严旭旭 戴唯 王缅 王兴宁 黄小焕 李志

严旭旭 ¹ 戴 唯 ¹ 王 缅 ¹ 王兴宁 ¹ * 黄小焕 ¹ 李 志 ¹

摘 要 本研究利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole/Electrostatic Field Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry，UPLC-Q/Orbitrap HRMS）技术，建立了同时测定果蔬中10种新型除草剂及杀虫剂残留量的分析方法。果蔬样品经乙腈提取，采用QuEChERS前处理方法，150 mg无水硫酸镁（MgSO₄）＋25 mg十八烷基硅烷（C₁₈）粉末净化处理。以乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，Thermo Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）色谱柱分离待测物，在全扫描和自动触发二级质谱（Full MS/ddMS²）模式下，采用四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱进行测定，基质匹配外标法定量。结果显示，10种新型除草剂及杀虫剂在0.5～100 ng/mL范围内线性良好，相关系数（r²）＞0.99，选择3 个浓度水平进行添加回收率试验（n = 6），平均回收率为70.7%～113.4%，相对标准偏差（Relative Standard Deviations，RSDs）为1.3%～19.0%，定量限为1～5 μg/kg。结果表明，该方法操作简单、快速高效，具有高灵敏度和较好的重复性，适用于果蔬中除草剂及杀虫剂的定性定量分析。

关键词 除草剂；杀虫剂；QuEChERS；高分辨质谱；果蔬

Determination of 10 New Herbicides and Insecticides Residues in Fruits and Vegetables by UPLC-Q/Orbitrap HRMS

YAN Xu-Xu ¹ DAI Wei ¹ WANG Mian ¹ WANG Xing-Ning ^1* HUANG Xiao-Huan ¹ LI Zhi ¹

Abstract This study employed ultra performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC-Q/Orbitrap HRMS) to establish an analytical method for the simultaneous determination of residues of 10 new herbicides and insecticides in fruits and vegetables. The fruits and vegetables samples were extracted by acetonitrile, treated by the QuEChERS pretreatment method and purified by using a mixture of 150 mg anhydrous magnesium sulfate (MgSO₄) and 25 mg octadecyl silane (C₁₈). With acetonitrile and 0.1% formic acid solution as mobile phases for gradient elution, the analytes were separated on a Thermo Hypersil GOLD C18 (100 mm×2.1 mm, 1.9 μm) column, and then determined by HRMS in Full MS/ddMS² modes and quantified by matrix matching external standard method. The 10 new herbicides and insecticides showed a good linear relationship in the range of 0.5-100 ng/mL, and the correlation coefficients (r²) greater than 0.99. Under the three spiked levels (n = 6), the average recoveries were in the range of 70.7%-113.4%, the relative standard deviations (RSDs) ranging 1.3%-19.0%, and the limits of quantitation (LOQ) ranging 1-5 μg/kg. The method is simple, rapid and efficient, with high sensitivity and good repeatability, which is suitable for qualitative and quantitative analysis of herbicides and insecticides in fruits and vegetables.

Keywords herbicides; insecticides; QuEChERS; HRMS; fruits and vegetables

基金项目：海关总署科研项目（2022HK132）

第一作者：严旭旭（1997—），女，苗族，贵州思南人，本科，助理工程师，主要从事食品中农药残留检测技术研究工作，E-mail: 1683254053@qq.com

通信作者：王兴宁（1981—），男，汉族，贵州威宁人，硕士，高级工程师，主要从事食品中农药残留检测技术研究工作，E-mail: 271762880@qq.com

1. 贵阳海关 贵阳 550000

1. Guiyang Customs, Guiyang 550000

除草剂是一种可以消灭或抑制杂草生长的农药，主要用于杀灭杂草，提高果蔬的产量和质量。杀虫剂是一种用于杀死或控制害虫的农药，主要用于保护作物，防治各种虫害。随着科技进步，现代农业致力于开发高效、低毒、低残留的新型环保型农药，包括新型除草剂及杀虫剂，如吡唑草胺（Metazachlor）、氯氟吡啶酯（Florpyrauxifen-benzyl）、氟氯吡啶酯（Halauxifen-methyl）、苯并双环酮（Benzobicyclon）、Tolpyralate、氟吡草酮（Bicyclopyrone）、环溴虫酰胺（Cyclaniliprole）、氰氟虫腙（Metaflumizone）、氟啶虫胺腈（Sulfoxaflor）、3-苯基-5-（噻吩-2-基）-[1,2,4]噁二唑（Tioxazafen）。其中，Tolpyralate是一种对羟基苯基丙酮酸双氧化酶（4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase，HPPD）抑制剂类除草剂，通过与植物体内的HPPD靶标作用，能有效防除许多禾本科杂草及阔叶杂草；3-苯基-5-（噻吩-2-基）-[1,2,4]噁二唑作为新型、高效的噁二唑类杀线虫剂，通过引起线虫体内基因突变来杀死线虫。国家标准GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定了蔬菜中氰氟虫腙的最大残留限量（Maximum Residue Limit，MRL）值为0.02～7 mg/kg，果蔬中氟啶虫胺腈的MRL值为0.01～6 mg/kg。目前，GB 2763—2021中尚未制定果蔬中氟氯吡啶酯、环溴虫酰胺、氟吡草酮等农药的MRL值。

国内外关于除草剂及杀虫剂残留常用的检测方法包括液相色谱法（Liquid Chromatography，LC）^[5-6]、气相色谱-串联质谱法（Gas Chromatography Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）^[7]、液相色谱-串联质谱法（Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）^[8-9]和高分辨质谱法（High Resolution Mass Spectrometry，HRMS）^[10-11]。近年来，高分辨质谱技术的分辨率及扫描速度显著提高^[12]，与传统三重四极杆质谱相比，静电场轨道阱高分辨质谱因其选择好、分辨率高、抗干扰能力强等优势^[13]，能够快速筛查目标化合物，满足当下对除草剂及杀虫剂残留快速监测的现实需求。QuEChERS是一种通过利用不同吸附剂与样品基质中的杂质发生反应的前处理技术^[14]，因具有简便、经济、分析速度快、净化效果好等优点，在检测果蔬农药残留等领域广泛应用。

目前，关于这10种新型除草剂及杀虫剂的检测主要为单组分或同其他组分检测，且未见高分辨质谱技术同时检测果蔬中吡唑草胺、氟氯吡啶酯、氰氟虫腙、氟吡草酮等10种新型除草剂及杀虫剂的相关报道。因此，本研究通过对QuEChERS的改良和优化，建立了一种利用高分辨质谱同时测定果蔬中10种新型除草剂及杀虫剂残留的分析方法，对于保障食品安全和保护消费者健康具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Q-Exactive Q/Orbitrap HRMS配备UltiMate U3000系统（美国Thermo Fisher Scientific）；分析天平（BP121S，梅特勒-托利多）；离心机（TG-16，四川蜀科）；多管涡旋混匀仪（SDC-3000，深圳逗点）；超纯水装置（Milli-Q，美国Millipore）。

1.2 材料与试剂

乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck）；甲酸（色谱纯，上海安谱）；无水硫酸镁（MgSO₄，国药集团）；十八烷基硅烷（C₁₈）；石墨化碳黑（GCB）；N-丙基乙二胺（PSA）（上海安谱）；EN盐包：4 g MgSO₄，1 g NaCl，1 g柠檬酸钠，0.5 g柠檬酸氢二钠（美国Agilent）。

10种农药标准品：吡唑草胺、氯氟吡啶酯、氟氯吡啶酯、苯并双环酮、Tolpyralate、氟吡草酮、环溴虫酰胺、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、3-苯基-5-（噻吩-2-基）-[1,2,4]噁二唑（100 μg/mL，天津阿尔塔）

本研究所有果蔬样品均为实验室日常检测样品。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

分别准确吸取适量10种农药标准溶液，用乙腈配制成1 μg/mL混合标准溶液。

基质匹配标准工作溶液的配制：取适量的混合标准溶液，用空白基质溶液稀释，环溴虫酰胺、Tolpyralate、氟啶虫胺腈、3-苯基-5-（噻吩-2-基）-[1,2,4]噁二唑浓度分别为：1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL，吡唑草胺、氯氟吡啶酯、氟氯吡啶酯、苯并双环酮、氟吡草酮、氰氟虫腙浓度分别为：0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL。

1.3.2 样品前处理

提取：准确称取10 g（准确到0.01 g）样品到50 mL离心管中，加入10 mL乙腈涡旋振荡5 min，立即加入EN盐包继续振荡混匀，10000 r/min离心5 min。

净化：吸取1.5 mL上清到净化管中（含150 mg MgSO₄、25 mg C₁₈），涡旋2 min，10000 r/min离心5 min，取上清过滤后上机测定。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脱）；柱温：35℃；进样量：5 μL；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱程序：0～5 min，10% B；5～6 min，5% B～100% B；6～8.5 min，100% B；8.5～8.6 min，100% B～5% B；8.6～9.6 min，5% B～10% B；9.6～12 min，10% B。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源（HESI⁺/HESI^－）；喷雾电压：＋4.5 kV/-2.5 kV；鞘气（氮气）：流速40 arb；辅助气（氮气）：流速12 arb；毛细管温度：350℃；辅助气加热温度：300℃；运行时间：12 min；扫描模式：Full MS/ddMS²；扫描范围：100～1300 m/z；一级质谱分辨率：70000；二级质谱分辨率：17500；自动增益控制目标离子数：1e⁶；归一化碰撞能量：10 eV、20 eV、50 eV。10种化合物的质谱参数信息见表1。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

利用Full MS/dd-MS²扫描模式，分别在正、负离子模式下对混合标准溶液进行分析。设置扫描范围为100～1300 m/z、分辨率为70000，采用一级质谱全扫描模式，得到待测化合物的保留时间及精确质量数。使用自动触发二级质谱模式，设置目标物列表，得到每种目标化合物的二级碎裂质谱图。选择精确母离子质量数作为定量离子、2个响应强度较高的二级质谱碎片离子作为定性离子。结果发现，氰氟虫腙、氟啶虫胺腈和环溴虫酰胺在负离子模式下的响应要明显高于正离子模式，可形成稳定的[M-H]^-离子峰，其余7种化合物采用正离子模式的响应高于负离子模式，可形成稳定的[M+H]⁺离子峰，所以最终采用正、负离子同时扫描模式下进行测定。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

本实验对比了Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，后称BEH C18柱）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，后称T3柱）以及Thermo Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，后称GOLD C18柱）色谱柱对目标化合物的保留和分离情况。结果发现，BEH C18色谱柱上提取Tolpyralate时有明显的杂峰，并且氟吡草酮出现较严重的拖尾峰，在T3色谱柱上提取氟啶虫胺腈时峰形较差，由于目标化合物在GOLD C18色谱上均有较好的分离效果，峰响应整体较高，且峰形更尖锐，所以采用GOLD C18色谱柱。

2.2.2 流动相的选择

选择常用的甲醇及乙腈作为有机相进行对比，发现在乙腈作为流动相时，目标物的响应及分离度优于甲醇，所以选择乙腈作为有机相。水相方面，选择了纯水、0.1%甲酸水溶液、2 mmol/L甲酸铵＋0.1%甲酸水溶液、2 mmol/L甲酸铵水溶液及5 mmol/L乙酸铵＋0.1%甲酸水溶液进行对比。结果表明，水相中用水作为流动相时，氟吡草酮和氟啶虫胺腈出现拖尾现象。因此，选择在流动相中添加适量缓冲盐或酸，有改善化合物峰形以及增强离子化效果的作用，提高分析灵敏度^[15]。当0.1%甲酸水溶液作为流动相时，所有化合物的分离效果更好，响应值更高，且色谱峰峰形得到明显改善。因此，最终选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。按照上述质谱条件和色谱条件进行分析，优化后的10种除草剂及杀虫剂的提取离子流图如图1所示。

2.3 提取溶剂的选择

在果蔬农药残留分析中，常使用乙腈和甲醇作为提取溶剂^[16]。本方法分别对比了乙腈和甲醇的提取效率，发现采用甲醇提取时，10种目标化合物回收率低。由于乙腈对农药的溶解性较强，用乙腈提取时化合物的回收率较好，均能满足实验分析要求。因此，进一步比较了乙腈、0.1%（v/v）甲酸乙腈、1%（v/v）甲酸乙腈、0.1%（v/v）乙酸乙腈、1%（v/v）乙酸乙腈对化合物的提取效率。结果表明，乙腈和1%（v/v）甲酸乙腈作为提取溶剂时，均能较好地提取10种目标化合物，且回收率较好，因此考虑到操作的方便性，本实验选择乙腈作为提取溶剂。

2.4 脱水剂和净化剂的选择

脱水剂可以除去样品中的水分，使水相和有机相分层，同时促进分析物从水相向有机相中转移^[17]。在QuEChERS方法中，通常选用PSA、C₁₈和GCB对试样进行净化，PSA、C₁₈、GCB能有效去除有机酸、脂类、色素等物质^[18]。本实验对3种脱水剂组合（a：4 g MgSO₄＋1 g NaCl；b：6 g MgSO₄＋1.5 g NaAc；c：4 g MgSO₄＋1 g NaCl＋1 g柠檬酸钠＋0.5 g柠檬酸氢二钠）以及4种净化剂组合（d：150 mg MgSO₄＋25 mg PSA；e：150 mg MgSO₄＋25 mg PSA＋2.5 mg GCB；f：150 mg MgSO₄＋50 mg PSA＋50 mg C18；g：150 mg MgSO₄＋25 mg C₁₈）进行正交试验。称取空白白菜基质10.00 g，添加20 μg/kg的混合标准溶液进行加标回收试验，考察12组脱水剂和净化剂组合对样品提取液的提取效率，结果见表2。结果显示，当使用组合e和组合f净化时，氟吡草酮回收率仅为16.0%～57.2%，说明PSA和GCB对氟吡草酮的吸附较强。使用组合g净化时，氟吡草酮回收率均大于85%，所以使用C₁₈净化效果较好。在组合c-g脱水净化条件下，所有化合物回收率良好，回收率为73.2%～114.6%。因此，综合净化效果、回收率，最终确定脱水剂为组合c（4 g MgSO₄＋1 g NaCl＋1 g柠檬酸钠＋0.5 g柠檬酸氢二钠），净化剂为组合g（150 mg MgSO₄＋25 mg C₁₈）。

2.5 基质效应

在测定复杂基质样品时，易受到基质干扰，影响定量结果，产生增强或抑制效应，这种现象被称为基质效应（Matrix Effects，ME）^[19]。虽然静电场轨道阱高分辨质谱抗干扰能力强，但基质效应依旧存在^[15]。本实验选择空白白菜基质，利用空白基质提取液配制标样的响应值（A）和纯溶剂配制相同质量浓度标样的响应值（B）的比值大小来考察基质效应的影响^[20]。计算公式：ME = B/A，比值＞1.2，表现为基质增强效应；比值＜0.8，表现为基质抑制效应；当比值在0.8～1.2之间，则说明基质效应较小^[21]。结果如表3所示，10种化合物的ME值在0.496～1.319之间，其中氯氟吡啶酯和氰氟虫腙的基质效应较强，分别为基质抑制效应和基质增强效应，基质干扰较大，故本实验选择基质匹配标准工作溶液分析待测物。

2.6 线性关系与定量限

称取空白基质样品，按照1.3.2节样品前处理的步骤进行处理，将制得的空白基质样液分别加入不同浓度的混合标准溶液中稀释，得到基质匹配标准工作溶液，在1.3.3节仪器条件下进行测定。以各目标物的响应作为Y轴，质量浓度为X轴，绘制工作曲线。以信噪比S/N≥10为方法的定量限（Limit of Quantitation，LOQ）。以白菜基质为例，结果见表3，10种化合物在线性范围内有着良好的线性关系，相关系数（r²）均大于0.99。

2.7 回收率与精密度

本实验采用基质匹配外标法定量，分别对4种空白样品进行回收率试验，分别添加3个浓度水平，每个添加水平重复6次，结果见表4。10种目标化合物的平均回收率为70.7%～113.4%，RSD为1.3% ～19.0%，表明该方法精密度良好，有较好的重复性。

2.8 实际样品检测

利用本实验所建立的分析方法，用基质匹配标准工作溶液对实验室日常检测的50份果蔬样品进行定量分析。结果显示，所有样品均未检出目标化合物。

3 结论

本研究在QuEChERS前处理方法的基础上对提取和净化等过程进行优化，建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法同时测定果蔬中10种新型除草剂及杀虫剂残留的检测方法。该方法操作简便，选择性高，回收率良好，定性和定量分析准确，为果蔬中除草剂及杀虫剂残留的风险监测提供了数据支撑，也为农业生产中合理使用农药提供了科学依据。

参考文献

[1]李杨, 马智宏, 李冰茹, 等. 我国主要作物中除草剂登记情况及存在问题[J]. 食品安全质量检测学报, 2018, 9(17): 4483-4488.

[2]孙冰, 秦博, 英君伍, 等. Tolpyralate的合成与除草活性研究[J]. 现代农药, 2020, 19(2): 29-33.

[3]陈晨. 杀线虫剂Tioxazafen应用研究与开发进展[J]. 现代农药, 2018, 17(1): 46-49.

[4] GB 2763—2021. 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量[S]. 北京: 中国农业出版社, 2021.

[5]王博, 侯德粉. 4种常用除草剂的高效液相色谱分析[J]. 农药, 2020, 59(5): 343-346.

[6]周艳明, 陈柏, 田宏哲. 高效液相色谱法测定马铃薯中15种除草剂的残留量[J]. 农药, 2009, 48(10): 749-751+754.

[7]王光英, 赵萍, 张国华, 等. QuEChERS-气相色谱三重四极杆串联质谱法测定小麦中氟氯吡啶酯的残留[J]. 农药, 2023, 62(5): 348-351.

[8]潘胜东, 叶美君, 陈晓红, 等. QuEChERS净化-超快速液相色谱-串联质谱法同时检测茶叶中常见杀虫剂残留[J]. 卫生研究, 2018, 47(5): 809-814.

[9] Kaczyński P, Łozowicka B, Jankowska M, et al. Rapid determination of acid herbicides in soil by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection based on dispersive solid phase extraction[J]. Talanta, 2016, 152: 127-136.

[10]王兴宁, 李志, 唐亚峰, 等. 同位素内标-QuEChERS结合UHPLC-Q-Orbitrap HRMS法快速检测果蔬中84种除草剂残留[J]. 贵州师范大学学报(自然科学版), 2022, 40(1): 68-79+100.

[11] Dawei C, Yiping Z, Hong M, et al. Determination of Triazine Herbicides in Drinking Water by Dispersive Micro Solid Phase Extraction with Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography-High-Resolution Mass Spectrometric Detection[J]. Journal of agricultural and food chemistry, 2015, 63(44): 9855-62.

[12]张申平, 周静, 杜茹芸, 等. 高分辨质谱在食品农药残留检测中的研究进展[J]. 分析测试学报, 2023, 42(4): 502-509.

[13]韩梅, 侯雪, 邱世婷, 等. 超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定豆类杂粮中53种农药残留[J]. 食品安全质量检测学报, 2020, 11(8): 2437-2445.

[14]汪雪芳, 戚欣, 马飞, 等. 液相色谱串联质谱法检测油菜籽中27种除草剂残留[J]. 化学试剂, 2022, 44(1): 116-122.

[15]王昌钊, 李子豪, 张亚莉, 等. 超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法同时筛查和测定番茄中11种真菌毒素[J]. 食品科学, 2023, 44(12): 368-375.

[16]韩梅, 侯雪, 邱世婷, 等. QuEChERS-超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定蔬菜中61种农药残留[J]. 农药, 2020, 59(10): 743-749.

[17]陈高群, 荣杰峰, 乐有东, 等. 超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定动物源性产品中氟吡草酮及其代谢物残留量[J]. 分析科学学报, 2023, 39(3): 302-308.

[18]李莲, 宣彤, 袁帅, 等. 多壁碳纳米管QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定粮谷中14种酰胺类杀菌剂残留量[J]. 食品科技, 2023, 48(5): 300-307.

[19]戴唯, 李巧, 朱明, 等. QuEChERS-同位素内标-高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中植物生长调节剂类农药残留[J]. 色谱, 2021, 39(11): 1213-1221.

[20]禹绍周, 林慧纯, 张晓鸿, 等. 气相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定蔬果中38种农药残留及其在20种蔬果产品中的基质效应[J]. 中国食物与营养, 2019, 25(8): 33-37.

[21]梁明, 胡均鹏, 王斌, 等. 改进QuEChERS结合超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定蔬菜中10种拟除虫菊酯类农药残留[C]. 广东省食品学会, 2020: 9.

表1 10种化合物的质谱参数

Table 1 Mass spectrum parameters for 10 compounds

a: 吡唑草胺; b: 氯氟吡啶酯; c: 氟氯吡啶酯; d: Tolpyralate

图1 10种化合物的提取离子流图

Fig.1 Extracted ion chromatograms for 10 compounds

e: 氟吡草酮; f: 苯并双环酮; g: 氰氟虫腙; h: 氟啶虫胺腈

图1 10种化合物的提取离子流图

Fig.1 Extracted ion chromatograms for 10 compounds

i

j

i: 环溴虫酰胺; j: 3-苯基-5-（噻吩-2-基）-[1,2,4]噁二唑

图1 10种化合物的提取离子流图

Fig.1 Extracted ion chromatograms for 10 compounds

表2 不同脱水剂和净化剂对白菜中添加浓度20 μg/kg平均回收率的影响（n = 3）

Table 2 Effects of different dehydrating agents and purifying agents on average recoveries in Chinese cabbage

at a concentration of 20 μg/kg (n = 3)

表3 白菜中10种化合物的线性方程、线性范围、基质效应及定量限

Table 3 Linear equation, linear range, matrix effects and LOQs for 10 compounds in Chinese cabbage

表4 不同样品基质的平均回收率和相对标准偏差（n = 6）

Table 4 Average recoveries and RSDs of different sample matrix (n = 6)