马赛 胡薇 冯茹荔 梁超帅 冯小航

摘 要 随着医学技术的不断发展，疟原虫检测技术取得显著进步。本文针对疟原虫的常用检测方法进行综合分析，主要包括血涂片检查法、血液棕黄层定量分析法、间接免疫荧光抗体法、酶联免疫吸附试验、免疫层析技术、PCR技术、DNA探针技术等。同时，对近年来CRISPR基因编辑技术在疟原虫检测领域的应用潜力和面临的挑战进行探讨。未来，技术的进一步发展和完善将使得CRISPR基因编辑技术在疟原虫检测领域的应用更加广泛和深入，为疟疾的精准诊断提供新的途径。

关键词 疟原虫；检测技术；创新应用

Development and Innovative Applications of Plasmodium Detection Technologies

MA Sai ¹ HU Wei ^2* FENG Ru-Li ¹ LIANG Chao-Shuai ¹ FENG Xiao-Hang ¹

Abstract With the continuous advancement of medical technology, significant progress has been made in the detection of plasmodium. This paper provides a comprehensive analysis of the commonly used detection methods for plasmodium, including blood smear examination, quantitative analysis of the buffy coat layer, indirect immunofluorescence antibody assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunochromatographic techniques, polymerase chain reaction (PCR), and DNA probe technology. This review also explores the potential applications and challenges of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) gene-editing technology in the field of plasmodium detection. Future development and refinement of these technologies are expected to expand the application of CRISPR gene-editing in plasmodium detection, offering new avenues for the precise diagnosis of malaria.

Keyword plasmodium; detection technology; innovative application

疟疾是由疟原虫侵入人体所引起的传染病^[1]，能够经过受感染的雌蚊叮咬进行人际传播^[2]。引起人类疟疾的疟原虫有5种，分别是恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫^[3]。疟疾被列为全球关注的三大公共卫生问题之一，仅2023年就导致全球约2.63亿疟疾新增病例和59.76万例死亡病例，83个国家和地区有疟疾流行，非洲是“重灾区”^[4]。

疟疾在我国俗称“打摆子”“发疟子”或“冷热病”^[5]。人体感染疟原虫后会出现周期性寒战、高热、出汗、退热，如未能及时发现和治疗，会发展为贫血、脾肿大等症状^[6]，严重时可发展为脑疟甚至致死。尽早发现疟原虫感染者，及时、准确地诊断对有效治疗疟疾及控制流行具有重要意义。

在医学发展的过程中，对疟原虫的检测技术经历了从传统到现代、从单一到多元的发展过程。本文对目前常用的疟原虫检测方法进行介绍和分析，结合当前疟原虫检测技术的发展，探讨CRISPR技术在疟原虫检测方面的应用情况和未来发展前景，对该方法的优势和存在的挑战进行综合分析。

1 疟原虫常用检测方法

1.1 常规检测方法

1.1.1 血涂片检查法

血涂片检查法是疟疾实验室检测中最常用的方法，也是世界卫生组织（WHO）推荐的“金标准”。血涂片的制作和疟原虫检测方法参照WS 259—2015《疟疾的诊断》^[7]。通过抽取患者外周静脉血，制作成标准血片，再经过染色处理后，便可在100倍油镜下观察到疟原虫。薄血膜还可用于虫种的确定^[8]。

血涂片检查法简单直观，成本较低，且能在短时间内完成检测，为临床诊断和治疗提供了有力的支持。同时，显微镜下疟原虫形态清晰可见，能够直观地观察到疟原虫的存在、形态和数量等信息，还可以确定虫种和原虫密度，并且血涂片可以长期保存。该方法也是检验其他诊断方法特异度、灵敏度和稳定性的评价标准^[9]。然而，该方法也存在一些局限性，如耗时费力，敏感性较低，受血涂片质量、检验人员镜检技术等因素影响较大。当原虫密度较低时，容易出现漏检的情况，对于国内较为少见的卵形疟和三日疟易出现错判^[10]。

1.1.2 血液棕黄层定量分析法

血液棕黄层定量分析法（Quantitative Buffy Coat Analysis，QBC）建立于1983年，Wardlaw等人首先将其应用于定量分析血液有形成分^[9]。QBC的原理是根据细胞密度差异，通过高速离心将血液中的不同成分分离到不同液层，利用分析仪专用管中特殊的活体染色剂，使不同的染色细胞在紫色光照射下产生不同颜色的荧光。在疟原虫检测方面，由于感染疟原虫的红细胞比正常红细胞轻，而又比粒性白细胞略重^[11]，Becton Dickinson公司最早利用该特点将QBC技术运用于红内期疟原虫的检查并实现商品化^[12]。

临床应用结果表明，该方法操作简便、快速，检测一份样品只需10 min，可同时操作多份样品。在血内原虫密度较低时，QBC技术的离心分离和浓集操作，使其相对于血涂片检查法有更大检获疟原虫的机会。然而，QBC法相比血涂片检查法，存在采血量大的缺点，一般QBC的采血量为55 μL，达到厚血膜法血量（一般为4～5 μL）的10倍以上^[13]。同时，QBC法还存在成本较高的问题，需要荧光显微镜，所使用的QBC管价格昂贵且不能重复使用，虽在实验室中检测效果较好，但在现场应用方面尚不尽如人意。因此，QBC法目前只是作为疟疾诊断的一种辅助方法。

1.2 免疫学检测方法

1.2.1 间接免疫荧光抗体法

间接免疫荧光抗体法（Indirect Fluorescent Antibody Test，IFAT）是在待测血清抗体（第一抗体）与抗原结合后，加入荧光标记的第二抗体，洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光。

该方法具有较高的敏感度和特异度，且重复性较好，但是IFAT的缺点也较为明显。例如：确定特异性时需要仔细权衡阳性标准，具有一定主观性^[14]；随着标本存放温度的上升和存放时间的延长，抗体量逐渐下降，影响检测结果；需在荧光显微镜下观察；只有高滴度IFAT才适用于无症状疟原虫感染者的确定和临床诊断^[15]。

1.2.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA）是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，以酶标记的抗原或抗体与黏附在载体上相应的抗体或抗原结合，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，再与酶底物作用，根据底物显色强度实现抗原和抗体定性及定量检测。

该方法灵敏性好、特异性强^[16]、稳定性高，且由其衍生出斑点ELISA（Dot-ELISA）等一系列方法，均可用于临床检验。该方法直接检测患者血清中的疟原虫抗体，可减少筛选的盲目性。但是ELISA技术操作繁琐、成本较高、影响因素多，而且容易出现假阳性。

1.2.3 免疫层析技术

（1）恶性疟原虫富组氨酸蛋白2（Histidine-Rich Protein-2，HRP-2）抗原检测：ParaSight-F浸条法和快速免疫色谱测试法（Immunochromatographic Test，ICT）是近年来应用较多的两种检测疟原虫HRP-2抗原的方法。ParaSight-F浸条法操作简便，无需特殊设备，且检测效果较好，7～10 min即可获得诊断结果，但只能检测恶性疟原虫。ICT法还可检测间日疟原虫及混合感染，操作快速方便，但当类风湿因子（Rheumatoid Factor，RF）存在时，ParaSight-F法与ICT法会出现假阳性结果，且假阳性率随着RF滴度的增加而升高^[17]。

（2）乳酸脱氢酶（Lactic Dehydrogenase，LDH）抗原检测：血液中LDH的水平与疟原虫虫体血症存在相关性，可作为疟原虫检测的标志物。该方法运用单克隆抗体免疫层析法，用LDH单克隆抗体捕获溶于血液中的LDH抗原，从而间接指示血液中疟原虫的数量。在常规疟疾检测工作中，单克隆抗体免疫层析法或PCR法均可作为镜检法的有效补充，能进一步提高疟疾病例的临床诊断水平。此外，单克隆抗体免疫层析法还可反映药物治疗后疟原虫数量的下降^[18]，能够评估治疗效果和鉴定抗药疟原虫株。

（3）谷氨酸脱氢酶（Glutamic Dehydrogenase，GDH）抗原检测：GDH以其独特的物理化学性质成为用于疟疾诊断的新技术^[19]。运用GDH胶体金层析法检测恶性疟具有较高的灵敏度和特异性。

1.3 分子生物学诊断方法

1.3.1 普通PCR

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术原理与细胞内的DNA复制相似，是一种体外快速扩增靶基因或DNA序列的方法。目前，PCR技术已广泛应用于病原体诊断、基因表达、遗传病检测等生命科学研究领域。PCR技术在疟原虫检测中具有良好的特异性和敏感性^[20]，而且应用普通PCR技术对保存1～5年的血样进行检测，PCR结果与原镜检结果的总符合率相符，表明长期保存标本不影响PCR结果。

1.3.2 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上发展起来的核酸荧光定量技术，其检测敏感度可达到每微升血液0.1713～0.8个疟原虫^[21-22]。相比于镜检法，实时荧光定量PCR在检测时具有快速、准确度高、阳性检出率高的特点^[23]。

1.3.3 DNA探针技术

DNA探针技术检测疟原虫是使用一定的示踪物对特定基因序列的核酸片段（探针）进行标记，然后通过探针与待测样本中互补片段的特异性结合，检测判断血样中疟原虫DNA。Franzen等于1984年首次报告应用DNA探针通过基因杂交诊断恶性疟疾^[24]。随着该方法的不断改进，其检测灵敏度、特异性和稳定性大幅度提高。DNA探针直接检测寄生虫基因，不仅可以发现原虫感染，而且可以鉴别虫种。但该技术的不足之处是操作繁琐、成本较高，还需要使用放射标记，限制了其现场应用。

2 新技术在疟原虫检测中的应用探讨

2.1 CRISPR技术应用

2.1.1 基于CRISPR/Cas12a的检测方法

基于重组酶聚合酶恒温扩增联合CRISPR/Cas12a技术可实现对疟原虫的超灵敏检测。通过设计RPA通用引物和4种常见疟原虫通用CRISPR/Cas12a RNA（crRNA），并构建疟原虫重组质粒，优化RPA和CRISPR/Cas12a系统的反应体系及反应条件后，能够建立4种常见疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a联合荧光读取器、横向流动试纸条和在紫外灯下裸眼观察3种结果展示形式的通用检测方法，该检测方法灵敏度强、特异性高。

2.1.2 特异性高灵敏度酶解报告基因解锁技术

特异性高灵敏度酶解报告基因解锁技术是一种结合了优化的快速样品制备方案和基于CRISPR检测技术的系统。其原理是DNA模板先通过CRISPR/Cas13a结合重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Mplification，RPA）技术等温扩增放大目标片段，再通过T7转录酶，将放大后的靶标分子转录为RNA，实现目标片段的二次扩增。在crRNA的引导下激活Cas13a蛋白的活性，切割体系内的荧光报告分子从而检测体系内的靶标分子^[25]。在实验中利用这种放大活性，可以将其与优化的样品制备结合起来，导向识别扩增的疟原虫序列中的物种特异性基序，然后释放Cas13a活性，它间接攻击单链DNA报告序列，这些报告序列的裂解产物有助于信号病原体特异性核酸的存在。美国研究人员2020年在PNAS发表论文，利用该技术研究开发出一种可现场应用的超灵敏诊断测试方法。通过该试验能够检测到每微升血液中少于2个疟原虫^[26]，这是世界卫生组织建议的在流行地区具有广泛实用性的测试方法的极限检测目标，该试验以100%的灵敏度、100%的特异性^[27-28]识别出真正的阳性样本，并在真正的阴性样本中正确识别出缺少某种疟原虫种类的样本，显示出该方法的临床潜力。

2.1.3 其他基于CRISPR的检测技术在疟原虫检测方面的应用

除了上述方法外，CRISPR技术还可用于疟原虫基因编辑模型的构建，从而深入研究疟原虫的基因功能。例如，利用CRISPR/Cas9系统快速制备疟原虫基因修饰模型，通过基因敲除、标签插入和基因替换等操作，为疟原虫基因功能的揭示提供高效工具。

2.2 CRISPR技术的优势与挑战

2.2.1 技术优势

（1）高灵敏度和特异性：CRISPR技术能够检测到极低浓度的疟原虫核酸，具有较高的灵敏度和特异性，可有效避免假阳性和假阴性的出现。

（2）操作简便、快速：与传统的检测方法相比，CRISPR技术的操作相对简便，同时能够在较短时间内得出检测结果，适合在资源有限的地区推广应用。

（3）可同时检测多种疟原虫：通过设计不同的crRNA，实现对多种疟原虫的同时检测，提高了检测效率和准确性。

2.2.2 技术挑战

（1）技术成本较高：目前，CRISPR技术的研发和应用成本相对较高，限制了其在一些发展中国家的普及和推广。

（2）脱靶效应：CRISPR技术存在一定的脱靶效应，可能会导致非预期的基因编辑，影响检测结果的准确性。因此，需要进一步优化技术，提高其靶向特异性。

（3）样本处理和质量控制：疟原虫检测样本的处理和质量控制对检测结果至关重要。在实际应用中，需要建立标准化的样本处理流程和质量控制体系，以确保检测结果的可靠性和稳定性。

3 结语与展望

CRISPR基因编辑技术在疟原虫检测中具有巨大的应用潜力。基于CRISPR/Cas12a的检测方法和特异性高敏感度酶解报告基因解锁技术等在疟原虫检测中展现出了高灵敏度、特异性和快速性的优势，有望为疟疾防控提供更有效的检测手段。

然而，该技术在实际应用中仍面临一些挑战，如技术成本较高、脱靶效应和样本处理等问题。因此，一方面，需要进一步降低技术成本，提高其可及性，在更多地区得到有效应用；另一方面，加强对脱靶效应的研究和控制，提高检测结果的准确性。同时，还需要建立完善的样本处理和质量控制体系，确保检测结果的可靠性和稳定性。未来，随着技术的不断发展和完善，CRISPR技术在疟原虫检测领域的应用将更加广泛和深入，为疟疾的精准诊断提供新的途径。

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基金项目：海关总署科研项目（2024HK099）

第一作者：马赛（1978—），男，汉族，河北廊坊人，硕士，副主任医师，主要从事出入境传染病监测工作，E-mail: ma_sai@126.com

通信作者：胡薇（1976—），女，汉族，山东济宁人，硕士，主管医师，主要从事疾病监测工作，E-mail: prettyvivian@126.com

1. 青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部） 青岛 266071

2. 青岛市市南区疾病预防控制中心 青岛 266071

1. Qingdao International Travel Health Care Center (Outpatient Department of Qingdao Customs Port), Qingdao 266071

2. Qingdao Shinan Municipal Center for Disease Control and Prevention, Qingdao 266071