王珮玥 梁娜娜 韩深 余佃宝 辛雪

摘 要 本文建立了一种同时测定蜂蜜、蜂花粉和蜂王浆中17种游离氨基酸的超高效液相色谱串联质谱法。方法采用小粒径五氟苯基色谱柱（Discovery HS F5-3 15 cm×2.1 mm，3.0 μm），在0.1%乙酸水溶液和乙腈体系下进行梯度洗脱，对待测物进行分离，用超高效液相色谱串联质谱仪测定，外标法定量。结果显示，17种氨基酸线性良好，相关系数大于0.995，方法平均回收率为85.8%～108.5%，相对标准偏差为1.0%～6.9%（n = 6）。使用建立的方法对蜂蜜、蜂花粉和蜂王浆各2份样品进行测定，结果表明，该方法简便快速、准确度高、精密度好，可为蜂产品的营养品质评价提供技术依据。

关键词 蜂蜜；蜂花粉；蜂王浆；游离氨基酸；超高效液相色谱串联质谱仪

Simultaneous Determination of 17 Free Amino Acids in Bee Products by UHPLC-MS/MS Method

WANG Pei-Yue ¹ LIANG Na-Na ^1* HAN Shen ¹ YU Dian-Bao ² XIN Xue ³

Abstract A UHPLC-MS/MS method was developed to simultaneously determine 17 free amino acids in honey, pollen and royal jelly. Separation of the analytes was achieved using pentafluorophenyl column (Discovery HS F5-3 15 cm×2.1 mm, 3.0 μm) and separated by the mobile phase consisting of 0.1% acetic acid in water and acetonitrile with the gradient elution. UHPLC-MS/MS method was for detection and external standard method was for quantification. The calibration curves of 17 amino acids showed good linearity within their respective concentration ranges with the correlation coefficients greater than 0.995. The average recoveries in the matrix were ranged from 85.8% to 108.5% with the relative standard deviations (RSDs) from 1.0%-6.9% (n = 6). The method was applied to each of 2 pieces of honey, pollen and royal jelly samples. The results showed the developed method was easy-to-operate, rapid, accurate and reproducible. It can provide detection basis for the nutritional quality evaluation of imported and exported bee products.

Keywords honey; pollen; royal jelly; free amino acids; ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

基金项目：海科中心自立科研课题（2023HZ03）

第一作者：王珮玥（1987—），女，汉族，天津人，硕士，高级工程师，主要从事进出口食品检验工作，E-mail: 406461732@qq.com

通信作者：梁娜娜（1986—），女，汉族，山西晋城人，博士，高级工程师，主要从事进出口食品检验工作，E-mail: na_naliang@126.com

1. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

2. 岛津企业管理（中国）有限公司 北京 100020

3. 华谱科仪（北京）科技有限公司 北京 101407

1. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

2. Shimadzu Enterprise Management (China) Co., Ltd., Beijing 100020

3. Acchrom Technologies Co., Ltd., Beijing 101407

蜂蜜、蜂花粉及蜂王浆功效很多，是一种稀少、珍贵的天然药材级食品^[1-3]，其氨基酸含量高，而且种类齐全，有的花种蜜高达20种以上。其中，以脯氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸为主要氨基酸，通常蜂蜜中的脯氨酸可占总氨基酸的50%。另外，苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸等在蜂蜜中也普遍存在。

对于氨基酸的检测，GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》^[4]、SN/T 5223—2019《蜂蜜中18种游离氨基酸的测定 高效液相色谱-荧光检测法》^[5]等，分别采用氨基酸分析仪和液相色谱仪进行测定，氨基酸分析法需要特性配套试剂和仪器，液相法需要进行衍生化操作，较为复杂，且衍生稳定性较差；GB/T 30987—2020《植物中游离氨基酸的测定》^[6]中采用液质法测定多种游离氨基酸，但适用范围不包含蜂蜜。目前，食品中游离氨基酸的测定方法有氨基酸分析仪法^[7-8]、液相色谱法^[9]、液相色谱串联质谱法^[10]，其中，液相色谱串联质谱检测方法多为稳定同位素内标法定量，前处理较复杂。本方法能够准确、快速、便捷地检测多种蜂产品中的游离氨基酸，有助于提升食品质量安全因子发现及检测能力。

1 实验部分

1.1 样品

蜂蜜、蜂花粉、蜂王浆样品于超市购买。

1.2 仪器与试剂

乙腈（色谱级，赛默飞世尔科技公司）；甲酸（色谱级，赛默飞世尔科技公司）；乙酸（色谱级，赛默飞世尔科技公司）；Milli-Q超纯水装置（Advantage A10 Elix 10，默克密理博有限公司）；LCMS 8045液相色谱串联质谱仪（岛津企业管理有限公司）；数字恒温水浴锅（科伟永兴仪器设备有限公司）；0.22 μm尼龙微孔滤膜（颇尔公司）。17种游离氨基酸标准品（≥98%，坛墨质检标准物质中心）。

1.3 标准溶液的配制

分别称取10.0 mg（精确至0.1 mg）17种氨基酸标准品，用0.1%甲酸水溶液溶解并定容至10 mL，使每种氨基酸标准储备液的浓度为1 mg/mL，4℃储存。

分别吸取0.5 mL 17种氨基酸标准储备液，至50 mL容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液稀释并定容，配置成10 μg/mL的混合氨基酸标准储备溶液，4℃储存。吸取0.5 mL混合氨基酸标准储备溶液，至10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液稀释并定容，配置成500 ng/mL的混合氨基酸标准中间溶液，临用现配。

1.4 分析方法

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Discovery HS F5-3（150 mm×2.1 mm，3.0 μm）；流动相：A：0.1%乙酸水溶液；B：乙腈；梯度洗脱程序：0～8.5 min，0.2 mL/min，94% A；8.5～8.6 min，0.2～0.3 mL/min，94% A～70%A；8.6～12.5 min，0.3 mL/min，70%A；12.5～12.6 min，0.3 mL/min，70%A～10%A；12.6～14.6 min，0.3 mL/min，10%A；14.6～14.7 min，0.3 mL/min，10%A～94%A；14.7～17.0 min，0.3 mL/min，94%A；17.0～17.1 min，0.3～0.2 mL/min，94%A；17.1～18.0 min，0.2 mL/min，94%A；进样量：5 μL；柱温：40℃。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI）；检测方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；扫描方式：正离子模式扫描；雾化气和干燥气均为氮气、加热气为空气、碰撞气为氩气；雾化气流量：3 L/min；加热气流量：10 L/min；接口温度：300℃；脱溶剂管温度：150℃；加热块温度：400℃；干燥气流量：10 L/min；接口电压：0.5 kV。17种氨基酸的基本信息、定量定性离子对、碰撞能量及保留时间见表1。

1.5 样品前处理

蜂蜜样品称取2 g（精确至0.001 g），蜂花粉和蜂王浆样品各称取0.2 g（精确至0.001 g）于250 mL锥形瓶中，加入100～200 mL沸水冲泡样品，摇匀，将样品充分溶解。放入90℃水浴锅中，水浴10 min，其间用手振摇1次，取出后冷却至室温，将样品溶液转移至250 mL容量瓶中，用少量水洗涤锥形瓶2～3次，洗涤液全部转移至容量瓶中，用水定容至刻度，经0.22 μm微孔滤膜过滤后待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

本文选取了Alphasil XD-C₁₈AQ（2.1×100 mm，2.5 μm色谱柱）、Alphasil VC-C₁₈（2.1×100 mm，2.5 μm色谱柱）、Discovery HS F5-3 15 cm×2.1 mm，3.0 μm色谱柱）和Acquity BEH HILIC（2.1mm× 100 mm，1.7 μm色谱柱）进行分离。结果表明，使用C₁₈或C₁₈-AQ色谱柱时，17种氨基酸的15种氨基酸在2 min之内共流出，且有13种集中在1～1.5 min出峰，保留较弱，分离度不理想；使用HILIC色谱柱时，大部分氨基酸集中在5～7 min出峰，且7 min之后出峰的峰型拖尾严重；使用F5-3五氟苯基色谱柱进行分离时，17种氨基酸均匀分布在2～10 min之间出峰，且峰型对称，保留效果明显变强，对极性相似的物质分离效果更好。因此，最终选择Discovery HS F5色谱柱对17种氨基酸进行分离。

2.2 流动相的选择

参考已有液相色谱质谱/质谱的检测方法，多使用有机相+水+甲/乙酸或甲/乙酸铵盐的流动相组合。实验发现，随着流动相中乙酸浓度变高，氨基酸色谱峰型变好，响应值变高，但乙酸浓度过高时，流动相pH值过低会影响色谱柱的寿命。最后，选定浓度为1%乙酸水为水相。当使用1%乙酸水（A）和乙腈（B）为流动相时，17种氨基酸的响应值和分离度较高且峰型对称，无明显拖尾现象。

2.3 质谱条件的优化

参考已有方法，氨基酸质谱测定方法采用正离子模式采集。分别将17种氨基酸标准溶液依次进样，在正离子模式下进行全扫描，确定目标化合物的分子离子为[M+H]⁺，将分子离子作为母离子，给予适合的碰撞能量，对二级离子进行全扫描，选择丰度较高的2个子离子作为两个目标化合物的定量和定性离子。以MRM模式优化相关质谱参数。使用优化后的色谱质谱条件测定，得到17种氨基酸标准溶液MRM色谱图，如图1所示。

2.4 方法特异性

亮氨酸（CAS 61-90-5）、异亮氨酸（CAS 73-32-5）和正亮氨酸（CAS 327-56-0）为同分异构体，极性相似且定量离子对相同。目前有些研究发现，一些不常见的植物源蜂蜜中含有微量正亮氨酸，故进行方法特异性考察，排除正亮氨酸的干扰。使用优化后的流速和梯度条件可以将亮氨酸、异亮氨酸和正亮氨酸基线分离，正亮氨酸不会干扰亮氨酸和异亮氨酸的测定。亮氨酸、异亮氨酸和正亮氨酸MRM色谱图如图2所示。

2.5 提取液及条件的优化

蜂蜜含有多种糖，主要为葡萄糖和果糖，此外还有蛋白质、氨基酸、多酚、有机酸和矿物质。蜂花粉是蜜蜂采集的花粉粒与蜂蜜及其分泌物混合形成的扁圆形的花粉团。蜂花粉含有大量蛋白质、糖类、脂类、纤维素、氨基酸、多酚和维生素等多种营养物质。蜂王浆是青年工蜂头部分泌的一种乳白色或淡黄色的浆状物质，蜂王浆主要成分为蛋白质、糖类、脂类，富含多种维生素、微量元素和酶类等。

本方法为了更好地测定蜂蜜、蜂花粉和蜂王浆中游离氨基酸的含量，故不考虑使用浓酸溶液或浓碱溶液高温提取样品，避免样品中的蛋白水解，只提取样品中的游离氨基酸。参考已发布的游离氨基酸测定标准和文献，对比4种提取液（0.1%甲酸水∶甲醇=8∶2（v/v）、5%甲醇水、水、沸水）的提取效果，测定蜂蜜样品和加标样品，加标浓度测定值为100 ng/mL（脯氨酸和苯丙氨酸为400 ng/mL）。样品称样后，沸水提取的试样使用沸水冲泡，振摇使其充分溶解，并在（90±5）℃下水浴10 min，静置至室温。其余3种提取液加入后涡旋振荡10 min，提取后静置。根据蜂蜜样品初测的浓度将提取液中氨基酸浓度稀释到曲线线性范围内，过微孔滤膜后上机，采用外标法对17种氨基酸进行定量。用回收率评价提取液的提取效率，结果如图3所示。

结果显示，沸水提取后的回收率普遍偏高，17种氨基酸回收率基本在80%～110%之间，常温提取的3种提取液均有部分氨基酸回收率在60%以下或120%以上，可能需要进一步净化才能改善回收率结果。实验过程中也考察了多种SPE小柱以及dSPE的净化效果，但是每种填料都对其中2～3种氨基酸有不同程度的吸附，回收率较低，故去掉净化步骤。

考察水浴时间对提取效率的影响，蜂蜜样品称样后，沸水冲泡充分混匀溶解，考察水浴10 min和水浴25 min时样品中17种氨基酸的含量，结果显示无明显差异。因此，选取10 min水浴进行样品提取。

2.6 基质效应

由于目标化合物在样品中为天然存在化合物，因此使用标准加入法评价样品基质效应。选取蜂蜜、蜂王浆和蜂花粉样品，按照样品前处理方法制备上样液，使用上样液配制17种氨基酸标准溶液，每种氨基酸添加5个浓度水平，上机测定，以添加浓度值为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线斜率k。使用溶剂配制相同添加浓度水平的纯溶剂标准曲线，得到纯溶剂标准曲线斜率k₀，计算斜率比SR = k / k₀。结果表明，3种样品中各游离氨基酸标准曲线SR均在0.85～1.1之间，无明显基质增强或抑制效应。

2.7 方法的线性关系

用0.1%甲酸水溶液配制标准工作曲线。其中，17种氨基酸的浓度分别为2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL。17种氨基酸保留时间、线性方程、相关系数见表2。结果显示，17种氨基酸在2～100 ng/mL之间线性良好。

2.8 定量限

蜂蜜、蜂花粉、蜂王浆等蜂产品中游离氨基酸为天然含有的目标分析物，没有限量要求。定量限的设定原则基于满足大多数实验室仪器灵敏度的要求，并且满足蜂产品中目标成分的含量测定，无需追求尽可能低的定量限浓度水平。

首先测定17种氨基酸标准品，确定定量离子对信噪比为10且定性离子对可检出时各氨基酸的浓度。实验结果显示，浓度为2 ng/mL时，17种氨基酸标准品的定量离子对信噪比均大于10且定性离子对可检出。然后，测定蜂蜜、蜂花粉和蜂王浆样品，样品中各氨基酸的测定浓度均在2 ng/mL的2倍以上。将蜂蜜、蜂花粉和蜂王浆试样溶液稀释不同倍数，使样品中的游离氨基酸含量在2 ng/mL左右，计算该浓度下目标分析物的定量离子对信噪比，结果显示，信噪比均大于10且定性离子对可检出。

2.9 方法回收率和精密度

选取常见蜂产品，如蜂蜜、蜂花粉和蜂王浆，作为方法回收率和精密度验证基质样品。根据样品中每种游离氨基酸本底浓度，分别在1/2本底值、本底值、2.5倍本底值左右设置3个水平加标浓度，每个水平重复测定6次，计算得到平均回收率和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。从表3—表5可看出，蜂蜜中17种游离氨基酸的平均回收率在91.5%～107.8%之间，RSD在1.0%～6.2%之间；蜂花粉中17种游离氨基酸的平均回收率在88.8%～108.5%之间，RSD在2.0%～6.9%之间；蜂王浆中17种游离氨基酸的平均回收率在85.8%～107.8%之间，RSD在1.3%～6.5%之间。

2.10 实际样品的检测

选取蜂蜜、蜂花粉和蜂王浆产品各2份进行测定，用本方法测定，每个样品重复测定2次，计算平均值，测定结果见表6。从表6中可以看出，蜂花粉、蜂王浆中的17种游离氨基酸含量均大于蜂蜜，蜂产品中脯氨酸含量相对其他氨基酸含量较高，蜂王浆中的赖氨酸含量明显高于蜂蜜和蜂花粉。

3 结论

本研究建立了一种使用超高效液相色谱串联质谱仪同时测定蜂蜜、蜂花粉和蜂王浆中17种游离氨基酸的方法。实验结果表明，选取适合的流速、流动相及梯度，可以合理地将待测物分离。样品经过高温水浴加热，可以消除基质影响，有效避免干扰。该方法简便快速、准确度高、精密度好，为蜂产品的营养品质分析提供技术支撑。

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表1 17种氨基酸信息和MRM参数

Table 1 Basic information and MRM parameters of 17 amino acids

注: “*”表示定量离子对.

(a) 羟脯氨酸; (b) 天冬氨酸

图1 17种氨基酸标准溶液MRM色谱图（2 ng/mL）

Fig.1 MRM chromatograms of 17 amino acid standard solutions (2 ng/mL)

(c) 胱氨酸; (d) 丝氨酸; (e) 苏氨酸; (f) 甘氨酸; (g) 谷氨酸; (h)脯氨酸; (i) 丙氨酸; (j) 缬氨酸

图1 17种氨基酸标准溶液MRM色谱图（2 ng/mL）

Fig.1 MRM chromatograms of 17 amino acid standard solutions (2 ng/mL)

(k) 组氨酸; (l) 赖氨酸; (m) 精氨酸; (n) 酪氨酸; (o) 异亮氨酸; (p) 亮氨酸; (q) 苯丙氨酸

图1 17种氨基酸标准溶液MRM色谱图（2 ng/mL）

Fig.1 MRM chromatograms of 17 amino acid standard solutions (2 ng/mL)

图2 异亮氨酸（a）、亮氨酸（b）和正亮氨酸（c）MRM色谱图

Fig.2 MRM chromatograms of isoleucine (a), leucine (b), and norleucine (c)

图3 不同提取液回收率对比

Fig.3 Recovery of different extraction solutions

表2 17种氨基酸的保留时间、线性范围、线性方程及相关系数

Table 2 Retention time, linear range, linear equation, and correlation coefficient of 17 amino acids

表3 蜂蜜中17种游离氨基酸添加回收率及相对标准偏差（n＝6）

Table 3 Recovery and RSD of 17 free amino acids in honey (n＝6)

表4 蜂花粉中17种游离氨基酸添加回收率及RSD（n = 6）

Table 4 Recovery and RSD of 17 free amino acids in pollen (n＝6)

表5 蜂王浆中17种游离氨基酸添加回收率及RSD（n = 6）

Table 5 Recovery and RSD of 17 free amino acids in royal jelly (n＝6)

表3（续）

表4（续）

表5（续）

表6 实际样品中17种游离氨基酸测定结果

Table 6 The results of 17 free amino acids of samples