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成蚊种类鉴定主要方法研究进展
作者:杨玫 乔彩霞 刘中华 覃卫红
杨玫 乔彩霞 刘中华 覃卫红
摘 要 本文从形态学特征鉴定、分子生物学技术鉴定、质谱技术鉴定和机器学习鉴定4个方面对成蚊种类鉴定的主要方法进行综述,探讨了不同方法鉴定成蚊种类的效率和适用性,为开展成蚊种类鉴定工作及研究提供参考。
关键词 成蚊种类鉴定;形态学特征;分子生物学;质谱技术;机器学习
Research Progress on the Main Methods for Identifying Adult Mosquito Species
YANG Mei 1 QIAO Cai-Xia 2 LIU Zhong-Hua 1 QIN Wei-Hong 1*
Abstract This paper reviews the main methods used to identify adult mosquito species, focusing on four approaches: morphological characteristic, molecular biology technology, mass spectrometry technology, and machine learning. It explores the efficiency and applicability of these methods, providing insights and references for future research on identifying adult mosquito species.
Keyword identification of adult mosquito species; morphological characteristics; molecular biology; mass spectrometry technology; machine learning
蚊类(Mosquito)在昆虫分类学上属于昆虫纲(Insecta)、双翅目(Diptera)、长角亚目(Nemtocera)的蚊科(Culicidae),分为按蚊亚科(Anophelinae)和库蚊亚科(Culicinae),包含3698种(亚种),41属和187亚属[1],广泛分布于全世界温带至热带地区,目前我国已发现46属(亚属)400余种(亚种)[2]。不同的蚊类具有不同的形态特征和生态学特性(如叮咬偏好、刺叮模式等)[3],携带传播的病原体种类和能力各有不同,如按蚊(Anopheles)可传播疟疾等,伊蚊(Aedes)可传播登革热等,库蚊(Culex)可传播流行性乙型脑炎等[4-6],蚊吸血刺叮和传播疾病以雌蚊为主。蚊媒传染病的流行有季节性,通常夏秋季高发,根据2024年8月全球传染病疫情分析,在影响国家和地区排名前十位的传染病中蚊媒传染病占据四席(登革热、基孔肯雅热、疟疾、寨卡病毒病),其中,登革热的影响范围最大[7],且登革热也是我国关注的重点蚊媒传播疾病之一[8]。根据《中国重要外来入侵媒介和病原生物名录(2023版)》[9]调查评估发现有较大入侵可能的蚊类有12种,目前除致倦库蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)和斯氏按蚊(Anopheles stephensi)已在我国有分布,其余10种蚊类在我国尚无分布。外来蚊种的入侵不仅会破坏生物多样性,也会造成蚊媒传染病的发生流行,因此在国境口岸开展蚊媒监测,对监测或截获蚊种进行准确地种类识别鉴定,对有效开展蚊媒传染病防控、预防外来蚊种入侵意义重大。本文将从形态学特征鉴定、分子生物学技术鉴定、质谱技术鉴定和机器学习鉴定4个方面对成蚊种类鉴定的主要方法进行综述,以期为开展成蚊蚊种鉴定提供参考。
1 基于形态学特征的鉴定方法
传统的成蚊种类鉴定主要依据其形态学的结构特征展开,依据蚊样本的大小、颜色、头胸腹3部及翅脉、足等相关特点,参考鉴定资料人工识别或机器提取特征进行自动比对识别,最终得出鉴定结果,本节将基于形态学特征对成蚊种类人工鉴定方法进行阐述。
1.1 基于蚊类样本的显微鉴定
当前,成蚊的监测工作以传统监测方法为主,如紫外灯诱捕法、CO2诱蚊法、人工诱蚊法等,这些监测方法对蚊类诱集没有特异性,均需在监测诱集后对捕获昆虫是否为蚊类、是什么蚊种进行鉴定[10]。监测捕获的昆虫经冷冻或乙醚处死后,需将样本通过邮寄或直接运输的方式送至实验室,由专业鉴定人员在体式显微镜下对蚊样本进行观察,参考蚊种鉴定资料,依据蚊种鉴定的二歧分类检索表,通过观察比较蚊体表相关特征点逐条检索,最终完成种类鉴定,这是当前开展成蚊蚊种鉴定的主要方法。蚊种鉴定的参考书目多样,陆宝麟等[11]编著的《中国动物志·昆虫纲·第八卷·双翅目蚊科(上)》记录了我国已知的27属302种(亚种)蚊种;孟庆华等[12]编著的《中国蚊虫分类系统和检索表》记录了在我国已知的15属337种蚊种,有分类系统和检索表;董学书等[13-14]编著的《云南蚊类志(上卷)》和《云南蚊类志(下卷)》记录了在云南分布的296种蚊类的鉴别特征、形态描述、地理分布和生态习性等。此外,还有《中国伊蚊鉴定手册》《中国按蚊鉴定手册》《中国库蚊鉴别手册》《中国口岸常见医学媒介生物鉴定图谱》、SN/T 5042.11—2018《常见蚊类鉴定方法 第11部分:骚扰阿蚊》[15-19]等参考资料。
依据蚊类样本进行显微鉴定是传统的蚊种鉴定方法,该方法对专业鉴定人员的依赖程度较高,鉴定结果受人员专业知识水平、经验积累、蚊样本形态学特征的完整度等多种因素影响[20-21]。此外,蚊科内存在的大量复合组(体)、种团和近缘种,形态差异小,如赫坎按蚊种团(Anopheles hyrcanus group)有5种按蚊,金线伊蚊亚组(Aedes chrysolineatus subgroup)有6种伊蚊,尖音库蚊组(Culex pipiens group)有4种库蚊等,形态特征接近[21-23],依靠单纯的形态学特征进行种类鉴定难度较大,结合其生态学特征或其他的鉴定技术可有效提高鉴定的准确率。虽然传统的显微鉴定存在一定的局限性,但是该方法在有专业鉴定人员的情况下操作简便、容易实现,仍然是当前进行蚊种鉴定的主要方法。
1.2 基于蚊类图片的远程鉴定
为有效提高蚊类鉴定效率、缓解形态学鉴定在专业鉴定人员不在现场导致鉴定工作难以开展的限制,有研究者针对监测捕获的蚊类采集图片,探究利用图片信息对蚊种进行远程鉴定的可行性。此类研究涉及的图片主要有两种,一种是利用显微镜将蚊类样本放大,采集蚊类的显微照片,另一种是利用数码相机或智能手机直接采集捕获蚊类的照片。通过采集蚊类显微照片进行远程蚊种鉴定,是将在显微镜下观察到的蚊全貌和关键特征进行采集,比对显微照片和成蚊样本鉴定结果的一致性,评估该方法的可行性。Nil Rahola等[24]利用此方法对经专家鉴定及复核确认的26种雌性成蚊采集高清显微照片,在全球范围内邀请部分具备开展蚊种鉴定资质的实验室参与评估,发现9种雌性成蚊的鉴定准确率>90%,4种雌性成蚊的鉴定准确率≤60%,验证了利用该方法进行成蚊种类鉴定的可行性,同时评估发现,鉴定准确率的高低可能与参与评估的实验室所在地区是否有该蚊种有关。而直接采集捕获蚊种的图片,利用图片进行蚊种鉴定,要达到与成蚊样本显微鉴定效率接近的正确率,在利用数码相机或智能手机采集蚊种图片时,要尽可能减少蚊样本形态特征的破坏程度,待采集成蚊死后[25]或通过改良监测工具,将捕获成蚊固定于二维平面[26],在蚊稳定状态下进行采集,通过图片传输至专业鉴定人员实现远程蚊种鉴定。这种直接采集蚊种图片进行鉴定的形式,其鉴定准确率也和专业人员对鉴定蚊种的熟悉程度有关[25]。
采集蚊类数字图像可实现种类鉴定,是对传统显微鉴定方法的良好补充。但是该方法使用的数字图片对图像分辨率、对比度、景深、色彩还原度等有一定要求,对摄影器材的曝光度、光线曲线等参数也有限制[24, 26],需结合采集图片情况利用数字图像处理软件调整图片的质量,以满足远程鉴定对图片采集特征的观察需求,同时样本的完整性、蚊种鉴别的关键特征采集的准确性对种类鉴定正确与否影响较大。因此,该鉴定方法适用于具备采集高质量数字图片且能熟练运用图像处理软件调整图片质量的监测点,通过远程传输至专业鉴定人员进行蚊种识别鉴定。
1.3 基于形态学特征利用在线网站/软件的鉴定
为便于非专业鉴定人员实现蚊种鉴定,有研究者基于Lucid professional可利用图片、视频、音频、文字等多种信息建立分类检索的强大功能[27],开发了在线交互式多途径蚊虫属级检索鉴定系统[28-29],在线发布了“重要吸血昆虫交互式智能鉴定系统”(http://medentomology.top)。该系统目前收录了蚊科10属的头、胸、腹3个部位的76个备选特征,操作人员可根据待识别样本形态特征在备选特征中进行选择,系统会自动识别给出保留蚊属推荐,实现蚊属(亚属)级鉴定。并且该系统包含伊蚊属每个亚属外部形态特征、鉴别技术要点、生态习性、医学重要性、现有种类数量等详细信息的数据库,可供相关人员在开展鉴定时进行参考[29]。此外,国外有研究利用显微照片使用名为“MoskeyTool”的识别工具对26种蚊种进行识别鉴定,正确率可达80%[24]。
利用建立的在线网站/软件进行蚊类鉴定,具有操作简单、可实现性强等优点,但是受制于上传蚊属/种相关信息的数量限制,覆盖面不够,只能鉴定到属(亚属)或有限蚊种,且操作人员对蚊形态结构的了解程度影响其利用在线工具进行蚊种鉴定时特征的选择,从而影响鉴定准确率。因此,该鉴定方法有值得借鉴的地方,但是在实际中要达到蚊种鉴定较高的准确率还需优化相关的操作系统,也要对非专业背景人员加强蚊类形态学的知识宣教,或是在系统中优化蚊类结构特征的展示。
2 基于分子生物学技术的鉴定方法
基于分子生物学技术开展蚊种鉴定不受蚊样本完整性、发育阶段、人员主观性等因素的影响,能有效弥补形态学鉴定的不足。当前分子生物学鉴定技术使用最多的是DNA条形码技术,另外还有DNA芯片、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)等。
2.1 DNA条形码技术
DNA条形码(DNA Barcoding)技术是利用生物体DNA中一段或几段公认的标准DNA序列作为分子标记对物种进行快速鉴定的技术[30]。该鉴定方法主要是通过对待鉴定蚊样本进行DNA提取和PCR扩增,扩增产物进行基因测序,测序获得的序列经正反链拼接匹配校正,与美国国家生物信息技术中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中的GenBank数据库(https://www.ncbi. nlm.nih.gov)或加拿大圭尔夫大学开发维护的生命条形码数据系统(http://www.barcodinglife.org)进行序列比对,根据序列同源性的大小判定蚊种。参考SN/T 5175—2021《国境口岸蚊类DNA条形码鉴定规程》[23]同源性≥98%可判定为同种。蚊线粒体基因和核糖体基因中的片段都可作为蚊种鉴定的分子标记,包括线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)、线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ)、线粒体ATP合酶Fo亚基8(ATP8)、线粒体ATP合酶Fo亚基6(ATP6)、线粒体细胞色素b(CytB)、NADH脱氢酶亚基1、2、3、4、5、6(ND1、ND2、ND3、ND4、ND5和ND6)基因,以及核糖体DNA内转录间隔区中的第一内转录间隔区(ITS1)和第二内转录间隔区(ITS2)等基因片段[21, 31-32]。通过比对不同基因片段在种内和种间稳定性的不同,可选择1个或多个基因片段通过与标准序列进行比对实现蚊种鉴定。目前使用较多的分子标记主要是COⅠ和ITS2,COⅠ基因序列在蚊属内差异较大[33],是当前进行蚊种鉴定使用最多的分子标记[34-37],对于亲缘关系较近的蚊种团、复合组之间的鉴定,可在COⅠ序列的基础上增加ITS2基因序列进行比对分析[23, 32]。利用该方法能为种类鉴定提供分子水平的技术依据,是较为准确、可行的鉴定方法,尤其对于形态特征破坏严重的蚊类,是当前首选的鉴定方法,能大大缩短蚊种鉴定周期,有效提高蚊种鉴定能力[37]。
随着PCR技术和基因测序技术的不断发展,利用DNA条形码技术进行蚊种鉴定有广阔的应用前景。当前部分海关实验室已具备开展利用DNA条形码技术进行蚊种鉴定的能力,对无法通过形态学鉴定或鉴定结果存疑的蚊种,利用DNA条形码技术进行比对分析,不仅能得到较为可信的鉴定结果,也能验证形态学鉴定的准确性。利用DNA条形码技术进行种类鉴定,需要有标准的序列与待测样本的基因序列进行比对分析,根据查询GenBank数据库,截至2025年1月24日,数据库中共上传了150种2197条蚊全基因组序列,与目前全球已发现的3698种[1]还有一定差距。数据库的蚊种标准序列有限是利用DNA条形码技术进行蚊种鉴定的最大限制因素,期待随着研究人员对不同蚊种基因测序的完善,丰富数据库里的蚊种基因序列,使该技术有更大的应用空间。
2.2 DNA芯片技术
DNA芯片技术主要是将特定的DNA片段(基因探针)有规律地排列固定在固相支持物上,构成一个二维DNA探针阵列,并与未知标本的PCR扩增产物进行杂交,洗脱后根据荧光显色判断未知标本的物种分类,所使用的探针必须具有物种唯一性。DNA芯片主要有cDNA芯片和寡核苷酸芯片[38]。有研究者[38-39]对特定蚊种利用其DNA条形码标准序列作为模板设计DNA探针,与商品化的芯片组合成识别蚊种的DNA芯片,对蚊种有良好的鉴定性能。该鉴定技术不受蚊种发育阶段和来源方式(实验室饲养和野外捕获)的限制,但对蚊复合组的鉴定准确率不高[38]。利用DNA芯片技术进行蚊种识别鉴定的研究较多,但该方法中探针设计的难度较大,成本较高,在实际应用中难以推广。
2.3 其他分子生物学技术
除前文所述方法外,基于分子生物学技术进行蚊种鉴定的方法还有限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)、随机引物扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD)、扩增片段长度多型性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)、单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP)等[22, 39-41]。这些检测技术均是基于分子学水平进行蚊种鉴定,以往研究较多,但因技术操作难度、更为简便方法的出现等原因,当前在实际中应用范围有限。
3 基于质谱技术的鉴定方法
每种生物都由自身独特的肽/蛋白质组成,因此使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Flight Desorption/ionizationtime-of-mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)技术进行物种鉴定被广泛应用于微生物领域[42-43]。近年来,有较多关于MALDI-TOF MS技术在昆虫学领域实现种类鉴定的研究。利用MALDI-TOF MS技术进行蚊种鉴定,将检测样本的肽质量指纹图谱与建立的数据库利用软件MALDI Biotyper进行比对分析,通过对数分值(the log score values,LSVs)大小估算来实现物种鉴定,LSVs>1.8被认为该物种鉴定结果较可靠[44-45]。当前利用MALDI-TOF MS技术进行蚊种鉴定,研究方向主要有蚊类不同部位对鉴定结果的影响,同种不同来源方式(野外捕获、实验室饲养)蚊种鉴定结果的差异,捕获时间长短对鉴定效果的影响[46],以及吸血与否对鉴定结果的影响等[44-45, 47]。研究者们在利用蚊不同部位进行蚊种鉴定时,腿是被使用较多的部位,且研究证实利用蚊腿进行质谱分析可得到很好的LSVs分数以实现蚊种鉴定[44-45, 48]。此外,利用头、胸部也可进行质谱分析实现蚊种鉴定,且用腿与胸、腿与头的双图谱对比分析,可以增强MALDI-TOF MS鉴定的成功率和准确性[48]。并且有研究表明,蚊捕获冷冻保藏20 h后,仍然可以利用MS图谱实现蚊种鉴定[46]。对于蚊不同来源和吸血与否通过质谱分析进行蚊种鉴定,不同研究者的研究结果有所不同。不同来源蚊种的MS图谱有差异,即使选择同一部位样本进行比对分析,其MS图谱也非完全相同[47, 49-50],但仍可用于蚊种鉴定[44]。而在蚊吸血与否的鉴定研究中,不同研究者的结果完全不同,主要与选择蚊样本部位差异[44, 47]和解剖蚊时其吸入血对所选部分污染情况有关[47]。
利用MALDI-TOF MS技术进行蚊种类鉴定是近年来的研究热点,利用该方法实现蚊种鉴定的前提需建立标准的蚊种参考质谱数据库,当前的研究主要是研究者们根据各自研究的需要,利用DNA条形码技术对某些鉴定蚊种建立的参考质谱图进行比对分析。目前用于蚊种鉴定的国际参考质谱数据库还有待进一步完善[44],并且不同的研究对蚊种鉴定的MS图谱存在差异,不利于实验室间进行重复的比较研究,有待于在后续研究中进行标准化。MALDI-TOF MS技术虽然可用于开展蚊种鉴定,但由于技术还需完善、仪器设备价格昂贵等原因,目前难以在实际蚊种鉴定中应用。
4 基于机器学习的鉴定方法
随着人工智能和大数据应用的不断发展,基于机器深度学习模型,实现蚊种自动识别分类的研究领域,受到众多研究者的青睐。基于机器深度学习实现蚊类鉴定主要有两个方面的研究,对蚊类图像视觉特征的提取研究和对蚊类翅拍音频率特征的提取研究。
4.1 基于数字图形的机器识别鉴定
利用机器深度学习实现蚊种鉴定主要是通过收集蚊类样本、采集图片信息建立图像数据集、导入数据构建模型、提取特征进行机器深度学习、训练、模拟、测试、比对,最终得出最优模型和结果。当前基于机器学习研究种类识别主要基于两个网络框架:卷积神经网络(Convolutional Neural Networks,CNN)架构和Transformer架构。基于不同的网络架构可探索建立不同的模型,对模型数据挖掘和深度学习的性能验证常用K折交叉验证的方法进行评估[51]。
CNN由于其在图像检测方面能力出众,可通过卷积操作提取特征,池化操作减少特征映射的大小,最后通过全连接层进行分类或其他任务[51],是当前计算机视觉领域最常用的深度学习网络架构[51-52],吸引了许多研究者基于CNN网络架构对蚊种鉴定进行探索研究。基于CNN网络架构探索机器学习进行蚊种鉴定的模型较多,不同研究者可根据研究需要建立、选择或优化机器深度学习模型,利用经鉴定确认的蚊种采集图片信息建立图像数据集或库,根据需要进行数据增强,然后将数据集/库分为训练集和测试集,用确定的机器学习模型进行训练、模拟、测试,可成功实现对特定蚊种较高的鉴定准确率[53-54],尤其对蚊属的区分更为精确[53]。此外,利用此架构通过机器学习也有对监测昆虫是否为蚊类的鉴定研究。这种新的机器学习算法,通过将重点蚊种列为已知,其余蚊种为未知,建立蚊类图像数据库,通过迁移学习训练,实现对已知蚊种鉴定和未知蚊种(包括数据库内未列入蚊种)是否为蚊类的识别目的[55]。该机器学习模型一定程度上打破了蚊种识别鉴定需要根据识别目标大量扩展新蚊种图像数据库的限制,在蚊的粗略鉴定中有一定的应用前景。
Transformers是一种基于注意力机制的神经网络框架,可通过计算序列中各个元素的重要性,增强模型对关键信息的捕捉能力[56]。在计算机视觉领域的Transformer模型主要有Vision Transformer(ViT)模型和Swin Transformer模型。利用Swin Transformer模型探究了机器学习对白纹伊蚊、埃及伊蚊和库蚊的分类识别能力,可达到较高的识别准确率[51, 56]。
利用机器学习实现蚊种鉴定,对深度学习模型使用的热点判别区域进行定位,有助于提高分类的准确型[55]。随着人工智能技术的不断发展,该方法有一定的应用前景。但是利用深度学习进行蚊种鉴定需要对选择模型进行优化,采集的数字图片质量会影响深度学习的效果。野外捕获蚊样本可因诱捕设备、冷冻处死等操作导致变色或损坏,使鉴别特征减弱或消失,同时采集图片时的拍摄角度、光线强弱、蚊的姿态等因素也会影响图片质量,因此建立高质量的数据库用于机器深度学习并不容易。考虑不同口岸蚊种分布的差异性[57-62],口岸截获的入侵蚊种多样[63],利用机器深度学习的方法在口岸开展蚊种鉴定,需要对不同口岸优势蚊种或重点关注蚊种的数据集进行训练学习,在口岸开展监测进行蚊种鉴定才能达到预期效果,就目前而言还存在一定难度。
4.2 基于翅拍音的机器识别鉴定
通过机器学习实现蚊种鉴定,除了基于视觉特征进行深度学习的模型之外,还有基于听觉特征的深度学习。基于听觉特征的深度学习主要是建立蚊类的翅拍音数据集,基于不同的研究目的和模型算法,提取蚊翅拍音的特征,经机器深度学习实现对特定蚊种的鉴定。利用翅拍音特征进行蚊种鉴定主要的训练模型是基于CNN网络架构的模型,采集特定蚊种翅拍音,利用快速傅里叶变化(Fast Fourier Transform,FFT)转化为频谱图,将音频数据转变为类似图形的数据进行深度学习,通过使用不同的分类器,利用不同蚊种翅拍音频率特征的差异,可以实现对特定蚊种鉴定[64],当前对埃及伊蚊(Aede aegypti)和致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的研究较多,且能达到较高的分类准确率[64-66]。由于环境噪音具有鲁棒性,使用分类器对蚊种进行鉴定时,有噪声的情况下其准确率有所下降[66]。由于不同蚊种在翅拍频率上有重叠[59],要大范围应用此方法进行蚊种识别,在现有研究模型的情况下,可能难以实现,但是针对特定蚊种的识别提供了很好的经验。
此外,有研究分析了蚊类翅拍音频率和环境噪音频率的差异,通过利用手机APP大量采集野生环境的蚊类翅拍音,建立了数据集,并且该研究的所有数据通过HumBug项目网站(https://humbug.ox.ac.uk/)进行公开。通过机器深度学习对蚊翅拍音和环境噪音的识别准确率分别达到89%和97%[67],证实了利用APP对蚊翅拍音的监测,可实现对APP录取音频是否为蚊类的识别,在开展蚊类密度监测方面有较强的推广价值。
5 讨论
当前,成蚊种类鉴定方法以依据形态学特征的人工鉴定为基础,以基于DNA条形码技术鉴定为重要补充,两者的有效结合可大大提高成蚊种类鉴定的准确性和效率。此外,上述成蚊鉴定方法各有一定的局限性,在实际工作中难以单一大范围推广应用,但是给后续蚊种鉴定研究提供了参考。尤其是利用机器深度学习开展成蚊种类鉴定,体现了现阶段蚊种鉴定在传统鉴定技术基础上的智能化探索,伴随着技术的不断发展,将有更多研究者投身于该领域的研究,进而不断丰富数据库的蚊种类型,为机器深度学习提供更为有利的训练、模拟、测试数据。当前,如何丰富完善并充分利用蚊种鉴定线上资源,拓展基于机器学习实现蚊种识别鉴定的深度和广度,对于在实际工作中提高蚊种鉴定的效率意义重大,需要在以后的研究中不断深入拓展和充分验证。
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基金项目:国家重点研发计划项目(2022YFC2302704)
第一作者:杨玫(1990—),女,汉族,云南大理人,本科,主管医师,主要从事卫生检疫工作,E-mail: yangm90@yeah, net.
通信作者:覃卫红(1967—),男,土家族,湖南常德人,本科,副主任医师,主要从事卫生检疫工作,E-mail: qinwh19@sina.com
1. 云南国际旅行卫生保健中心(昆明海关口岸门诊部) 昆明 650100
2. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026
1. Yunnan International Travel Health Care Center (Kunming Customs District Port Clinic), Kunming 650100
2. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026