刘嘉静 徐彪 王群 李桂梅 郑小龙 于业峰 石文军

摘 要 禽流感（Avian Influenza，AI）是危害全球畜禽养殖业的重要呼吸道传染病之一。禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）是分离与贮存于禽类的一类A型流感病毒，极易发生突变、基因重组和跨种传播，且病毒传播速度快，存在公共卫生安全威胁和大流行的风险。因此，做好禽流感的早期检测对于防控工作尤为重要。本文总结了近10年来国内外禽流感病毒检测技术以及国内现行标准，可为禽流感病毒检测提供适用、高效且准确的方法参考，以及为标准制修订和检测方法改进提供一定的研究基础。

关键词 禽流感病毒；检测方法；标准

Research Progress on Detection Methods and Standards of Avian Influenza Virus

LIU Jia-Jing¹ XU Biao² WANG Qun² LI Gui-Mei¹

ZHENG Xiao-Long² YU Ye-Feng² SHI Wen-Jun^2*

Abstract Avian influenza (AI) is one of the significant respiratory infectious diseases that endanger global livestock and poultry farming. Avian influenza virus (AIV) is a type A influenza virus isolated and stored in avian species, which is prone to mutations, genetic recombination, and cross-species transmission. Moreover, the virus spreads rapidly, posing a threat to public health safety and a risk of pandemics. Therefore, early detection of AI is crucial for disease prevention and control. This article summarizes AIV detection technologies at home and abroad in the past 10 years and the current domestic standards, which can provide an applicable, efficient and accurate method reference for the detection of AIV, and offer a certain research basis for the formulation and revision of standards and the improvement of detection methods.

Keywords avian influenza virus (AIV) ; detection methods; standards

禽流感病毒属于单股负链RNA病毒，由8个RNA节段构成，根据其血凝素（Hemagglutinin，HA）的抗原性和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的糖蛋白差异性分为18种HA亚型和11种NA亚型^[1-2]。禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）的天然宿主是水禽^[3]。近几十年来，禽流感病毒在全球范围内广泛传播并且发生重组或变异，甚至导致人畜共患病^[4]，对哺乳动物和人类存在潜在威胁。目前，AIV的鉴定检测方法主要分为病原分离鉴定、分子生物学检测方法、血清学检测方法和生物传感器检测等其他方法。

1 病毒的分离与鉴定

AIV通常可以在鸡胚中分离，对于哺乳动物谱系的甲型流感病毒，分离实验也可以在细胞中完成^[5]。王禹贺^[6]建立了禽流感病毒磁泳分离系统，是首次应用免疫磁泳的方法对禽流感病毒进行分离和富集的研究。该系统易与下游检测方法相结合，建立快速筛选禽流感病毒的芯片实验室。

2 分子生物学检测方法

2.1 变温扩增技术

2.1.1 逆转录-聚合酶链式反应

逆转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）是检测AIV的有效方法。王云鹤等^[7]建立了H7N9亚型禽流感病毒一步法RT-PCR方法，适用于H7N9亚型禽流感病毒的快速检测和亚型鉴定。杨芷翊等^[8]建立的一步法双重RT-PCR能在一次PCR反应中检出H10与N3亚型禽流感病毒混合感染或单一感染的样品，提供了一种简单有效的分子生物学快速检测方法。该方法需要核酸电泳来鉴定结果，样品量大时会显著增加工作量。

2.1.2 实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应

相比于PCR，实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应（Real-time Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）整合了扩增和检测，简化了实验操作，同时具有高特异性，而且qPCR能够区分禽流感病毒中的HA和NA基因及其占比^[9]。虽然该方法的灵敏度和特异性不是百分之百，但是可以通过正确的采样程序、规范的实验室操作标准以及高质量的提取工具，提高实验结果的准确性^[10]。基于该方法的简易性、特异性和高通量，目前是实验室检测最常使用的方法之一，也是各项标准里面都会推荐的检测方法之一。但是由于流感病毒亚型众多，目前标准里尚未形成流感病毒全亚型RT-qPCR的检测技术。

2.1.3 数字聚合酶链式反应

数字聚合酶链式反应（Digital Polymerase Chain Reaction，dPCR）是一种改进传统PCR的分子生物学新技术，被称为第三代核酸检测技术，该技术可以对靶核酸进行绝对定量，基于统计学，dPCR可以推断目标浓度和定量的准确性^[11]，不依赖标准曲线，适用于病原检测和疾病早期筛查。虽然dPCR的性能优于qPCR，但当前dPCR系统的通量较低，复杂性高，程序运转周期较长，且dPCR平台的选择受到可用商业仪器的限制，综合来说，dPCR并不能取代实验室中所有的qPCR检测^[12]，还需进一步改良。

2.1.4 高通量测序技术

高通量测序技术又称“下一代”测序技术（Next Generation Sequencing Technology，NGS）除了检测结果准确之外，其突变检测能力较强，可用于新发传染病和未知病原体的检测^[13]。赵璐等^[14]通过高通量测序技术成功测出一株从天鹅体内分离到的H5N8亚型禽流感病毒的全基因组，其测序深度大且结果准确，为大规模快速测定及分析AIV样品提供了参考。临床样品中的RNA病毒数量有限且容易降解，Qiu Y等^[15]认为应该转化为NGS文库进行测序，高效的文库制备对RNA病毒的病毒组检测至关重要，通过使用3种方法制备的NGS文库，首次鉴定出水貂中的11个哺乳动物病毒属。

2.1.5 液相蛋白芯片技术

根据分析物的类型不同，微球技术分为基于微球的多重核酸检测技术（Microsphere-Based Multiplex Nucleic Acid Assay Formats，MBMNA）和基于微球的多重免疫测定（Microsphere-Based Multiplex Immunoassays，MBMI）^[16]。液相蛋白芯片技术（Flexible Multi Analyte Profiling，xMAP）多重检测可以同时检测并分型病毒、细菌、寄生虫和真菌病原体，也可以截获抗原或抗体，检测时间合理且节约劳动力和成本，目前该技术已广泛应用于各种制药、临床和研究实验室。虽然我国生物芯片的基础研究与国际水平差距逐步缩小，但生物芯片产业化仍处于起步阶段，蛋白芯片技术复杂，研发困难且研发周期长，资金消耗多，该技术尚未投入商品化生产。

2.2 等温扩增技术

2.2.1 基于核酸序列的扩增

基于核酸序列的扩增（Nuclear Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）是一种基于转录的等温扩增技术，专门用于检测RNA，不易造成残留污染，其应用程序自动化水平高，可以进行日常监测和应急诊断。朱晓娟等^[17]认为NASBA法对于临床或现场检测和流行病学研究来说是一种更好的选择。Ju Y等^[18]建立了NASBA的超灵敏版本，称为基于切口和延伸链反应系统的扩增（Nicking and Extension Chain Reaction System-Based Amplification，NESBA），并证明了其实用性以及该系统在即时检测（Point-of-Care，POC）和现场分子诊断领域具有强大的适用性。但在进行NASBA时很多因素会导致结果出现假阳性或假阴性。

2.2.2 逆转录环介导的等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isother- mal Amplification，LAMP）目前已经得到了广泛的应用，其核酸扩增速度快、检测时间短、筛查范围广，灵敏度与RT-qPCR相当，设备和检测成本相对较低，具有现场快速检测的潜力，发展实时荧光逆转录环介导的等温扩增（Real-time Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification，RT-LAMP）方法可在疾病的早期快速筛查病例，对限制禽流感病毒扩散具有重要意义，适用于没有RT-qPCR的小规模诊断实验室^[19-20]。目前，很多学者已经成功建立起多重RT-LAMP方法。陈兵等^[21]建立的3种家禽病毒三重RT-PCR检测方法适用于病毒的快速筛查，检测结果可靠，具有现场筛选的特性。

2.2.3 重组酶介导的等温扩增法

重组酶介导的等温扩增法（Recombinase Aided Amplification，RAA）是一种新型核酸等温扩增技术。陈光明等^[22]建立了快速检测AIV的荧光逆转录重组酶介导的等温扩增法（Reverse Transcription Recombinase-Aided Amplification，RT-RAA），仪器便携且试剂稳定，操作简单，对人员的技术要求低，39℃的条件下仅需20 min即可完成反应，为现场快速检测提供了一种新的技术手段，可应用于基层和偏远山区。Li J等^[23]使用RT-RAA方法成功构建了一种H3亚型AIV的高特异性现场快速检测方法，操作简单，检测时间仅需30 min，检测结果与RT-qPCR的结果高度相符，可通过仪器进行目视观察，适用于基础实验室或资源受限的环境或紧急情况。虽然将该技术开发成商品化的现场快速检测试剂盒是可行的，但目前检测成本未知且缺少大量样本的实际验证。

2.2.4 CRISPR/Cas技术

与PCR等传统病毒检测方法相比，基于CRISPR/Cas系统的检测技术检测速度快，无需复杂的仪器设备，成本低，可应用于临床、实验室和现场检测等场景。该技术目前处于起步阶段，在检测病毒核酸方面具有一定的潜力和优势，但存在脱靶效应造成结果误差、序列依赖限制靶标区域选择以及不适用于检测新型病毒等问题有待进一步改进^[24]。

3 血清学检测方法

3.1 血凝试验和血凝抑制试验

血凝试验（Hemagglutination Test，HA Test）和血凝抑制试验（Hemagglutinatia Inhibition Test，HI Test）是检测AIV的经典方法。李宇刚^[25]采用回归检测试验的方法，使HA结果更加准确，不仅节省时间与试剂使用量，也提升了诊断效率。敖义鹏等^[26]通过规范制备红细胞、精准操作、严控试验条件，降低试验偏差，并对结果加以科学判定，提高了HI结果的精准性和可靠性。

3.2 琼脂凝胶免疫扩散试验

琼脂凝胶免疫扩散试验（Agar Gel Immuno- diffusion，AGID）可以用于AIV的诊断筛查，监测病毒感染和免疫反应，操作简便，不受AIV亚型干扰，特异性高，可直接眼观试验结果，无需复杂的仪器设备，成本较低。但该方法的灵敏度不高，结果等待时间长且容易出现假阳性，不适合用于快速检测大批量样品以及现场表征^[27]。AGID通常用于检测AIV抗体，但是不建议用于鸭子和野生鸟类中的AIV抗体检测^[28]。

3.3 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunos- orbent Assay，ELISA）方法操作便捷快速，对实验环境要求低，可以进行定性或半定量分析测定，适用于大批量样品的检测和疑似病例的快速检测，是实验室广泛应用的检测方法之一，但该方法的灵敏度和特异性受到AIV抗原和抗体纯度的影响。梁真洁^[29]建立了H5亚型间接ELISA方法，重复性好，灵敏度比HI方法高，可用于动物接种疫苗后体内抗体水平检测。Luo S等^[30]针对H3亚型AIV的单克隆抗体建立了夹心ELISA方法，灵敏度和特异性都比较高，可重复性好，方法操作上无需特定设备和专业技术人员。

3.4 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法（Gold Immunochroma- tographic Assay，GICA）操作简单，反应速度快，特异性高，成本低且便携，结果可直接用肉眼观察，可进行现场检测并实时报告，在流感检测中得到广泛应用。王勋^[31]认为理论上以NA作为靶点的抗原检测方法具有更高的广谱性和特异性，制备了针对N9亚型AIV的胶体金免疫层析试纸，可用于现场快速检测，无需大型仪器设备且成本不高。Sun Z等^[32]成功开发了一种快速检测H7亚型AIV的胶体金免疫层析试纸条，适用于临床样本分析，经试验验证该试纸条十分可靠，为快速检测病毒提供了一种有效的方法。

3.5 病毒中和试验

病毒中和试验（Virus Neutralization Test，VNT）是检测病毒特异性中和抗体和评估疫苗接种情况的标准方法，但经典的VNT耗时费力，适用于实验室检测，但不适合大规模检测或现场检测，在临床应用中难以推广，可用作标准与其他检测方法进行对比。Guo Y等^[33]开发了一种基于FA4-EGFP的新型VNT，检测时间比经典VNT快2～3 d，仅需24 h，特异性和灵敏度均较高，节约时间的同时，经济成本也较低。

3.6 间接免疫荧光方法

大多数检测都依赖于荧光方法，荧光检测具有高灵敏度，结果的可靠性优于PCR方法和ELISA方法，可重复性好。间接免疫荧光方法（Immuno Fluorescence Assay，IFA）是基于细胞层面的检测，最早用于鉴定和定位流感病毒感染细胞中的特异性抗原，主要是针对NP和MP抗原，也可以观察病毒在细胞中的分布情况，在疫病流行期间，该方法可快速确诊AI，同时操作简便快捷，广泛用于检测活疫苗中的外源病毒^[34]，常用作抗体制备试验中的鉴定方法之一。

3.7 补体结合试验

补体结合试验（Complement Fixation Test，CFT）可用于检测特异性抗体或抗原，分为常量法CFT和微量法CFT。其中，微量法CFT的操作简便，适用于基层实验室大量样品的检测，蒋卉等^[35]优化了微量法CFT的参数，提高了检测效率，并且用酶标仪对检测结果进行读数，使人员判定结果更为准确。Li M等^[36]将鲁米诺化学发光法（Chemi Luminescence，CL）应用于CFT中检测AIV重组蛋白rH7N9，成功验证了其评估活检分析的可行性，可以定量分析溶血过程的强度，并预测该方法将适用于小分子、有毒物质及短肽的研究。但是CFT在鸟类系统中的应用有限，且近50年来的相关报道较少，相比于其他检测方法，该方法的参考意义有限。

3.8 神经氨酸酶抑制试验

神经氨酸酶抑制试验（Neuraminidase Inhibition Test，NI Test）适用于实验室诊断病毒。由于该方法是动态发展的，当前的文献中并没有报道其标准化的测试条件和实验室程序，世界卫生组织推荐了一种NI检测的修改版，在微量滴定板中进行的神经氨酸酶抑制测定，即微量NI检测法。该方法极大地减少了试剂量的耗费，可同时对多个分离株进行抗原分类，与常量NI检测法相比，微量NI检测法的敏感性略低，也无法进行定量分析，但它已被证实是甲型流感病毒分类和抗体研究的快速方法^[37]。

4 其他方法

随着信息全球化的发展，Astill J等^[38]认为可以通过新技术和大数据检测来预测家禽的新发疾病，通过开发诊断、监测和早期检测方面的技术潜力，探讨如何更加科学地减少家禽传染病的威胁。生物传感器可将生物元素转换为可识别的信号，目前有关于AIV的生物传感器类型包括基于聚糖的流感病毒生物传感器、基于抗体的流感病毒生物传感器、基于适配子的流感病毒生物传感器、用于家禽诊断的流感病毒生物传感器。可穿戴传感器主要通过动物行为分析和生理监测来大致判断动物健康与否，通过与运营商的平台合作，结合云计算畜牧大数据平台，可以实现对动物的实时监控管理^[39]。无创非接触式分析主要包括声音分析、图像分析和机器人监控，可以进一步发展自动化检测方法，目前图像分析预测方法已经达到准确率较高的水准^[40]。

5 禽流感病毒现有检测标准和方法

5.1 国内现行标准

目前，实验室检测中多采用亚型特异性荧光定量PCR方法进行鉴定，现行常用的国家标准、地方标准和行业标准里基于该方法检测流感病毒不同亚型的方法见表1。

5.2 部分国内外相关检测方法

Yan S 等^[41]建立了多重实时RT-PCR方法用于H1、H2和H3亚型的检测。Liu J 等^[42]建立了微量中和试验和血凝抑制试验来评估确定H4、H5、H6、H9和H10亚型。李丹等^[43]建立了双重纳米PCR（nano-dPCR）方法用于H7亚型和N2亚型的检测，据报道其敏感性和检测结果准确率很高，可用于临床样品鉴别诊断和日常防控监测。Yang F 等^[44]建立了多重实时RT-PCR方法用于H4、H6和H10亚型的检测，据报道该方法能应用于实验室检测和临床筛查。莫胜兰等^[45]建立了荧光定量RT-PCR方法用于检测H6亚型。田井满等^[46]通过病毒分离与鉴定的方法对H8亚型进行了研究。唐玲^[47]建立了实时RT-PCR方法用于H10、H11和H12亚型的检测。朱彤等^[48]建立了实时荧光定量PCR方法用于检测H13亚型 。Azeem S 等^[49]建立了实时RT-PCR方法用于H14亚型和H15亚型的检测。孙雷云^[50]通过病毒分离与鉴定的方法对H16亚型和N3亚型进行了研究。Kuriakose T 等^[51]建立了多重微球方法用于H5、H7、N1和N2亚型的检测。James J 等^[52]建立了实时PCR方法用于N5、N6、N7、N8和N9亚型的检测。

6 展望

对于禽流感的诊断和防控，选择适合的检测方法至关重要。针对实验室现有的检测技术，完善禽流感病毒全亚型RT-qPCR方法，发展NASBA方法、实时荧光RT-LAMP方法、高通量测序和胶体金免疫层析法是未来可行的方向，而CRISPR/Cas系统虽然发展前景很好，但其相关技术的发展速度未知，尚未解决的问题较多，还需进一步分析探讨。

随着互联网技术的飞速发展，如人工智能、大数据和云计算等技术的进步，可以快速分析病毒的基因序列，预测病毒的变异趋势，疫情暴发时可以进行风险评估，这也使禽流感病毒的智能化监测预警成为可能。未来这些技术的研究应用将进一步提高禽流感病毒的检测效率和自动化水平，有助于更高效地监测和防控禽流感疫情，助力家禽养殖业健康发展。

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基金项目：海关总署科研项目（2024HK027，2024HK306）

第一作者：刘嘉静（1999—），女，汉族，硕士在读，主要从事病毒学研究工作，E-mail: 2428052801@qq.com

通信作者：石文军（1990—），男，汉族，博士，兽医师，主要从事进出境动物疫病检疫研究工作，E-mail: duoyanji@126.com

1. 青岛农业大学 青岛 266109

2. 青岛海关技术中心 青岛 266000

1. Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109

2. Technology Center of Qindao Customs, Qingdao 266000

表1 我国检测流感病毒的常用标准

Table 1 Common standards for AIV detection in China