王晗 赵晓亚 杨青 万莹 王惠 尚吟竹 王鹏

摘 要 本研究针对食用菌及食用菌制品中的麦角甾醇，建立了一种基于液相色谱法（Liquid Chromatography，LC）的检测方法。样品经皂化、甲醇超声提取后，采用LC对样品溶液进行分析，以甲醇为流动相，紫外检测器于282 nm波长处检测，外标法定量。对所建立的方法进行分析性能的考察，麦角甾醇在0.5～200 mg/L范围内线性关系良好，在食用菌干制品中麦角甾醇的检出限为10.0 mg/kg，定量限为25.0 mg/kg，在鲜食用菌、食用菌罐头及食用菌酱制品中麦角甾醇的检出限为2.50 mg/kg，定量限为6.25 mg/kg。采用该方法对24种食用菌及其制品中的麦角甾醇进行分析，样品中的麦角甾醇在80.9～4506 mg/kg之间。采用加标回收试验验证方法的准确性，在24种食用菌及其制品中，麦角甾醇的回收率在80.1%～120%之间，精密度为2.31%～13.3%。结果表明，所建立的方法简便、易于批量操作且具有良好的准确性，可满足食用菌及食用菌制品中麦角甾醇的测定需求。

关键词 麦角甾醇；液相色谱法；食用菌；食用菌制品

Determination of Ergosterol in Edible Mushrooms and Mushroom Products

WANG Han¹ ZHAO Xiao-Ya¹ YANG Qing¹ WAN Ying¹

WANG Hui¹ SHANG Yin-Zhu¹ WANG Peng¹

Abstract A method based on liquid chromatography (LC) has been established for the determination of ergosterol in edible mushrooms and edible mushroom products. After saponification and ultrasonic extraction with methanol, the sample solution was introduced into the LC system for analysis. Methanol was used as the mobile phase, and the ultraviolet detector was set at a wavelength of 282 nm for detection, the sample solution was quantified using external an standard. The analytical performance of the established method was evaluated. Ergosterol exhibited a good linear relationship within the range of 0.5-200 mg/L. The limit of detection (LOD) for ergosterol in dried edible mushrooms was 10.0 mg/kg, and the limit of quantitation (LOQ) was 25.0 mg/kg. For fresh edible mushrooms, canned mushrooms, and mushroom sauce, the LOD for ergosterol was 2.50 mg/kg, and the LOQ was 6.25 mg/kg. This method was applied to analyze ergosterol in 24 types of edible mushrooms and their products, and the ergosterol concentrations ranged from 80.9 to 4506 mg/kg in the samples. The accuracy of the developed method was verified by spiking recovery experiments, and the recovery rates of ergosterol in the 24 types of edible mushrooms and their products ranged from 80.1% to 120%, with a precision of 2.31% to 13.3%. The results indicated that the established method is simple and suitable for batch operation and has good accuracy, meeting the requirements for the determination of ergosterol in edible mushrooms and their products.

Keywords ergosterol; liquid chromatography; edible mushrooms; edible mushroom products

第一作者：王晗（1990—），女，汉族，湖北武汉人，博士，高级工程师，主要从事食品安全检测工作，E-mail: oliviahanwang@foxmail.com

1. 武汉海关技术中心 武汉 430000

1. Wuhan Customs Technology Center, Wuhan 430000

甾醇是一类由3个己烷环及1个环戊烷稠合而成的环戊烷多氢菲衍生物，包括动物甾醇、植物甾醇和真菌甾醇。真菌甾醇包括麦角甾醇、过氧麦角甾醇、羊毛甾-7,9(11),24-三烯-3β,21-二醇、麦角甾-7,22-二烯-3β-醇、24-甲基胆甾-7-烯-3β-醇、24(s)-24-甲基5α-胆甾-7,16-二烯-3β-醇以及麦角甾醇过氧化物等，其中麦角甾醇为真菌甾醇的主要活性成分，占真菌甾醇的70%以上^[1]。

麦角甾醇分子式为C₂₈H₄₄O，分子量为396.7，它是真菌细胞膜的重要组成部分，也是维生素D₂的前体，其在阳光或紫外线的照射下可以转化为维生素D₂，是人体维生素D₂的较好来源。另外，它还具有减少炎症和降低心血管疾病发生率、抗氧化、降脂、抗菌以及抗肿瘤等多种生理调节作用^[2-3]。研究表明，不同品种、不同生长时期、不同部位^[4]、不同储存条件^[5]的食用菌中麦角甾醇含量差异较大，其中遗传因素对食用菌中麦角甾醇的含量起到决定性的作用。因此，麦角甾醇的含量在不同的食用菌上存在较大的差异。有研究比较了金针菇、茶树菇、平菇、香菇等6种食用菌中麦角甾醇的含量，发现茶树菇和平菇中麦角甾醇含量较高，分别为4.87 mg/g和4.84 mg/g^[6]。但也有研究在比较了香菇（伏牛山嫂）、香菇（西峡9608）、平菇、杏鲍菇、金针菇、猴头菇、银耳、黑木耳8种食用菌后发现香菇中麦角甾醇含量最高，为2.128 mg/g，是其他食用菌的2.5～7.5倍^[7]。此外，同种食用菌，例如香菇中菌盖部位含量高于其他部位，相同部位在生长早期高于生长后期，综合多篇文献的研究结果，香菇中麦角甾醇的含量在0.4～13.34 mg/g^{[2, 6-13]}。

食用菌中麦角甾醇的主要提取方法包括皂化回流提取、超声辅助溶剂提取、微波辅助溶剂提取、加压溶剂萃取、超临界流体CO₂萃取等^[4]。其中，超声辅助溶剂提取与传统的皂化回流提取相比，提取率有较大提升，能有效减少提取时间、节约提取溶剂。

食用菌中麦角甾醇的检测方法主要是液相色谱法^[13]和液相色谱-质谱联用法^[14]。其中，液相色谱-质谱联用法灵敏度高、准确性好，但由于食用菌中麦角甾醇的含量通常较高，采用液相色谱-质谱联用法需要进行高倍数的稀释以匹配液相色谱-质谱联用仪的检测浓度线性范围。因此，更多的研究人员选择采用液相色谱法进行检测分析。采用液相色谱法对麦角甾醇进行检测，可用的检测器包括紫外检测器和蒸发光散射检测器，其中紫外检测器较蒸发光散射检测法具有更高的灵敏度。

本研究拟建立适用于新鲜食用菌、干制食用菌及食用菌罐头、菌菇酱等食用菌制品中麦角甾醇测定的便捷、准确且易于批量操作的分析方法，为我国食用菌及食用菌制品的品质保障、成分确证和真假识别提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与参数

安捷伦1260型液相色谱仪（Agilent，美国），配有紫外检测器；MS型分析天平（Mettler Toledo，中国）；LW20型振荡水浴锅（Labtech，中国）；5510E-DTH型超声仪（Bransonic，美国）。

1.2 药品、试剂及样品

麦角甾醇标准物质的纯度≥98%，为有证标准物质。甲醇、氯仿为色谱纯试剂（LiChrosolv，Merck，德国）；盐酸、氢氧化钾为分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）。

食用菌及其制品样品共24种，包括干香菇、干银耳、干茶树菇、干羊肚菌、干虫草花、干黑木耳、干白玉菇、干竹荪、鲜平菇、鲜双孢菇、鲜黑木耳、鲜香菇、鲜虫草花、鲜海鲜菇、鲜蟹味菇、鲜白玉菇、鲜鹿茸菇、鲜杏鲍菇、鲜金针菇、鲜银耳、鲜竹荪、香菇切片罐头和2种香菇酱。样品采购自当地市场和网络平台。对于鲜食用菌、食用菌罐头、食用菌酱，取样品约500 g（罐头样品根据GB/T 10786—2022《罐头食品的检验方法》计算固形物含量并在计算样品的麦角甾醇含量时折算固形物含量数值），组织捣碎机捣碎后备用；对于干制食用菌，取样品约500 g，组织捣碎机捣碎后过80目筛备用。

1.3 标准溶液配制

称取麦角甾醇标准品（精确至0.1 mg），先加入约3 mL的氯仿溶解固体标准品，后加入甲醇，将其配制成浓度为1.00 mg/mL的标准溶液，氯仿∶甲醇= 3∶7（v/v），-18°C下避光保存。在实验过程中，精确吸取适量标准溶液，用甲醇溶液逐级稀释至所需浓度作为工作曲线溶液使用。

1.4 样品前处理

对于鲜食用菌、食用菌罐头、食用菌酱，称取2.0 g试样（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入1.25 mL 12 mol/L KOH溶液和20 mL甲醇，涡旋混匀后于振荡水浴锅中（80±2）℃下皂化30 min，皂化后立即用冷水冷却至室温，超声提取2 h，加入1.25 mL盐酸，用甲醇定容至25 mL，取上清液过0.22 μm滤膜供液相色谱仪测定。

对于干制食用菌，称取0.5 g试样（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入1.25 mL 12 mol/L KOH溶液和20 mL甲醇，涡旋混匀后于振荡水浴锅中（80±2）℃下皂化30 min，皂化后立即用冷水冷却至室温，超声提取2 h，加入1.25 mL盐酸，用甲醇定容至25 mL，取上清液过0.22 μm滤膜供液相色谱仪测定。

实验中所有样品均设置3个平行组。

1.5 色谱检测条件

ZORBAX Eclipse XDB C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 μL；流动相为甲醇；紫外检测波长282 nm；检测时间15 min。

2 结果与讨论

2.1 液相检测条件的选择

2.1.1 紫外检测条件的选择

对麦角甾醇标准溶液的紫外吸收光谱进行考察，结果表明，其在271 nm、282 nm和293 nm处有较显著的吸收峰，其中282 nm处最强，因此紫外检测条件选择282 nm。

2.1.2 液相分离条件的选择

液相色谱分离条件的优化参考文献^[7,11-13]进行。文献中通常采用高于90%（v/v）的甲醇-水溶液作为流动相。本研究尝试了90%（v/v）、92%（v/v）、95%（v/v）、98%（v/v）和100%（v/v）甲醇作为流动相，以干香菇提取液作为模拟样品，以90%（v/v）、92%（v/v）、95%（v/v）、98%（v/v）和100%（v/v）甲醇作为流动相，麦角甾醇的保留时间分别为27.7 min、27.3 min、17.1 min、14.3  min和11.1 min，其中100%（v/v）甲醇作为流动相在保证峰型较好的同时能有效缩短检测时间，最终选择100%（v/v）甲醇作为流动相。

其他液相色谱条件如下：C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 μL，检测时间15 min。

2.2 提取条件的选择

文献^{[2,4,7,12-14]}中一般采用甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷等有机溶剂超声辅助提取食用菌中的麦角甾醇后直接采用液相色谱仪进行检测，在提取过程中既有进行样品皂化的，也有不进行皂化直接提取的路线，因此本研究首先考察了皂化过程对食用菌中麦角甾醇的提取效果的影响，随后优化了超声提取溶剂、提取溶剂体积、超声提取时间等提取条件。

方法优化采用干香菇样品和鲜香菇样品作为模拟样品，其中干香菇样品经粉碎后过80目筛，鲜香菇样品用组织捣碎机匀浆，干香菇样品每份0.5 g，鲜香菇样品每份2.0 g。

2.2.1 样品皂化过程对提取效果的影响

样品皂化的目的是将部分结合成酯的麦角甾醇解离出来，同时热的碱溶液还有助于破碎细胞，加速目标产物的溶出。一般皂化剂会选择NaOH或KOH，在预试验中发现KOH效果更好，所以在本研究中选用KOH作为皂化剂。此外，由于麦角甾醇是维生素D₂的前体，与其性质接近，因此麦角甾醇提取皂化条件也参考了GB 5009.296—2023《食品安全国家标准 食品中维生素D的测定》，即在恒温振荡器中皂化，温度（80±2）℃，时间30  min，皂化后立即用冷水冷却至室温。

采用干香菇为模拟样品，20 mL甲醇为提取溶剂，比较了皂化（0.6 mol/L KOH，80℃皂化30 min）和不皂化条件下干香菇样品中麦角甾醇的提取情况，结果如图1所示。由图1中结果可知，样品皂化后麦角甾醇的提取效率有明显的提升，因此选择先进行样品皂化再进行超声提取的方式提取食用菌中麦角甾醇。

图1 皂化和不皂化条件下干香菇中麦角甾醇的提取效果

Fig.1 Extraction efficiency of ergosterol from dried shiitake mushrooms under saponification and non-saponification

conditions

2.2.2 提取溶剂的选择

在麦角甾醇的皂化提取过程中，一般要加入低级醇作为提取溶剂，这是因为脂溶性的麦角甾醇在碱性水溶液中的溶解度较低，如果在皂化反应体系中不加入低级醇，反应体系就会存在水相和油相2个相，造成皂化反应在两相之间的界面进行，碱液向油相的扩散速率成为制约皂化反应的主要影响因素；由于界面扩散速率较低，造成皂化反应的反应速率也随之降低。而加入低级醇就可以增加脂溶性物质在皂化液中溶解度，使油相和碱醇溶液形成均相反应体系，而提高皂化反应的反应速率。

文献报道中采用甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷等有机溶剂提取食用菌中的麦角甾醇，因此本研究比较了甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、石油醚、甲醇-二氯甲烷（v/v = 1/1）10种提取溶剂对干香菇和鲜香菇中麦角甾醇的提取效果，结果如图2所示。结果表明，对于干香菇样品，甲醇和二氯甲烷的提取效率最好，对于鲜香菇样品，甲醇的提取效果最好，因此选择甲醇作为提取溶剂。

图2 不同提取溶剂对干香菇、鲜香菇中麦角甾醇的提取效果

Fig.2 Extraction efficiency of ergosterol from dried and fresh shiitake mushrooms using different extraction solvents

2.2.3 皂化时间的考察

考察了80℃皂化30 min、40 min、50 min和60 min对干香菇、鲜香菇中麦角甾醇的提取效果的影响，发现在30～60 min皂化时间下，干香菇、鲜香菇中麦角甾醇的提取效率几乎没有变化，考虑到皂化时间的延长会大大增加甲醇的挥发，因此选择皂化时间为30 min。

2.2.4 皂化过程中KOH浓度的考察

配置了12 mol/L的KOH水溶液，通过向提取溶剂中加入不同体积的12 mol/L的KOH水溶液的方式考察了KOH浓度0.12～1.80 mol/L对皂化过程的影响，结果如图3中所示。由图3中结果可知，当KOH浓度从0.12 mol/L上升至0.24 mol/L时，麦角甾醇的提取效率有所上升并达到平台，当KOH浓度上升至0.96 mol/L时，麦角甾醇的提取效率开始下降，这应该是随着KOH浓度的上升，提取溶剂中水含量也在上升，提取溶剂的极性下降导致麦角甾醇的提取效率下降。因此，选择皂化使用的KOH浓度为0.6 mol/L。

图3 不同浓度KOH对干香菇、鲜香菇中麦角甾醇的提取效果

Fig.3 Extraction efficiency of ergosterol from dried and fresh shiitake mushrooms using different concentrations of KOH

2.2.5 提取溶剂体积的考察

考察了提取溶剂在10～40 mL之间食用菌中麦角甾醇的提取效率的变化，结果如图4所示，随着甲醇体积从10 mL增加至20 mL，食用菌中麦角甾醇的提取总量有所上升，但体积增加至20 mL后就达到了平台，因此，选择甲醇20 mL作为提取溶剂的体积。

2.2.6 超声提取时间的考察

考察了超声时间分别为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h的情况下，食用菌中麦角甾醇提取效率的变化，结果如图5中所示。结果表明，当超声时间由1 h增加至2 h时，麦角甾醇的提取效率有所上升，之后就达到了平台，因此选择超声时间2 h作为超声提取时间。

图5 超声提取时间对干香菇、鲜香菇中麦角甾醇的提取效果

Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction efficiency of ergosterol from dried and fresh shiitake mushrooms

2.3 优化后的提取条件在实际样品中的提取效果

采用本研究优化后的提取方法分别提取实际样品中的麦角甾醇3次，并比较了3次提取的结果。如图6所示，对于1.2中24个样品，第一次提取得到的麦角甾醇均能达到92%以上，这表明以上优化后的提取条件能实现实际样品中的麦角甾醇定量提取。

2.4 方法分析性能及实际样品分析

在最优的实验条件下，对方法的分析性能进行了考察。方法的检出限和定量限通过向空白实际样品（提取过麦角甾醇的鲜竹荪、干竹荪）中添加一定量的目标分析物后测定其信噪比得到，检出限为信噪比大于3时的加标浓度，定量限浓度至少满足信噪比大于10。麦角甾醇在湿样中的检出限为2.5 mg/kg，定量限为6.25 mg/kg，在干样中的检出限为10.0 mg/kg，定量限为25.0 mg/kg。标准工作液按照液相色谱条件测定，以麦角甾醇的峰面积为纵坐标，麦角甾醇浓度比为横坐标，在0.5～200 mg/L的浓度范围内绘制工作曲线，其线性关系为y = 14.61x + 4.03，r = 0.9999。

由于实际样品涵盖的干/鲜食用菌、食用菌罐头和食用菌酱制品中均含有麦角甾醇，且麦角甾醇含量差异大，因此向麦角甾醇含量较低的鲜竹荪样品中分别添加1×LOQ、2×LOQ、10×LOQ浓度水平的麦角甾醇，充分混匀，按照本方法进行测定，其回收率和相对标准偏差见表1。由结果可知，麦角甾醇的加标回收率在81.0%～106%之间，精密度为2.00%～6.60%。

此外，采用加标回收试验验证了方法的准确性。对其他干/鲜食用菌、食用菌罐头和食用菌酱制品，分别添加含量水平近0.5倍、1倍和/或2倍浓度的麦角甾醇，充分混匀，按照本方法进行测定，其回收率和相对标准偏差见表2。由结果可知，麦角甾醇的加标回收率在80.1%～120%之间，精密度为2.31%～13.3%，表明本方法准确性良好。

3 结论

本研究针对新鲜食用菌、干制食用菌、食用菌罐头和菌菇酱中的麦角甾醇，建立了一种基于液相色谱法的检测新方法，通过对皂化条件、提取溶剂、提取液体积、提取时间等条件的优化，确定了最优的麦角甾醇提取条件，对于所考察的24种实际样品能够实现92%以上的麦角甾醇提取效率。所建立的方法在湿样中麦角甾醇的检出限为2.5 mg/kg，定量限为6.25 mg/kg，在干样中麦角甾醇的检出限为10.0 mg/kg，定量限为25.0 mg/kg，线性范围为0.5～200 mg/L。采用所建立的方法对24种实际样品食用菌及食用菌制品进行了检测，并采用加标回收试验验证了方法的准确性，回收率在80.1%～120%之间，精密度为2.31%～13.3%。该方法具有良好的准确性，适用于食用菌及食用菌制品中麦角甾醇的精准、大批量筛查分析检测。

参考文献

[1] 丁唯嘉, 陈洁怡, 王锦华, 等. 2 株红树内生真菌共培养产生的甾醇类化合物的分离鉴定[J]. 华南农业大学学报, 2013, 34(2): 267-271.

[2] 杨皓瑜, 程艳芬, 王胜男, 等. 香菇中麦角甾醇提取、表征及抗氧化、降胆固醇特性[J]. 食用菌学报, 2023, 30(2): 75-84.

[3] 高虹, 史德芳, 杨德, 等. 巴西菇麦角甾醇抗肿瘤活性及作用机理初探[J]. 中国食用菌, 2011, 30(6): 35-39.

[4] 程洋洋, 惠靖茹, 郝竞霄, 等. 食用菌中麦角甾醇的研究进展[J]. 食品工业科技, 2021, 42(10): 349-354.

[5] 颜延宁, 周璐, 朱杰. 贮藏条件对食用菌中麦角甾醇含量的影响[J]. 食用菌, 2015, 37(2): 60-61.

[6] 于士军, 何玲艳, 张莹, 等. 六种食用菌营养和功能成分的主成分分析和聚类分析[J]. 阜阳师范学院学报(自然科学版), 2018, 35(1): 37-42.

[7] 俞明君, 聂远洋, 杨伟, 等. HPLC法测定食用菌中的麦角甾醇含量[J]. 河南科技学院学报 (自然科学版), 2019, 47(5): 18-21.

[8] Barreira J C M, Oliveira M B P P, Ferreira I C F R. Development of a novel methodology for the analysis of ergosterol in mushrooms[J]. Food Analytical Methods, 2014, 7(1): 217-223.

[9] Villares A, Mateo-Vivaracho L, García-Lafuente A, et al. Storage temperature and UV-irradiation influence on the ergosterol content in edible mushrooms[J]. Food Chemistry, 2014, 147: 252-256.

[10] Hammann S, Lehnert K, Vetter W. Esterified sterols and their contribution to the total sterols in edible mushrooms[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2016, 54: 48-54.

[11] 樊晓飞. 食药用菌中麦角甾醇的免疫活性及其VD转化[D]. 长春: 吉林农业大学, 2013.

[12] 郭华, 刁全平, 欧阳美璇, 等. 高效液相色谱法测定蘑菇中麦角甾醇的含量[J]. 鞍山师范学院学报, 2017, 19(4): 38-40.

[13] 鄂恒超, 彭书婷, 赵志勇, 等. 超高效液相色谱法测定食用菌及其制品中麦角甾醇[J]. 农产品质量与安全, 2024(2): 18-24.

[14] 曹燕妮, 华蓉, 游金坤, 等. 超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定松茸中麦角甾醇含量[J]. 中国食用菌, 2023, 42(6): 69-73.

图4 不同溶剂提取体积对干香菇、鲜香菇中

麦角甾醇的提取效果

Fig.4 Extraction efficiency of ergosterol from dried and fresh shiitake mushrooms using different volumes of extraction

solvents

图6 实际样品中3次重复提取麦角甾醇的含量结果（n = 3）

Fig.6 Results of triplicate extraction of ergosterol

in real samples ( n = 3)

表1 麦角甾醇在鲜竹荪样品中不同添加水平的回收率

Table 1 Recoveries of ergosterol with different addition levels in fresh bamboo fungus samples

表2 麦角甾醇在不同样品中不同添加水平的回收率

Table 2 Recoveries of ergosterol with different addition levels in different real samples

表2（续）