赵优 张雅杰 程颖 杜思乐

摘 要 本文围绕形态学、染色体、蛋白质以及核DNA，探讨了群体遗传多样性标记技术在水生动物领域的应用概况，并比较分析了几种主要分子标记技术的优势和不足。同时，结合国际前沿技术，对水生动物遗传多样性研究发展提出建议，为我国水生动物多样性研究、物种资源保护、物种鉴定、良种选育等提供参考。

关键词 遗传多样性；形态学；染色体；蛋白质；核DNA

Overview and Prospect of Research Techniques on Genetic Diversity of Aquatic Animal Populations

ZHAO You ¹ ZHANG Ya-Jie ¹ CHENG Ying ² DU Si-Le ³

Abstract In this paper, focusing on morphology, chromosomes, proteins and nuclear DNA, we discuss the application of population genetic diversity marker technology in the field of aquatic animals, and compare the advantages and disadvantages of several major molecular marker techniques. At the same time, in combination with international cutting-edge technologies, this paper puts forward several suggestions for the research and development of aquatic animal genetic diversity, which provides a reference for the research on aquatic animal diversity, species resource protection, species identification, and improved variety breeding in China.

Keywords genetic diversity; morphology; chromosome; protein; nuclear DNA

我国水生动物种质资源丰富、栖息环境多样，是世界上生物多样性最丰富的国家之一。然而，由于全球气候变化、过度捕捞、外来物种入侵、环境污染等因素，许多物种处于濒危状态，根据《中国水生野生动物保护蓝皮书》，有92种鱼类被列为野生绝迹、濒危、易危、稀有等级^[1]。水生物种资源数量的下降导致海洋和内陆水生动物生物多样性均不断降低，给我国野生资源保护及生态安全带来一定的挑战。

遗传多样性是指生物携带的遗传信息的总和，其丰度对于研究物种生物多样性至关重要。一个群体的遗传多样性越丰富，表明群体遗传结构越稳固，使得物种适应环境变化的能力越强，基因交流程度越高，进而能更好地扩大物种资源^[2-3]。但由于环境及人为等因素影响，一些水生动物物种遗传多样性水平降低，从而减弱了这些物种抵抗环境变化的能力^[4]。水生动物在自然界物种当中数量巨大，种类分布广泛，研究其遗传多样性，对物种的种质鉴定、系统发生研究，以及探讨物种濒危的现状和原因具有重要意义，从而能进一步提出合理的保种措施，为物种资源保护、物种鉴定、良种选育等提供参考。

遗传多样性的系统研究经历了从宏观形态到微观分子、从定性分析到定量计算的发展过程，主要从形态、染色体、蛋白质及核DNA四个方面揭示物种遗传多样性变异。

1 形态学标记

形态学方法是进行种群遗传变异分析最传统、最直接的方法，已被广泛应用于水生动物遗传多样性研究。就鱼类而言，Hubbs等^[5]提出的传统形态测量方法得到广泛应用，但由于这种方法涵盖鱼体形态的信息量较少，无法建立量化判别，从而采用框架结构，从多元分析的角度去度量鱼体外部形态（包括纵向、横向及斜向的测量距离），通过多变量形态度量学测定，可更为精确地体现鱼体外部形态差异，实现快速鉴定物种或同一物种的不同地理群体^[6]。例如，王雪等^[7]利用传统形态性状测量及框架性状分析方法研究了江苏地区河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）繁殖期与非繁殖期种群形态特征差异分析，并建立判别公式，综合判别准确率为84.9%。对贝类形态的研究方法有壳形态数值分类学方法和支序系统学分析方法^[8]，其中，壳形态数值分类学方法在贝类群体差异分析中的案例较多，包括采用多元统计分析法（Multivariate Statistical Analysis）对不同地理群体菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）群体的形态差异进行比较研究^[9]；采用椭圆傅里叶分析法（Elliptic Fourier Analysis）如对地中海沿岸不同地理群体帘蛤（Chamelea gallina）进行形态差异分析^[10]；采用几何形态学测量法（Ggeometric Morphometric Analysis）如开展葡萄牙、西班牙等地大刀蛏（Ensis siliqua）形态差异分析^[11]。对于腹足纲的鉴定，则主要采用支序系统学形态分析方法，用于辅助开展群体遗传多样性分析^[8]。随着3D显微镜和人工智能技术的结合，形态学鉴定的精度得以进一步提升。

2 染色体标记

染色体是遗传物质的主要载体，染色体结构变异包括缺失、易位、倒位和重复等，是遗传多样性的重要来源。另外，染色体着丝点位置变化及核型特征差异也是在染色体水平上遗传多样性的主要体现。染色体多态性分析技术包括核型分析、荧光原位杂交、比较基因组杂交和全基因测序等。利用染色体组型差异分析种群遗传变化对于开展物种分类与进化研究、种质资源保护具有一定参考价值。其优点包括：遗传稳定性较高，受环境条件影响较小，操作也相对简便，实验成本低；但该方法也存在标记数量少、培养染色体分析材料耗时较长的缺点，一些不涉及染色体数目、结构变异或带型变异的性状难以辨别。毛雷刚等^[12]采用活体腹腔注射植物血球凝集素及秋水仙素的方法，用常规冷滴片制备染色体标本，分析金黄色乌鳢（Channa argus）染色体核型，为该物种遗传分析及物种评价与鉴定提供了参考。杨春英等^[13]采用上述相似方法，对洞庭湖区人工养殖湘云金鳙（Aristichthysnobilis red var.）的染色体组型进行分析，并将洞庭湖区与其他水域鲢亚科鱼的核型进行比较，探讨了鲢亚科鱼类的染色体遗传多样性。

3 蛋白质标记

蛋白质标记技术依据蛋白质电泳技术原理，在遗传多样性分析中通过比较不同个体或群体间蛋白质等电聚焦图谱的条带数量、位置和强度差异来分析遗传变异程度。其中，同工酶鉴定技术应用较为广泛，包括酯酶（Esterase，EST）、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）、苹果酸脱氢酶（Malate Dehydrogenase，MDH）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）等，通过分析物种群体内基因型、平均杂合度和等位基因频率的差异来评价群体遗传多样性分辨程度。蛋白质标记也存在一定局限性，易受到实验条件、个体差异、环境因素等多方面条件的制约，在一定程度上限制了其在鱼类种质鉴定中的应用。张四明等^[14]在蛋白质水平对中华鲟（Acipenser sinensis）天然群体遗传多样性进行研究，得出中华鲟多态座位比例为3.90%，遗传杂合度为0.04，均远远低于其他鱼类遗传多样性平均水平。

4 核DNA标记

核DNA标记技术是基于DNA多态性发展起来的一类遗传标记技术，能够直接反映生物个体在DNA水平上的差异。该技术的基本原理是通过分析DNA序列中特定区域的变异，来识别不同的基因型或表型，与其他方法相比，其优越性在于：基于DNA序列的变异进行分析，结果准确可靠；存在多种类型的DNA标记，可提供丰富的遗传信息，表现稳定；许多标记表现为共显性，能区分纯合与杂合基因型；不受环境和其他因素的影响，可分析微量的DNA或古化石样品。这些优势使DNA分子标记技术被广泛应用于物种分类、生物演化、遗传多样性分析、遗传育种等方面研究。

4.1 以杂交技术为核心的分子标记

以DNA分子杂交为核心的分子标记包括限制性内切酶片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、染色体原位杂交（Chromosome in Sire Hybridization，CISH）、可变数目串联重复序列（Variable Number of Tandem Repeats，VNTR）等，其中RFLP是较为常用的分子标记技术。RFLP技术最早由Grodzicke于1974年创立，1980年Bostein确立该方法^[15]，其原理是利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，得到长短或数量不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离并与放射性标记DNA探针进行Southern杂交，得到能够反映个体特异性的RFLP图谱。RFLP标记技术优势在于其为共显性等位基因，产生的标记数目多，标记范围覆盖整个基因组。然而，该技术的缺点在于实验过程需要先进行酶切，因此对样品DNA质量要求相对较高，使得一些样本的使用受到限制。此外，RFLP技术流程复杂，灵敏度较差，进行杂交时使用的放射性同位素会对外界环境产生一定影响，因此RFLP标记技术的应用受到一定限制。

4.2 以PCR技术为核心的分子标记

基于PCR技术的分子标记很多，包括扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、随机扩增多态性DNA（Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、内部简单重复序列（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）、简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）、单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）、靶位区域扩增多态性（Target Region Amplified Polymorphism，TRAP）、序列特征化扩增区域（Sequence Characterized Amplified Region，SCAR）、相关序列扩增多态性（Sequence-related Amplified Polymorphism，SRAP）等。其中，SSR和AFLP标记技术由于其多态性丰富，可靠性相对较高，应用案例较多。

4.2.1 SSR标记

SSR最早由Hamada等^[16]在动物基因组中发现，是一种基于基因组中短串联重复序列多态性的分子标记方法，广泛应用于遗传多样性分析、亲子鉴定、种群遗传学研究等领域。其原理是以DNA短串联重复序列为测定对象，通过侧翼序列特异引物进行目标区域PCR扩增，通过扩增DNA片段多态性反映物种遗传差异。SSR标记具有以下优点：等位基因多，多态性高，信息含量非常丰富；呈共显性遗传，能够区分纯合子和杂合子；标记丰富，可以在全基因组范围内进行检测；对DNA样本需求量少，且实验操作简单，检测方便；通过特异性引物扩增，实验结果重复性好^[17]。SSR标记的引物具有特异性，随着高通量测序技术的发展，开发SSR标记引物的方法逐步从近缘种扩增、构建小片段基因组文库、SSR富集法转向基因组测序方法。例如，林能峰等^[18]利用大黄鱼微卫星引物的近缘通用性获得了3个可在皮氏叫姑鱼（Johnius belengerii）扩增的位点。刘凯等^[19]采用磁珠富集方法开发了15个三角鲂（Megalobrama terminalis）多态性微卫星标记。王佳佳等^[20]通过对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）全基因组SSR点位分析，开发出10453975个SSR，并利用多态性丰富的14个SSR标记对6个国内外养殖群体的遗传多样性进行分析研究。

4.2.2 AFLP标记

AFLP标记技术是由荷兰Keygene公司的科学家Zabeau和Vos建立的一种检测DNA多态性的方法^[21]，其基本原理是利用限制性内切酶将基因组DNA进行酶切，形成分子质量大小不等的随机性酶切片段，再将人工合成的双链接头与酶切片段连接，形成特异性片段，并以特异性片段为模板，以接头序列和限制性内切酶的切点序列为基础设计引物，进行PCR扩增。AFLP具有以下优点：非特异性扩增出现几率少，实验的稳定性相对较高；不需要了解基因组序列信息即可进行扩增；扩增位点数量丰富，DNA使用量少，已应用于水产遗传育种、图谱构建、资源调查、品种开发、物种亲缘关系分析及基因定位等研究中。

例如，闫春梅等^[22]利用AFLP对鸭绿江上游、松花江上游和临江金鲨养殖场3个群体鸭绿江茴鱼（Thymallus arcticus yaluensis）的遗传多样性进行了比较研究，结果显示3个群体遗传分化显著。赵优等^[23]利用FAFLP对中国沿海多鳞四指马鲅（Eleutheronema rhadinum）群体的遗传多样性进行分析研究，扩增多态性比例为89.86%，不同地理群体间呈现明显的遗传分化。AFLP标记技术也存在明显不足，主要表现为对DNA纯度和限制性内切酶的质量要求较高，基因组DNA如果酶切不完全，对实验结果的统计产生较大影响；大多为显性标记，无法区分纯合子和杂合子；实验过程较为繁琐等。

4.3 单核苷酸多态性分子标记

随着高通量测序技术的快速发展，单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）以及插入缺失标记（Insertion-Deletion，InDel）等逐步用于群体遗传差异分析。以SNP为例，SNP是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，是生物遗传的变异中普遍存在的变异方式，在基因组中广泛存在，呈共显性^[24]。根据SNP所处的位置，可将SNP分为基因编码区SNPs（Coding-Region SNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）和基因间SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）。SNP具有以下几个优点：具有等位基因性，易于基因分型；位点丰富，整个基因组均可能存在SNP位点；突变率低、遗传稳定性高；可代表特定遗传机制中的重要作用因素，可针对特定功能基因开展研究。目前，SNP检测方法有RFLP、位点特异PCR扩增、SSCP、变性梯度凝胶电泳（Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）、温度梯度凝胶电泳（Temperature Gradient Gel Electrophoresis，TGGE）、分子信标（Molecular Bbeacons）、基因芯片以及高通量测序等^[25]。

SNP在遗传多样性的研究、物种鉴定、遗传图谱的构建以及种质资源管理等方面具有广阔的应用前景。葛锐等^[26]通过SNP扩增分型实验，再进行高通量转录组测序得到30个SNP位点，为斑重唇鱼物种鉴定和分子遗传标记提供参考。金方鹏等^[27]通过测序技术对澜沧江中上游4个地理群体的澜沧裂腹鱼（Schizothorax langtsangensis）野生样本进行遗传多样性分析，得到736515个群体SNP位点，为澜沧裂腹鱼种质资源的保护提供参考。

上述分子标记技术差异汇总见表1。

5 展望

随着高通量测序技术、生物信息学技术等快速发展，遗传多样性研究方法正朝着更高分辨率、更全面信息获取和更高效数据分析的方向发展，推进生态系统层面研究深度。我国作为世界生物多样性最丰富的国家之一，生态安全是国家安全的重要组成，特别是随着跨境贸易多元化发展，外来物种入侵风险不断加剧。海关作为防护口岸生物安全的第一道防线，在防范外来物种入侵、保护国家生物多样性方面发挥着重要作用。新技术的不断涌现和应用，使物种鉴定及生物多样性分析更加高效、精准，为口岸加强生物安全监管、保护和可持续利用生态资源提供了强有力的科学支撑。

5.1 全基因组测序技术推广

随着测序成本的降低和技术的进步，全基因组测序将成为水生动物遗传多样性研究的常规手段，提供全面的基因组信息。这有助于深入挖掘水生动物的遗传变异信息，发现更多的新基因和基因型，为遗传多样性的研究提供更丰富的数据支持，进而有助于揭示物种的进化历史、适应性进化和种群结构等深层次问题。

5.2 多组学技术互相融合

将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学技术相结合，从不同层次系统地研究水生动物的遗传多样性。通过比较基因组学分析不同水生动物物种之间的基因组结构和功能差异，构建系统发育树，追溯物种的进化关系；运用群体遗传学方法，评估水生动物种群的遗传结构和多样性水平，预测种群的动态变化和适应性演化趋势。

5.3 生物信息学技术得到广泛应用

利用先进的生物信息学工具和算法，对大量的遗传数据进行分析和处理。例如，通过开发新的数据分析软件和模型，可以更快速地识别和筛选与水生动物重要经济性状相关的候选基因，提高分子标记辅助选择的准确性和效率。同时，还可以利用生物信息学方法对水生动物的基因组进行注释和功能预测，为深入研究其遗传多样性和适应性机制提供理论依据。

5.4 非损伤性取样技术应用推广

研发和应用更加先进、准确且对水生动物无损伤或低损伤的取样技术，如环境 DNA技术。该技术可以通过收集水样中的游离DNA来获取水生动物的遗传信息，避免了传统取样方法对动物的伤害，尤其适用于对珍稀、濒危或难以捕捉的水生动物的研究。在口岸监管过程中，推广应用环境DNA技术，可避免进出境水生动物损伤性取样，有利于提升口岸疫情监测和效能。

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基金项目：海关总署科研项目（2023HK037）；中国海关科学技术研究中心项目（2023HZ01）

第一作者：赵优（1982—），女，汉族，博士，助理研究员，主要从事海关政策及物种资源研究工作，E-mail: you19821224@163.com

1. 海关总署研究中心 北京 100010

2. 中国进出境生物安全研究会 北京 100010

3. 中国海关科学技术研究中心 北京 101113

1. Research Center of General Administration of Customs, Beijing 100010

2. China Entry & Exit Biosecurity Society, Beijing 100010

3. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 101113

表1 几种分子标记技术的差异比较

Fig.1 Comparison of different molecular markers