吴洁珊 徐日文 翁福良 李伟刚 陈超 张文生

摘 要 本研究建立了高效液相色谱二极管阵列检测器测定广陈皮中橙皮苷、橘皮素、川陈皮素3种黄酮类有效成分含量的方法。采用甲醇超声提取样品中橙皮苷、橘皮素和川陈皮素，样品提取液经色谱柱Eclipse XDB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）分离，以乙腈-0.05%磷酸水溶液作为流动相，进行梯度洗脱，采用二极管阵列检测器（Diode Array Detector，DAD）多波长283 nm、320 nm检测和190～400 nm全波长扫描同时监测。实验中3种有效成分含量采用外标法定量。结果显示，标准溶液在0.5～200 μg/mL的测定范围内有良好的线性关系（R＞0.9999），在所添加3个水平浓度下，橙皮苷、橘皮素、川陈皮的平均回收率分别为91.2%、84.0%、86.3%，相对标准偏差RSD分别为2.7%、3.4%、4.2%。市售19批广陈皮样品中橙皮苷含量为1.90%～3.45%、橘皮素含量为0.12%～0.38%、川陈皮素含量为0.16%～0.46%，表明不同年份不同来源的广陈皮中橙皮苷、橘皮素、川陈皮含量存在明显差异。经方法学验证，该方法简单、快速、准确、重复性好，可用于广陈皮或其他品种陈皮中橙皮苷、橘皮素、川陈皮素含量的测定。

关键词 高效液相色谱法；广陈皮；橙皮苷；橘皮素；川陈皮素；含量

Determination of Three Active Ingredients of Flavonoids Content in Citri reticulata ‘Chachi’ by High-Performance Liquid Chromatography

WU Jie-Shan¹ XU Ri-Wen¹ WENG Fu-Liang¹ LI Wei-Gang¹

CHEN Chao² ZHANG Wen-Sheng²

Abstract A method was developed for simultaneous determination of three active ingredients of flavonoids content in Citri reticulata ‘Chachi’ by high-performance liquid chromatography with diode array detector. Hesperidin, tangeretin and nobiletin in the sample were extracted by ultrasonic extraction with methanol. The extracted liquid was separated on a chromatography column Eclipse XDB-C₁₈ (250 mm×4.6 mm, 5 μm), and acetonitrile-0.05% phosphoric acid aqueous solution was used as the mobile phase, then the gradient elution was performed.The detection was multi wavelength at 283 nm and 320 nm using a diode array detector (DAD), as well as full wavelength scanning at 190 nm to 400 nm. Three active ingredients of flavonoids were quantified by external standard method. The results showed that the standard solution had a good linear relationship (R＞0.9999) in the determination range of 0.5-200 μg/mL.At the three different concentrations, the average recoveries of hesperidin tangeretin and nobiletin from spiked samples were 91.2%, 84.0%, and 86.3%, respectively, with relative standard deviations of 2.7%, 3.4%, and 4.2%. Among 19 batches of Citri reticulata ‘Chachi’ samples sold on the market, the content of hesperidin were 1.90%-3.45%, the content of tangeretin were 0.12%-0.38%, the content of nobiletin were 0.16%-0.46%. This indicates that there were significant differences in the content of hesperidin, tangeretin and nobiletin in Citri reticulata ‘Chachi’ from different storage period and origins. The method has been validated by methodology and was simple, fast, accurate and reproducible, which can be used for the determination of hesperidin, tangeretin and nobiletin content in Citri reticulata ‘Chachi’ or other varieties of Pericarpium Citri Reticulatae.

Keywords high-performance liquid chromatography; Citri reticulata ‘Chachi’ ; hesperidin; tangeretin; nobiletin; content

基金项目：海关总署科研项目（2023HK135）

第一作者：吴洁珊（1977—），女，汉族，硕士，高级工程师，主要从事有毒有害物质及食品安全检测工作，E-mail: wujieshan@sina.cn

1. 拱北海关技术中心 珠海 519015

2. 北京师范大学珠海校区 珠海 519087

1. Technical Center of Gongbei Customs, Zhuhai 519015

2. Beijing Normal University at Zhuhai, Zhuhai 519087

陈皮为芸香科植物橘及其变种的成熟果皮，具有理气健脾、燥湿化痰功效，可分为陈皮和广陈皮^[1]，其活性成分主要为挥发油、黄酮和生物碱等。存放时间越久，陈皮中的辛辣气味越弱，药用效果就越好^[2-3]。陈皮在中药上应用广泛，用量大，民间也常用陈皮煲汤、泡水或制成陈皮茶，用于调理肠胃，是药食同源用品。广陈皮为“十大广药”之一，是临床用药的首选药材，具有较高的药用价值^[4-5]。其功效成分一直是人们研究的热点，有很多文献报道^[6-8]，主要集中在挥发油^[9]和黄酮^[10-11]的含量测定，陈皮中黄酮类成分以橙皮苷的含量为最高，其次是多甲氧基黄酮类成分，该类成分又以川陈皮素和橘皮素的含量为高^[12-13]。大量文献证实陈皮的有效成分与产地、采收时间、品种等因素有关，不同产地、不同采收季节、不同基源、不同贮存年份的陈皮中有效成分橙皮苷存在差异^[14]。黄酮类化合物是陈皮中重要有效成分，具有抗氧化活性、降低甚至去除自由基、保护心血管和抗肿瘤等功效。2020年版《中国药典》将橙皮苷作为陈皮的指标性成分，要求其含量不得少于3.5%，广陈皮的橙皮苷不得少于2.0%，川陈皮素和橘皮素的总含量不得少于0.42%^[1]。

本研究建立了高效液相色谱法测定广陈皮中3种黄酮类成分含量，以满足日常检测需求。现有文献报道陈皮黄酮类的检测方法主要有分光光度法、薄层色谱法和液相色谱法^[15-18]。其中，分光光度法只能对样品中黄酮总含量进行测定；薄层色谱法虽可对各种黄酮类化合物进行定性定量，但方法操作费时。2020年版《中国药典》中以薄层色谱法对陈皮样品中陈皮苷进行定性鉴别分析，采用液相色谱法测定橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量，以此作为指导性方法，而日常检测需要对方法的各个技术参数的有效性进行考察优化。本研究拟采用高效液相色谱法测定不同年份和不同产区的广陈皮中橙皮苷、橘皮素、川陈皮素3种黄酮类有效成分的含量，分析比较其含量差异，可为进出口陈皮的质量检测和生产部门质量控制提供更为科学有效的方法和依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290高效液相色谱仪，带有二极管阵列检测器（Diode Array Detector，DAD），IKA KS501型漩涡振荡器（德国IKA公司）；TDL-40C离心机（上海安亭科学仪器厂）；九阳组织粉碎机；XSE205DU型十万分之一电子天平（梅特勒托利多科技有限公司）。

乙腈、甲醇均为色谱纯（斯百全化学(上海)有限公司）；85%磷酸为优级纯（广州化学试剂厂）；试验用水为超纯水。

橙皮苷、橘皮素、川陈皮素对照品（纯度大于98%，购于上海安谱实验科技股份有限公司）。

实验室样品为新会茶坑产区，年份为2013—2019年，样品编号为K2013—K2019；新会三江产区，年份为2015—2020年，样品编号为S2015—S2020；青皮样品编号为Q2018、二红皮样品编号为H2019、大红皮样品编号为H2016；其他广陈皮样品编号为G1—G3，共19个批次样品。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的配制

称取适量橙皮苷、橘皮素、川陈皮素对照品，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容至刻度（配制橙皮苷时，先加入1 mL二甲基亚砜使其溶解，再加甲醇定容至刻度），配制成浓度为1 mg/mL的溶液，使用时用甲醇稀释至所需要的浓度。

1.2.2 样品的制备与提取

用粉碎机将陈皮样品捣碎加工成粉末状，混匀，过三号筛（50目），采用洁净的塑料样品封口袋分装，并标明标识。用电子天平称取样品0.1 g于20 mL比色管中，加入甲醇至刻度，用超声机超声提取30 min，以4000 r/min转速离心3 min，取1.0 mL上清液，用0.2 μm滤膜过滤，并按仪器工作条件进行测定。

1.2.3 液相色谱测定条件

Eclipse XDB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为：A泵为0.05%磷酸水溶液，B泵为乙腈，流动相初始比例A泵为90%，B泵为10%，3 min内维持不变；在3～10 min内，A泵由90%降至40%，B泵由10%升至60%，在10～20 min内，流动相比例维持不变，A泵为40%，B泵为60%，当20 min后，流动相比例改变成A泵为90%，B泵为10%，保持5 min；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。在上述色谱条件下对照品及典型样品色谱图如图1和图2所示。

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

使用二极管阵列检测器分析对照品在190～400 nm下的紫外吸收光谱，各化合物的吸收光谱图如图3—图5所示。从光谱上可见，橙皮苷在283 nm处有吸收峰，橘皮素、川陈皮素分别在320  nm、332 nm处有吸收峰，而在210 nm波长处，3个化合物都有吸收，但此波长下流动相磷酸溶液、乙腈存在紫外吸收，容易出现影响，因此，检测时不能采用210 nm作为检测波长。橙皮苷在300 nm以上波长吸收较弱（图3），而且橘皮素、川陈皮素在283 nm处虽有吸收，但较在320 nm的吸收弱（图4—图5）。结合二极管阵列检测器存在多波长监测和190～400 nm全扫描监测功能，因此，实验时采用283 nm、320 nm和190～400 nm全扫描同时监测。

图3 橙皮苷紫外吸收光谱图

Fig.3 Ultraviolet absorption spectrum of hesperidin

图4 橘皮素紫外吸收光谱图

Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of tangeretin

图5 川陈皮素紫外吸收光谱图

Fig.5 Ultraviolet absorption spectrum of nobiletin

2.2 线性范围和相关系数

用甲醇稀释1.2.1对照品储备液成系列浓度为0.5 μg/mL、5 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL，按照1.2.3色谱条件进行测定，以分析物峰面积对其浓度作线性回归，得到各化合物的线性回归方程，见表1。各化合物在所分析的含量范围（0.5～200 μg/mL）内线性关系良好，相关系数大于0.9999。

表1 各化合物的线性回归方程和相关系数

Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of each compound

2.3 样品的提取效率

结合文献报道^[19-21]，实验室采用超声波提取，分别考察10 mL、20 mL、30 mL的甲醇，10 mL、20 mL的75%甲醇溶液在30 min、60 min、120 min超声提取时间，对同一样品中3种有效成分的提取效率。其测定的结果如图6所示。结果表明陈皮中的橘皮素、川陈皮素在甲醇、75%甲醇的不同提取体积和不同提取时间，其含量测定结果基本一致，样品中橘皮素、川陈皮素的含量不随超声提取时间的增加而增加，超声提取30 min，基本可以达到对陈皮样品中橘皮素、川陈皮素最大量提取。而溶剂的类别、溶液的体积、超声提取的时间对样品中橙皮苷含量测定影响较大，从其测定结果可见甲醇提取效率更优，0.1 g陈皮样品使用20 mL甲醇，经60 min超声提取时间，样品中橙皮苷基本被最大量提取。上述情况可能与陈皮苷、橘皮素、川陈皮素在甲醇的溶解度大小有关，也可能与陈皮苷在陈皮中的含量最高有关。因此，实验中采用20 mL甲醇进行提取。

2.4 方法稳定性

取同一批样品，按1.2.2项下方法制备样品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h对样品溶液进行测定，结果橙皮苷、橘皮素、川陈皮素峰面积的RSD分别为0.50%、0.52%、0.52%（n = 6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

图6 不同条件对同一广陈皮样品的提取测定结果

Fig.6 The extraction and determination results of the same

Citri reticulata ‘Chachi’ sample under different conditions

2.5 精密度与变异系数

取同一编号S2020批次样品，按1.2.2项下方法制备样品溶液，共6份，按1.2.3色谱条件进样测定，外标定量，结果橙皮苷、橘皮素、川陈皮素的含量的RSD分别为2.97%、2.81%、4.70%（n = 6），符合中药材含量测定的要求^[1]。

2.6 方法的回收率

取已经测定过含量编号S2020批次陈皮样品，分别吸取一定量的标准对照品溶液添加至样品中，使得样品中各对照品的添加浓度分别为50 μg/g、20 μg/g、10 μg/g。按1.2.2项下方法制备样品溶液，每个浓度的3个重复，按1.2.3色谱条件进样测定，外标定量，测得方法中橙皮苷、橘皮素、川陈皮的回收率分别为91.2%、84.0%、86.3%，相对标准偏差分别为2.7%、4.2%、3.4%（表2），符合中药材含量测定的要求^[1]。

2.7 样品含量测定

按1.2.2项下方法制备样品溶液，按1.2.3色谱条件进样测定，样品测定结果见表3。市售19批广陈皮样品中橙皮苷含量为1.90%～3.45%、橘皮素含量为0.12%～0.38%、川陈皮素含量为0.16%～0.46%，表明不同来源不同年份的陈皮中橙皮苷、橘皮素、川陈皮含量存在明显差异。这可能与柑橘的采摘时间和存放时间有关。

表2 广陈皮中橙皮苷、橘皮素、川陈皮的回收率和变异系数

Table 2 Values of recovery and coefficient of variation of hesperidin, tangeretin and nobiletin content in Citri reticulata ‘Chachi’

表3 不同年份和不同来源的广陈皮中橙皮苷、橘皮素、

川陈皮素含量（%）

Table 3 Content of hesperidin, tangeretin and nobiletin in Citri reticulata ‘Chachi’ from different storage period and origins (%)

3 结论

本实验中，用甲醇超声提取陈皮样品中橙皮苷、橘皮素、川陈皮素，采用DAD多波长283 nm、320 nm和190～400 nm扫描监测进行测定，经方法学验证，各项技术指标符合2020年版《中国药典》关于中药材含量测定的要求。该方法简单、快速、准确、重复性好，可用于广陈皮或其他品种陈皮中橙皮苷、橘皮素、川陈皮素的含量测定，还可为相关部门开展质量监管和生产企业进行质量控制提供科学有效的检测方法。

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图1 对照品溶液色谱图

Fig.1 The chromatogram of standard solution

图2 广陈皮样品色谱图

Fig.2 The chromatogram of Citri reticulata ‘Chachi’ sample