]. 北京:中国出入境检验检疫出版社, 2014.

[32]戴岚, 宋白薇. 安全使用化妆品[J]. 中国检验检疫, 2008, (1): 61.

[33]朱其太, 华从伶, 张学军. 欧盟首部化妆品法规实施我国企业积极应对[J]. 中国检验检疫, 2013, (8): 47-48.

[34]叶永茂. 关于《化妆品卫生监督条例》修订的思考与建议[J]. 中国检验检疫, 2010, (1): 11-13.

[35] Li L, Bae S. Quantitative detection and survival analysis of VBNC Salmonella Typhimurium in flour using droplet digital PCR and DNA-intercalating dyes[J]. Microbiology Spectrum, 2024, 12(8): e0024924. DOI: 10.1128/spectrum.00249-24.

[36] Suo Y, Yin W, Zhu Q, et al. A specific and sensitive aptamer-based digital PCR chip for Salmonella typhimurium detection[J]. Biosensors (Basel), 2022, 12(7): 458. DOI: 10.3390/bios12070458.

[37] Wu C, Ling M, Chen Q, et al. Multiplex digital PCR-based development and discussion of the detection of genetic association between Staphylococcus aureus and mecA[J]. Infectious Drug Resistance, 2024, 17: 2031-2041.

[38] Qu Y, Liu M, Sun X, et al. Development and evaluation of a triplex droplet digital PCR method for differentiation of M. tuberculosis, M. bovis and BCG[J]. Frontiers in Microbiology, 2024, 15: 1397792. DOI: 10.3389/fmicb.2024.

[39] Zhang T, Niu Z, Wu F, et al. Qualitative and quantitative detection of surgical pathogenic microorganisms Escherichia coli and Staphylococcus aureus based on ddPCR system[J]. Scientific Reports, 2021, 11(1): 8771. DOI: 10.1038/s41598-021-87824-5.

表1 培养检测法的改进及效果

Table 1 Improvement and performance of cultivation detection methods

表2 非培养检测法性能比较

Table 2 Comparison of non-cultivation detection method performance

表3 核酸检测法性能比较

Table 3 Comparison of nucleic acid detection method performance