孔凡德 龚艳清 陈琼 彭小莉 赵冉 唐泰山 赵晓娜 叶鹏

摘 要 猴痘病毒（Mpox Virus，MPXV）是一种能引起人畜共患病的正痘病毒（Orthopoxvirus，OPXV），与天花病毒（Variola Virus，VARV）同属，其宿主范围较广，人与动物感染率均较高。因此，对MPXV快速、准确诊断与筛查是防控工作中的重要一项。本文就MPXV实验室检测方法的研究进展以及各个方法的优缺点进行总结，为我国防范猴痘疫情传入风险、制定有效措施和研发检测方法等工作提供参考。

关键词 猴痘病毒；检测方法；研究进展

Research Progress on Laboratory Detection Methods

for Mpox Virus

KONG Fan-De¹ GONG Yan-Qing¹ CHEN Qiong² PENG Xiao-Li¹

ZHAO Ran² TANG Tai-Shan³ ZHAO Xiao-Na³ YE Peng^1*

Abstract Mpox virus (MPXV) is a type of orthopoxvirus (OPXV) that can cause zoonotic diseases in humans and animals. It belongs to the same genus as variola virus (VARV) and has a wide host range, with high infection rates in both humans and animals.The rapid and accurate diagnosis and screening of MPXV is an important task in the prevention and control of many zoonotic diseases. This article summarizes the research progress of MPXV laboratory detection methods and the advantages and disadvantages of each method, aiming to provide technical reference for China’s mpox epidemic prevention and control and research and development of detection methods.

Keywords mpox virus; testing methods; research progress

猴痘（Mpox）俗称“猴天花”，是由猴痘病毒（Mpox Virus，MPXV）引起的人畜共患传染病，主要症状为高热、头痛、淋巴结肿大等，病死率达0.1%～10%^[1-2]。该病毒于1958年首次在绿猴中被发现，1970年首次报道人感染病例^[3-4]，2003年4月美国暴发猴痘疫情^[5]，其原因也是由于非洲野生动物贩卖，人与携带病毒的野生动物接触造成感染。2022年后逐渐扩散至欧美乃至全球大多数国家和地区。2022年7月23日，猴痘被世界卫生组织（WHO）宣布构成“国际关注的突发公共卫生事件”。2023年5月11日，WHO宣布解除猴痘紧急状态。然而，由于2024年以来主要由病毒分支Ⅰb变异株引起的猴痘疫情在非洲持续发展并有扩散至更大范围的趋势，2024年8月14日，WHO再次宣布猴痘疫情构成“国际关注的突发公共卫生事件”。2024年11月，WHO组织专家研判，仍维持本次预警。中国自2022年9月至2024年8月共报告2400多例临床确诊病例，其中1例死亡^[6]，均属于Ⅱb分支^[7-9]。猴痘已被国家卫生健康委纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病进行管理^[10]。

MPXV与天花病毒（Variola Virus，VARV）同属痘病毒科（Poxviridae）正痘病毒属（Orthopoxvirus，OPXV），属双链DNA病毒，与所有正痘病毒属一样，含有约197 kb的线性DNA基因组，以及含有约190个长度大于180 nt的非重叠ORF，MPXV核苷酸位于56000—120000处的中心编码区序列（CRS）高度保守，但两侧末端为可变的反向重复序列（ITR）。同时发现MPXV的末端基因主要参与免疫调节，影响宿主范围和致病性。与ITR区缺乏ORF的VARV不同，MPXV在ITR区至少含有4个ORF^[11]。猴痘分为刚果盆地分支（称为分支Ⅰ，分支Ⅰ又包括两个亚分支，即Ⅰa和Ⅰb）和西非分支（称为分支Ⅱ，分支Ⅱ又包括两个亚分支，即Ⅱa和Ⅱb，其中Ⅱb是2022年猴痘疫情中主要传播的一组病毒变种），前者毒力更强，易发生人际传播^[12-13]。截至目前，该病无特异性治疗方案，无有效疫苗^[5,14]。由于猴痘与其他痘病毒疾病症状相似，因此，早期确诊和采取有效的治疗与防控措施至关重要^[15-16]。本文就MPXV实验室检测方法的优缺点和研究进展进行总结，以期为我国防范猴痘疫情传入风险和研发检测方法等提供借鉴。

1 传统检测方法

猴痘病毒的传统检测方法，如电镜检测方法，具有高分辨率、立体感、多功能和样品制备简单等优点，但是设备成本高，操作复杂，而且数据分析难度大，所以使用受到一定限制。而病毒分离培养，具有直观性、可靠性等优点，但是该方法存在操作复杂、耗时长和费用昂贵等问题。

1.1 电镜检测方法

电子显微镜（Electron Microscopy，EM）检测方法包括透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）和扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）^[17]。TEM用于观察病毒的内部结构，SEM则直接观察病毒的外表形貌^[18]，是首选方法，可通过形态学观察以确认OPXV。SEM可通过SEM负染色技术观察MPXV的超微结构图像，并进行视觉分类，如胞浆内圆角砖形或椭圆形病毒粒子^[3,19]。但SEM样品准备复杂、周期较长，需专业人员操作，且设备昂贵^[20]。SEM技术与分子生物学实验技术、免疫组织化学技术、现代计算机数字处理技术的结合，可大幅度提升对病毒检测的灵敏度^[21]，并有助于阐明病毒感染细胞过程，提升生物制品安全性及开发抗病毒药物和疫苗。

1.2 病毒分离培养

分离培养法自1913年首次用于牛痘病毒的培养，经过长久的发展，检测准确性较高，是病毒鉴定检测的“金标准”^[22]，包括动物实验、鸡胚接种与细胞培养等。MPXV也可用此方法，但需经验丰富的技术人员在生物安全Ⅲ级及以上实验室进行操作。分离培养后的MPXV可通过电镜、蚀斑形成试验、ELISA等方法判断病毒特性。病毒的分离鉴定对监测流行病的新动向、研究新病毒以及疫苗研发至关重要。

2 分子诊断方法

分子诊断是利用分子生物学的方法来检测和分析生物体的遗传物质，从而对疾病进行诊断的一种方法。它主要针对的是DNA、RNA等遗传物质，通过检测发现这些遗传物质中的基因突变、基因表达等信息，同时它还可以用于检测病原体，如细菌、病毒、真菌等。这种检测方法具有灵敏度高、特异性强、速度快等优点，对于疾病的早期诊断和预防具有重要作用。

2.1 聚合酶链反应

1971年，Khorana等最早提出核酸体外扩增的设想，直到1986年5月，Mullis在美国冷泉港实验室做专题报告，全世界开始学习聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的方法。该方法是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，其最大的特点是能将微量的DNA大幅增加，从而大大提高了检测的灵敏性。所以PCR检测技术自诞生以来一直被作为临床疫病检测的常规检测方法。例如，张睿等^[23]和陈国强等^[24]分别建立了高效、快速、特异、灵敏的猴痘病毒PCR检测方法，后者还证实了我国为猴痘非疫区^[25]。此外，多位研究者也建立了PCR方法用于检测猴痘病毒核酸^[25-28]。但PCR也面临易污染的挑战，极其微量的污染即可造成假阳性的产生，且一旦产生短时间难以消除。

2.2 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR具有准确性强、灵敏度高等优点，解决了PCR容易污染的问题，是WHO推荐的实验室检测首选方法，同时也是MPXV阳性确诊的“金标准”。研究表明，MPXV或其他OPXV采用PCR检测，可针对病毒细胞外包膜蛋白基因（B6R）、DNA聚合酶基因（E9L）、DNA依赖RNA聚合酶亚基18基因（rpo18）和双链RNA结合蛋白区F3L基因的保守区域进行特异性结合引物的设计^[3,29-30]。以B6R为靶点设计的探针可以鉴别出MPXV的2个分支，以E9L为靶点可以鉴别出13种欧亚OPXV，但不能有效鉴别VARV或北美OPXV^[31]，而利用F3L基因设计的引物探针可以有效对MPXV进行快速鉴别诊断，还可以有效区分VARV、牛痘病毒、痘苗病毒。冯俊霞等^[32]和孔玉方等^[33]均建立了基于F3L基因的荧光定量PCR检测方法，具有特异性强、敏感性高、重复性和实用性好等优点，可以用于猴痘病毒的快速鉴别诊断，为口岸进境动物和入境人员的筛查提供了有效的技术手段。此外，还有许多研究者建立了荧光定量PCR技术用于对猴痘疑似患者的检测工作^[34-36]。

截至2025年1月18日，中国已有20余家体外诊断企业研发出猴痘检测试剂盒（荧光PCR法），并获得欧盟CE认证，国产猴痘核酸检测试剂产品为国外猴痘疫情防控提供了精准的诊断帮助^[37]。同时，截至2025年1月18日，有2家公司获得了国家药品监督管理局批准的猴痘病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）的注册证，包括2024年8月18日达安基因获批（注册证编号：国械注准20243401527），这是国内首个获批上市的猴痘病毒检测产品，同年12月16日圣湘生物（注册证编号：国械注准20243402513）也获批。

2.3 液滴式数字PCR检测法

液滴式数字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）是继普通PCR和实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative Fluorescent PCR，qRT-PCR）之后的第三代核酸检测技术^[38-39]，具有高灵敏度、高特异性、高耐受性、绝对定量、不依赖标准曲线等技术优势，能实现核酸检测的绝对定量^[40]。杨国平等^[41]建立了猴痘病毒的高灵敏度、高特异性数字PCR检测方法，检测限为45 拷贝/mL，为猴痘病毒检测提供了新的技术支持。

2.4 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一种创新的恒温核酸扩增技术，无需依赖热循环过程。IIZUKA等^[42]利用LAMP技术建立MPXV实时定量扩增系统，诊断MPXV，可以区分刚果盆地株系和西非株系；吕沁风等^[43]合成质粒建立LAMP检测方法；周振杰^[44]建立了双通道的LAMP检测体系，检测限最低可达1 copy/μL，且可视化染料法结果直观，容易判断，不需要设备^[44]；许晓琳等^[45]针对MPXV保守区设计特异性引物，建立了一种MPXV实时荧光LAMP检测方法，灵敏度高，是普通PCR方法的20倍，可用于MPXV的快速鉴别诊断；李欢等^[46]开发微流控LAMP多通道检测方法，60 min内可检测8种病原体，优于传统qPCR技术，对新发突发性传染病进行及时筛查和防控具有重要意义。

LAMP技术具有高效、简便、高特异性、无需热循环设备等特点，可通过观察白色沉淀判断扩增结果，无需电泳和紫外检测，成本低廉，其检测成本远低于荧光PCR法^[47-48]，但特异性、准确度有待提高。总体而言，该方法适用于口岸检验检疫及基层医疗机构。

2.5 重组酶介导等温扩增-CRISPR/Cas13a结合侧流层析技术

重组酶介导等温扩增（Recombinase Aided Amplification，RAA）与CRISPR/Cas13a结合测流层析技术主要通过等温扩增产生大量的目标核酸序列，再通过与CRISPR/Cas13a系统混合，Cas13a在crRNA的引导下特异性地切割目标RNA序列，并触发荧光信号的放大，最后通过测流层析技术将不同组分在层析材料上的迁移速度差异进行分离。通过观察荧光信号的位置和强度，可以判断目标核酸的存在与否以及相对数量。该技术结合了等温扩增的高效性、CRISPR/Cas13a的特异性以及测流层析技术的直观性，为快速、准确地检测目标核酸提供了一种有力的工具。该技术具有高度特异性和敏感性，操作简便快速，目测读取适合现场快速检测，降低了污染风险，还具有多重检测能力，进而可以提高检测效率。例如，杨宁等^[49]基于重组酶介导的等温扩增技术和规则成簇间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats，CRISPR）-Cas13a （CRISPR associated protein 13a）结合侧流层析技术（Lateral Flow Assay，LFA）建立一种快速、灵敏、特异的MPXV检测方法。该方法是针对MPXV的F3L段基因设计引物及探针，优化反应条件，可在60 min内完成检测，病毒DNA检出限为18 拷贝/反应，与多种病毒无交叉反应，且与qPCR法检测结果一致。临床样本验证显示，其灵敏度和特异度分别为100.0%和83.3%，阳性预测值为96.6%，阴性预测值为100.0%。杜建森等^[50]也研究建立了多酶恒温快速扩增（MIRA）-Crispr/cas12a一步检测法，可在30 min内完成MPXV的快速检测。虽然该技术具有较多优点，但其对引物要求高、设备依赖性强、结果解读具有主观性，还有可持续改进空间。随着技术的不断发展，相信这些问题将逐渐得到解决，使得该技术在疾病诊断、食品安全等领域发挥更大的作用。

2.6 高通量全基因测序技术

基因测序又称高通量测序技术（Next-generation Sequencing，NGS），可直接从猴痘样本中获取MPXV的原核酸序列，具有通量大、检测限低、准确性高、信息丰富等优势，但成本较高^[51]。赵红等^[52]对疑似猴痘病毒病例样本进行测序，获得西非分支Ⅱb分支，谱系分型为C.1的全基因组序列。裴建新等^[53]成功从宁夏首例猴痘病毒样本中获得全基因组序列，构建了病毒变异和分子溯源技术平台。

NGS用于检测MPXV，有助于更好地了解MPXV的流行病学、感染源和传播方式等。研究表明，MPXV在欧洲的测序显示DNA序列同源高，同属于温和的西非株系，与2018年和2019年在英国、新加坡和以色列发现的MPXV密切相关^[54]。NGS作为猴痘病毒的诊断方法，能提供实时的MPXV基因组数据，对阐明MPXV的来源和传播具有重要意义^[3]。

3 血清学检测方法

血清学检测是一种常用的临床检测方法，用于检测血清中的抗原或抗体，具有操作简单、灵敏度高、特异性强、应用广泛等优点，但也存在检测周期长、可能出现假阳性或假阴性结果和需要专业设备及技术等缺点。因此，用这种方式做检测时，需要综合考虑检测目的、样本情况以及实验室条件等因素，以确保检测结果的准确性和可靠性。

3.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay，ELISA）是MPXV血清抗体检测的首选方法。采用ELISA可在血清中检测MPXV特异性抗体，但对于单份血清样本，仅靠抗体阳性结果不能作为确诊MPXV感染的依据，需结合临床判断，若恢复期IgG抗体滴度较急性期高4倍及以上才能判为MPXV感染。任皎等^[55]利用MPXV B21R蛋白、朱俊达等^[56]采用MPXV-A27L蛋白、欧阳蕾等^[57]利用MPXV-A35R蛋白制备单克隆抗体分别建立ELISA检测方法，用于临床检测取得较好的效果。ELISA技术操作简单，对医护人员保护性较好，但不能早期诊断，特异性不够，易受既往接种天花疫苗的影响，且标本采集后对运输要求高，需要冷链运输。

3.2 胶体金免疫层析试纸法

免疫胶体金是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，具有独特的优点：（1）操作方便快速，15 min内即可完成检测，便于基层使用和现场使用；（2）检测成本低，不需要特殊的仪器设备；（3）应用范围广，可适应多种检测条件；（4）可同时进行多项检测，对于难以获得的阳性样本，多项检测可以节省样品、降低成本；（5）标记物稳定，标记样品可在4℃贮存2年以上，无信号衰减现象；（6）无需发色试剂，胶体金本身为红色，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害。近年来，该技术已在各种生物学研究中得到广泛使用，临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其进行标记。Ye等^[58]针对A29L蛋白建立了胶体金免疫层析试纸条检测方法，最低检测限为50 pg/mL；李真真等^[6]利用A29L表达蛋白建立了荧光免疫层析方法，最低检测限为10 pg/mL，相较于胶体金方法最低检出限提升5倍；赖祥德等^[59]建立A35R蛋白胶体金免疫层析方法，灵敏度达到62.5 pg/mL，肉眼最低检测限是125 pg/mL。目前该方法应用最多的是胶体金免疫层析法，可通过肉眼观察到显色结果。另外，该方法现已发展成为诊断试纸条，使用非常方便。

3.3 血凝抑制试验

猴痘病毒和痘病毒属的成员都具备血凝素这一特性，使得它们可以通过鸡红细胞的黏附和聚集来进行检测。王晓明等^[60]利用痘苗病毒接种鸡胚绒毛尿囊膜制备的抗原，进行血凝抑制试验，滴度≥1∶16判定为猴痘病毒感染；而张正等^[61]通过观察病人血清对红细胞黏附和聚集的抑制作用辅助诊断痘病毒感染，该试验阳性检出时间较中和试验早，因此可以为临床提供较早期的感染信息。当取材时间恰当时，这两种试验的预测价值可达到50%～95%。然而，由于该技术特异性不足，它们并不用于确诊，而是更多地用于回顾性地鉴别痘病毒感染。

3.4 中和试验

中和抗体通常在感染后或接种疫苗后第6天开始出现，可保持20年。当无法获得病毒标本时，通过病毒中和试验或其他方法测定抗体成为确诊病毒性传染病的唯一途径。抗体的存在通常意味着感染正在恢复，猴痘病毒可以通过中和试验进行鉴别，如果急性和恢复期血清抗体水平出现4倍以上的升高，即可用于诊断猴痘病毒感染。然而，当只有一份临床标本时，进行临床诊断可能会非常困难或是不可能的。此外，由于猴痘病毒与痘病毒之间存在抗原交叉，因此这项试验的特异性也有限，对早期诊断的帮助有限，更多地被用于流行病学调查^[61]。

4 现有检测标准

现行猴痘检测标准主要有：SN/T 3306.7—2016《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第7部分：猴痘病毒》、SN/T 3487—2013《猴痘检疫技术规范》、SN/T 2097—2008《入出境人员猴痘检验规程》、SN/T 1716—2006《出入境口岸猴痘监测规程》、GB/T 14926.64—2001《实验动物 猴痘病毒检测方法》，以上标准可用于猴痘病毒的口岸检测和流行病学调查。

5 结语与展望

上述3类诊断方法中，荧光PCR可对MPXV进行快速、准确的诊断，是首选诊断方法。目前，通常选择胞外包膜蛋白A29L、宿主范围蛋白B6R、DNA聚合酶基因E9L、DNA依赖的RNA聚合酶亚基18（rpo18）以及补体结合蛋白C3L、F3L和N3R作为MPXV核酸检测候选靶基因^[62-63]。而免疫组化、荧光抗体法以及放射免疫法等可作为辅助诊断方法，血清学检测方法则更多适用于流行病学调查。

由于猴痘病毒引起的临床症状与其他痘病毒难以鉴别，根据临床表现确诊猴痘非常困难，需要依赖于实验室检测。另外，跟踪病毒变异、预判病毒流行趋势，进而选择适当检测方法也十分必要。而分子生物学检测技术的发展为MPXV快速检测及猴痘早期诊断、预防和控制提供强有力的技术手段，相较于传统方法，其准确性、时效性具有显著优势。

未来，对猴痘病毒检测方法的研究将更加注重方法的简便性、准确性、针对性和成本效益，如微流体芯片PCR与核酸捕获胶体金试纸条技术相结合等。另外，建立联合检测平台，加强国内外交流合作和猴痘病毒监测结果共享，也将有助于更好地掌握病毒变异、流行趋势和研究防控猴痘疫情的政策与措施，保护人类健康，维护公共卫生安全。

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基金项目：海关总署科研项目（2022HK041，2020HK160，2019HK018）；厦门市科技计划项目（3502Z20226027）

第一作者：孔凡德（1967—），男，汉族，福建永定人，博士，研究员，主要从事动物疫病病原分子检测研究工作，E-mail: kfd67@sina.com

通信作者：叶鹏（1973—），男，汉族，福建厦门人，本科，高级工程师，主要从事动物疫病检测和研究工作，E-mail: 375476123@qq.com

1. 厦门海关技术中心 厦门 361026

2. 厦门市动物疫病预防控制中心 厦门 361009

3. 南京海关动植物与食品检测中心 南京 210019

1. Xiamen Customs Technology Center, Xiamen 361026

2 Xiamen Animal Disease Prevention and Control Center, Xiamen 361009

3. Nanjing Customs Animal, Plant and Food Testing Center, Nanjing 210019