李佳潼 王安石 邓宗汉 潘英文

摘 要 本文对濒危兰科植物的根、茎、叶、花、种子不同组织的DNA提取效果进行了研究，为开展分子鉴定等研究提供基础。采用改良十六烷基三甲基溴化铵法（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）提取其基因组DNA，对获得的DNA质量、浓度和纯度进行比较；并以获得的基因组DNA作为模板进行DNA条形码基因ITS、matK、psbA-trnH的PCR扩增验证，评价各基因序列的扩增效率。研究结果表明，不同组织提取的DNA质量均较好，DNA电泳条带清晰、明亮。种子提取的DNA浓度最高，根、叶、茎次之，花最低。不同组织提取基因组DNA模板的PCR扩增效果良好，可用于鉴定濒危兰科植物物种的DNA 条形码扩增等实验。

关键词 濒危兰科植物；DNA提取；不同组织；适用性评价

Comparison and Applicability Assessment of DNA Extraction from Different Tissues

in Endangered Orchid Species

LI Jia-Tong ¹ WANG An-Shi ¹ DENG Zong-Han ² PAN Ying-Wen ^1*

Abstract To establish a basis for molecular identification and associated studies, the research examines the efficacy of DNA extraction from diverse tissues-roots, stems, leaves, flowers, and seeds of endangered orchid species. The modified CTAB protocol was utilized for genomic DNA extraction, and a comparative analysis was conducted regarding the quality, concentration of the extracted DNA. The isolated genomic DNA was employed as a template for PCR amplification of DNA barcode genes, including ITS, matK, and psbA-trnH, to assess the amplification efficiency of each gene segment. The findings demonstrate that the quality of DNA extracted from different tissues, post-optimization, is predominantly high, evidenced by distinct and prominent DNA electrophoresis bands. The highest DNA concentration was recorded from seeds, followed by roots and leaves, with flowers yielding the lowest concentration. The PCR amplification of genomic DNA extracted from different tissues showed good performance, rendering it suitable for experiments focused on DNA barcode amplification for the identification of endangered orchid species.

Keywords endangered orchid species; DNA extraction; different tissues; applicability assessment

基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFC2600603）；海关总署科研项目（2022HK127，2023HK043）

第一作者：李佳潼（1988—），女，汉族，吉林吉林人，硕士，农艺师，主要从事植物检疫、植物物种鉴定研究工作，E-mail: Lijiatong_4@126.com

通信作者：潘英文（1981—），男，汉族，福建漳州人，博士，正高级农艺师，主要从事植物检疫、植物物种鉴定研究工作，E-mail: pyw910@163.com

1. 海口海关动植物检疫中心 海口 570311

2. 昆明海关技术中心 昆明 650228

1. Animal and Plant Quarantine Center, Haikou Customs, Haikou 570311

2. Kunming Customs Technology Center, Kunming 650228

兰科植物极具观赏价值，近年来有关兰科植物的分子生物学研究越来越多。DNA提取是基因克隆、PCR扩增、分子鉴定以及遗传多态性分析等分子生物学研究的基础。按照《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES），濒危兰科植物约占公约保护植物总数的90%，是进出境物种资源查验工作的重要组成部分。目前针对兰科植物形态特征鉴定是口岸物种查验鉴定的常用方法，但处于非生育期的许多兰科植物种类间形态差别很小，仅凭形态特征较难分类。另外，有时口岸截获的濒危兰科植物不完整，只有根、茎、叶、花、种子等部分组织，使得形态学鉴定难以实现。目前兰科植物大多采用DNA条形码方法如atpF-atpH、rbcL、rpoB、rpoC1、psbA-trnH、matK和核糖体ITS等序列来加以鉴定^[1-3]，这些方法都需要获得高质量DNA才能进行。

植物含有次生代谢物，如多酚、生物碱、黄酮类等，影响DNA提取和后续DNA酶切、扩增及克隆等^[4]。濒危野生兰科植物由于适应相对恶劣的生长环境，细胞壁坚韧，含有与抗逆有关的多种化合物，如多糖、脂类、多酚等次生代谢物，高质量的基因组DNA提取相对困难，经典的DNA提取方法有十六烷基三甲基溴化铵法（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）和十二烷基磺酸钠法（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）等^[5-9]。山兰不同部位DNA提取的比较研究结果表明，假鳞茎、叶片、花芽提取的DNA浓度存在差别，DNA纯度相近，对随机扩增多态性DNA标记（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）扩增没有明显影响^[10]。本研究采用改良CTAB法提取濒危兰科植物根、茎、叶、花、种子的基因组DNA，对获得的DNA质量、浓度和纯度进行比较；将获得的基因组DNA作为模板进行DNA条形码基因ITS、matK、psbA-trnH的PCR扩增验证，评价各基因序列的扩增效率，为开展基于DNA条形码基因的濒危兰科植物物种鉴定等研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料来自海口海关动植物检疫中心种质资源圃保存，为矮万代兰Vanda pumila、春兰Cymbidium goeringii。

1.2 仪器设备

高速冷冻离心机（德国Eppendorf，5804R）；超微量核酸分析仪（美国Thermo Scientific，Nanodrop2000）；梯度PCR仪（美国ABI，ProFlex）；电泳仪（美国BIO-RAD，PowerPAC）；凝胶成像系统（美国UVP，GelDoc-It²）。

1.3 样品处理

选取根、茎、叶、花、种子为材料，先用灭菌蒸馏水冲洗表层杂质等，然后用75%乙醇清洗，最后用灭菌蒸馏水冲洗。预处理后，用干净的密封袋密封，置于-70℃冰箱内贮存。

1.4 DNA提取

分别取已预处理的根、茎、叶、花、种子100 mg，加入等质量聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl Pyrrolidone，PVP），置于研钵中，加入液氮，研磨成粉，将粉末转至2 mL的灭菌离心管中，再加入800 μL的CTAB提取缓冲液（50 mmol·L^-1 Tris-HCl，20 mmol·L^-1 EDTA，700 mmol·L^-1 NaCl，l% β-疏基乙醇，2% CTAB，pH 8.0）；混匀后65℃水浴30～40 min，振荡混匀2～3次，放置冷却至室温，加入等体积的V_酚︰V_氯仿︰V_异戊醇= 25︰24︰1振荡混匀，4℃，12 000 r·min^-1离心10 min；取上清液，加入等体积的V_氯仿︰V_异戊醇= 24︰1振荡混匀，4℃，12 000 r·min^-1离心10 min；取上清液，加入1/10倍体积的3 mol·L^-1 NaAc和等体积的无水乙醇，混匀，冰上放置10～15 min，4℃，12000 r·min^-1离心10 min；弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，加入800 μL TE溶解后，加入10 g·L^-1 RNase液2 μL混匀，37℃保温30 min，加入等体积的V_酚︰V_氯仿︰V_异戊醇= 25︰24︰1振荡混匀，4℃，12000 r·min^-1离心10 min；取上清液，加入等体积的V_氯仿︰V_异戊醇= 24︰1振荡混匀，4℃，12000 r·min^-1离心10 min；取上清液，加入1/10倍体积的3 mol/L NaAc和等体积的无水乙醇混匀，冰上放置10～15 min，4℃，12000 r·min^-1离心10 min；弃上清液，沉淀用70%乙醇洗涤2次，室温静置2～3 min晾干，加入100 μL TE或ddH₂O溶解，置于-20℃冰箱中保存^[9]。

1.5 DNA检测

使用Thermo Nanodrop 2000超微量核酸分析仪测定提取的DNA样品230 nm、260 nm和280 nm处的光吸收值，根据OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀的比值确定DNA纯度。取5 μL样品DNA加上Loading buffer后，以DL15000 marker（TaKaRa）为参照，使用1%琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液中，3 V·cm^-1恒压电泳1～2 h（Power PAC3000电泳仪，BIO-RAD），凝胶成像系统下观察并拍照。

1.6 PCR扩增检测

将获得的根、茎、叶、花、种子的基因组DNA作为模板进行DNA条形码基因ITS、matK、psbA-trnH基因序列的PCR扩增^[11]。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，以DL2000 marker ( TaKaRa) 为参照，凝胶成像系统下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 DNA浓度与纯度检测

由表1可看出，根、茎、叶、花、种子不同组织中的DNA提取效果差异明显，种子提取的DNA浓度最高，根、叶、茎次之，花最低。OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.71～1.89，OD₂₆₀/OD₂₃₀为1.61～2.29，说明蛋白质及RNA污染较少，但茎、花提取DNA的OD₂₆₀/OD₂₃₀低于2.0，表示其存在少量盐类或有机溶剂等其他杂质污染。

表1 濒危兰科植物不同组织提取基因组DNA

质量及浓度检测

Table 1 The quality and concentration of DNA extracted with different parts in endangered orchid species

2.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量

由图1可看出，采用改良CTAB法提取的DNA电泳后杂质含量较低，DNA条带清晰完整，不同组织部位的DNA条带亮度差异较大，电泳条带有轻微拖尾现象，尤其是根、茎、种子存在一定程度的降解。

2.3 PCR扩增检测DNA的提取质量

由图2—图4可看出，采用改良CTAB法提取的根、茎、叶、花、种子不同组织基因组DNA作为模板进行DNA条形码基因ITS、matK、psbA-trnH的PCR扩增反应得到的条带清晰，亮度较高，稳定性好，均获得理想带型，可用于鉴别濒危兰科植物物种的DNA条形码扩增等实验。

3 讨论

同一种植物不同组织中DNA以及次生代谢产物的种类和含量差异很大，采用同一种方法提取DNA的效果也不一样^[12-15]。尤其是叶片光合作用过程容易积累多糖、单宁、多酚等次生代谢物质，干扰DNA的提取过程，导致产率下降。同一组织处于不同发育阶段，DNA提取效率也存在差异^[5]。幼嫩组织处于快速生长阶段，细胞数量更为丰富，DNA含量也更高，而代谢产物则相对较少，幼嫩组织DNA产率高于成熟组织。由于不同组织DNA的产率受组织发育程度的影响，根、茎、叶、花、种子的DNA提取浓度及比较结果也存在变化。植物样品组织与储存方式的选择与预处理对 DNA 提取的成功至关重要。

由于濒危兰科植物根、茎、叶、花、种子次生代谢产物的种类和含量差异很大，DNA提取过程步骤需根据不同组织进行调整。假鳞茎中含有大量多糖影响后续的分子生物学研究，采用改良CTAB法能够有效去除多糖；蛋白去除不彻底，可用酚、氯仿继续抽提，比如茎、花、种子；多酚去除不彻底，样品研磨或提取液提高PVP质量浓度，比如根、叶、种子。扩增成功率是DNA条形码应用的主要限制因素，不同组织部位DNA提取质量的差异，容易影响其识别效率和扩增成功率。本研究根据濒危兰科植物的根、茎、叶、花、种子不同组织特性，在原CTAB法基础上进行改良，DNA提取过程增设去除次生代谢物质的实验环节，但也导致DNA产率有所降低。经方法优化的不同组织提取的DNA质量均较好，DNA电泳条带清晰、明亮。不同部位提取基因组DNA模板的PCR扩增效果良好，可用于鉴定濒危兰科植物物种的DNA 条形码扩增等实验。

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1.矮万代兰根; 2.矮万代兰茎; 3.矮万代兰叶; 4.矮万代兰花; 5.矮万代兰种子; 6.春兰茎; 7.春兰叶; 8.春兰种子; 9.春兰花; 10.春兰根

图1 濒危兰科植物不同组织提取基因组DNA

凝胶电泳检测图

Fig.1 Gel electrophoresis of DNA extracted with different parts in endangered orchid species

1. 矮万代兰根; 2.矮万代兰茎; 3.矮万代兰叶; 4.矮万代兰花; 5.矮万代兰种子; 6.春兰茎; 7.春兰叶; 8.春兰种子; 9.春兰花; 10.春兰根

图2 ITS基因序列PCR扩增结果

Fig.2 Results of PCR amplification by primer ITS

1. 矮万代兰根; 2.矮万代兰茎; 3.矮万代兰叶; 4.矮万代兰花; 5.矮万代兰种子; 6.春兰茎; 7.春兰叶; 8.春兰种子; 9.春兰花; 10.春兰根

图3 matK基因序列PCR扩增结果

Fig.3 Results of PCR amplification by primer matK

1. 矮万代兰根; 2.矮万代兰茎; 3.矮万代兰叶; 4.矮万代兰花; 5.矮万代兰种子; 6.春兰茎; 7.春兰叶; 8.春兰种子; 9.春兰花; 10.春兰根

图4 psbA-trnH基因序列PCR扩增结果

Fig.4 Results of PCR amplification by primer psbA-trnH