劳华均 何洁 袁天虎 金园园

摘 要 本文研究了约鲁巴沙门菌的生物表型和毒力基因。通过纯化菌株的生化实验和标准化血清识别程序进行表型鉴定，经沙门菌血清型数据库比对，表明本次研究的沙门菌为约鲁巴沙门菌，并筛选出毒力基因invA、sefA、pefA、spvC。该研究结果可为增加国内沙门菌血清型的多样性和生物溯源研究提供参考依据。

关键词 约鲁巴沙门菌；毒力基因；聚合酶链式反应

Isolation, Identification of Virulence Gene Analysis of Salmonella Yoruba

LAO Hua-Jun ¹ HE Jie ¹ YUAN Tian-Hu ¹ JIN Yuan-Yuan ¹

Abstract In this paper, the biological phenotype and virulence genes of Salmonella Yoruba were studied. Through biochemical experiments of purified strains and standardized serum recognition procedures, phenotypic identification was conducted. The results showed that this bacteria conformed to the definition of Salmonella Yoruba, through comparison with the domestic Salmonella serotype database. It was positive for genes that encoded the virulence factors investigated (invA、sefA、pefA、spvC). This study has significant implications for increasing the diversity of domestic Salmonella serotypes and for bio-tracing studies.

Keywords Salmonella Yoruba; virulence gene; Polymerase Chain Reaction

沙门菌属革兰阴性厌氧菌，广泛分布于动物、人群和环境中。致病微生物是导致食源性疾病暴发的主要因素，其中沙门菌位居前列。因此，本文将以20份涂抹样本中检出的2株沙门菌作为研究对象，通过细菌形态学、系统生化和血清分型试验，最终鉴定为约鲁巴沙门菌（Salmonella Yoruba，16:c:l,w），同时对该菌株的4个毒力基因invA、sefA、pefA、spvC进行检测，检测结果显示均为阳性。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 主要仪器

VITEK2 COMPACT微生物鉴定仪（法国生物梅里埃公司）、BIO-RAD Thermal cycler PCR仪、Qsep100全自动核酸分析系统（中国台湾Bioptic公司）。

1.1.2 主要试剂

缓冲蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、亚硫酸铋（BS）琼脂、血琼脂均购于北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 沙门氏菌分离纯化

按照国家标准GB/T 4789.4—2016《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》中沙门氏菌检测方法，采用BPW预增菌，TTB和SC增菌液选择性增菌，培养18 d后，XLD、BS培养基分离培养；挑取可疑菌落纯培养后进行菌株鉴定和血清学鉴定。

1.2.2 可疑菌株生化鉴定

从菌株的纯培养平板上挑取2～3个菌落，采用VITEK2 COMPACT系统鉴定方法对其进行菌种鉴定。

1.2.3 血清凝集试验

采用玻片凝集法，依据Kauffman-White血清分型标准，进行菌株血清型别鉴定。使用无菌生理盐水进行自凝对照。

1.2.4 沙门氏菌毒力基因检测

从菌株的纯培养平板上挑取2～3个菌落，加入100 μL的无菌水中，混匀，100℃电子浴锅10 min，12000 rpm离心10 min，取上清液，以此为模板进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增，引物均由上海华大生物有限公司合成，详细信息见表1。

2 结果与分析

2.1 菌株分离及形态学观察

20份样品经过预增菌后，分别接种TTB和SC增菌液，并从2种增菌液挑取一环分别在XLD和BS培养基上划线培养，其中样品2号和样品15号在分离培养基上发现可疑菌株S2、S15。2个可疑菌株分别在BS和XLD培养基上菌落形态和大小相同，在BS培养基上，形成灰黑色菌落，大小为2～3 mm，圆形、光滑、湿润、凸起，周围有向外扩散的灰褐色晕环；在XLD培养基上，形成黑色菌落，大小为2 mm，光滑、湿润、边缘整齐。

图1 可疑菌株在BS和XLD培养基上的菌落形态

Fig.1 Colony morphology of suspicious strains on BS and XLD media

2.2 可疑菌株生化鉴定

使用VITEK2 COMPACT生化鉴定系统对分离菌株S2、S15的47个生化指标进行检测，2个菌株生化指标结果完全一致，其中20个生化试验为阳性，27个生化试验为阴性，相似性均＞98%，鉴定为沙门氏菌，具体信息见表2。

2.3 血清凝集试验

分离菌株用丹麦SSI沙门菌血清进行血清凝集，依据Kauffman-White血清分型标准，进行菌株血清型别鉴定，初步鉴定为约鲁巴沙门菌（Salmonella Yoruba，16:c:l,w），并经宁波市疾病预防控制中心复核，鉴定结果一致。

2.4 毒力基因检测

对分离菌株S2、S15进行毒力基因的PCR检测，结果显示，2个菌株均检出invA、sefA、pefA、spvC，结果如图2所示。

图2 S2、S15菌株毒力基因检测结果

Fig.2 Results of detecting virulence genes

3 讨论

沙门菌属血清型复杂，据文献报道，最新公布的共2659个^[4]。我国从1978—2009年报道的血清型近300个，2006—2014年经技术确认的沙门菌血清型有133个^[5]。本次分离的约鲁巴沙门菌属于O抗原16的Ⅰ群。该血清型菌株于2017年由Zhou Z等^[6]在我国江苏淮安某猪屠宰场的猪肠道内容物中分离到，占总分离到的菌株比为0.9%。约鲁巴沙门菌是一种罕见血清型的沙门氏菌^[7]。1999年，在瑞典进口豆粕中的沙门氏菌控制计划中，首次检测到该菌，与动物配给生产中使用的原材料，特别是与大豆衍生饲料有关^[8]。在一些欧洲国家的家禽业，约鲁巴沙门菌被认为是“一种紧急病原体”，因为这种血清型可以抵抗造粒过程中使用的热处理^[9]。本实验分离到的约鲁巴沙门菌可在后续工作中深入研究。

这种罕见的血清型曾在家禽和与饲料加工相关的原料中发现，但还尚未在世界范围内广泛分布^[7]。本研究中检测出的毒力基因与Melissa A等^[7]发表的论文中检测到的毒力因子一致，该论文还介绍了相关研究中检测到该血清型沙门菌存在表型抗性谱。在后续工作中，还需加强对约鲁巴沙门菌的监测和研究。综上所述，本文的研究将为国内沙门菌血清型的多样性和生物溯源研究提供一定的科学依据，具有一定的公共卫生学意义。

参考文献

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[2]李偲, 郭双, 王永强, 等. 一株牛源都柏林沙门氏菌的全基因组测序及毒力与耐药性分析[J]. 微生物学通报, 2023, 50(6): 2569-2581.

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[4]邱玉锋, 翁顺太, 胡辛兰, 等. 福建省首次自临床血流感染病例检出特勒凯比尔沙门菌[J]. 中国人兽共患病学报, 2020, 36(8): 643-645.

[5]朱超, 许学斌. 沙门菌属血清型诊断[M]. 上海: 同济大学出版社, 2009: 7.

[6] Zhou Z, Li J, Zheng H, et al. Diversity of Salmonella isolates and their distribution in a pig slaughterhouse in Huaian, China[J]. Food Control, 2017, 78: 238-246.

[7] Melissa A. Ramtahal Daniel G. Amoako, etc. Salmonella Yoruba: A rare serotype revealed through genomic sequencing along the farm-to-fork continuum of an intensive poultry farm in KwaZulu-Natal, South Africa[J]. Acta Tropica, 2022, 234: 1-13.

[8] Osterberg, J., Lewerin, S. S., & Wallgren, P. Direct and indirect transmission of four Salmonella enterica serotypes in pigs[J]. Acta Veterinaria Scandinavica, 2010, 52(1): 1-7.

[9] Osterberg J, Ekwall S.J, Nilsoon I, et al. Erradication of Salmonella Yoruba in an integrated pig herd[J]. Tierärztl. Wochenschr, 2001, 114: 331-334.

第一作者：劳华均（1968—），男，汉族，浙江宁波人，本科，高级工程师，主要从事食品微生物检测工作，E-mail: laohuajun@customs.gov.cn

1. 宁波海关 宁波 315010

1. Ningbo Customs, Ningbo 315010

表1 用于PCR扩增的4个毒力基因引物

Table 1 Four primers of virulence genes used for PCR amplification

注: [1]、[2]、[3]为引用参考文献序号.

表2 2个可疑菌株生化鉴定结果

Table 2 Results of biochemical identification of two suspicious strains

注:“+”代表阳性; “-”代表阴性.