别玮 闫章怡 王珮玥 杨爱岗 刘明富 冯鑫 张蓉 王金花

别 玮 ¹ 闫章怡 ² 王珮玥 ¹ 杨爱岗 ³ 刘明富 ⁴ 冯 鑫 ¹ 张 蓉 ¹ 王金花 ^{1 *}

摘 要 本文介绍了一种面膜类化妆品中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯基体标准物质的制备过程。在按配方制备好的阴性面膜化妆品基体中加入曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯标准品，经混匀后分装，得到面膜类化妆品中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯基体标准物质待定值样品。采用液相色谱-串联质谱法测定面膜液中上述3种糖皮质激素的含量，并对样品进行均匀性检验、稳定性检验、定值和不确定度分析。经8家有资质的实验室联合定值，面膜类化妆品中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯基体标准物质的标准值分别为1.92 μg/g、1.84 μg/g、1.72 μg/g，扩展不确定度分别为0.140 μg/g（k = 2）、0.127 μg/g（k = 2）、0.092 μg/g（k = 2）。该标准物质满足基体标准物质要求，可用于面膜类化妆品中糖皮质激素曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯检测的质量控制。

关键词 基体标准物质；糖皮质激素；曲安奈德醋酸酯；氯倍他索丙酸酯；倍他米松戊酸酯；面膜类化妆品

Preparation of Three Glucocorticoid Matrix Reference Materials for Facial Mask Cosmetics

BIE Wei¹ YAN Zhang-Yi² WANG Pei-Yue¹ YANG Ai-Gang³

LIU Ming-Fu⁴ FENG Xin¹ ZHANG Rong¹ WANG Jin-Hua^1*

Abstract This study presents the preparation process of matrix standard materials for triamcinolone acetonide, clobetasol propionate, and betamethasone 17-valerate in facial mask cosmetics. These glucocorticoids were added to a negatively prepared cosmetic matrix of facial mask, followed by mixing and aliquoting to obtain the matrix standard material samples for the three glucocorticoids. The contents of these three glucocorticoids in the facial mask solution were determined using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), and the samples were subjected to homogeneity testing, stability testing, value assignment, and uncertainty analysis. The matrix standard materials for triamcinolone acetonide, clobetasol propionate, and betamethasone 17-valerate in facial mask cosmetics were collaboratively valued by eight accredited laboratories. The assigned values were 1.92 μg/g, 1.84 μg/g, and 1.72 μg/g, respectively, with expanded uncertainties of 0.140 μg/g (k = 2), 0.127 μg/g (k = 2), and 0.092 μg/g (k = 2). These standard materials meet the requirements for matrix standard materials and can be used for quality control in the detection of triamcinolone acetonide, clobetasol propionate, and betamethasone 17-valerate in facial mask cosmetics.

Keywords matrix standard material; glucocorticoids; triamcinolone acetonide; clobetasol propionate; betamethasone 17-valerate; facial mask cosmetics

基金项目：海关总署科研项目（2022HK133）

第一作者：别玮（1983—），女，汉族，北京人，硕士，高级工程师，主要从事进出口化妆品检验工作，E-mail: 157052161@qq.com

通信作者：王金花（1968—），女，汉族，新疆奎屯人，博士，研究员，主要从事进出口食品检验工作，E-mail: wangjh2008@aliyun.com

1. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

2. 首都医科大学 北京 100069

3. 上海松皓生物科技有限公司 上海 201318

4. 广州诗美化妆品有限公司 广州 510920

1. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

2. Capital Medical University, Beijing 100069

3. Shanghai Songhao Biotechnology Co. Ltd., Shanghai 201318

4. Guangzhou Shimei Cosmetics Co. Ltd., Guangzhou 510920

糖皮质激素具有抗炎和免疫抑制作用，在临床上被广泛用于治疗炎性疾病。由于此类激素可减少5-羟色胺的形成，在皮肤上短期涂抹会有嫩白皮肤的效果，但长期外用会使皮肤变薄、毛囊萎缩，甚至出现皮肤发红发痒等激素依赖性皮炎症状^[1-2]。我国现行《化妆品安全技术规范（2015年版）》^[3]及欧洲议会和欧盟理事会关于化妆品的第1223/2009号法规^[4]等明确规定禁止在化妆品中添加糖皮质激素。目前，我国检测化妆品中糖皮质激素的标准有《化妆品安全技术规范（2015年版）》和GB/T 24800.2—2009《化妆品中四十一种糖皮质激素的测定 液相色谱/串联质谱法和薄层层析法》等^[5]，均采用外标法进行定量分析，检测结果容易受人员操作、实验条件等因素影响，且由于化妆品成分异常复杂，样品前处理时基质干扰较大、待测组分的变化又没有相应补偿，从而容易导致实验结果产生较大误差。因此，为避免化妆品基质效应影响检测，有必要在实验中引入相关基体标准物质来满足实验检测过程中的质量控制要求^[6-7]。

本文针对面膜类化妆品中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯基体标准物质开展研究，可为化妆品中特别是面膜类产品中糖皮质激素的检测提供质量控制的参考依据，对化妆品中其他违禁添加物基体标准样品的研制流程也有一定借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈（色谱纯）（美国赛默飞世尔科技有限公司）；曲安奈德醋酸酯标准品（纯度（质量分数）为98.47%，LGC公司）；氯倍他索丙酸酯标准品（纯度（质量分数）为98.88%，LGC公司）；倍他米松戊酸酯标准品（纯度（质量分数）为99.70%，LGC公司）。

空白面膜液制备原料：甘油（化妆品级）、1,3-丙二醇（化妆品级）、甜菜碱（化妆品级）、卡波姆钠（化妆品级）、氢化卵磷脂（化妆品级）、羟乙基纤维素（化妆品级）、透明质酸钠（化妆品级）、丁二醇（化妆品级）、对羟基苯乙酮（化妆品级）、1,2-己二醇（化妆品级）、突厥蔷薇（Rosa Damascena）花水（化妆品级）。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱-串联质谱仪（美国安捷伦公司）；超纯水系统（密理博（中国）有限公司）；电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；数显式往复式摇床（德国艾卡集团）。

空白面膜液制备设备：分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（杭州米欧仪器有限公司）；数显型分散机（德国艾卡集团）。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

依据面膜生产厂家常用原料组分，按照表1的配方制备空白面膜液化妆品基体，具体制备步骤为：（1）在不锈钢锅中加入一定量的水、甘油、丙二醇、甜菜碱、卡波姆钠、氢化卵磷脂、羟乙基纤维素和透明质酸钠进行预先分散，用电磁炉加热到85℃，搅拌溶解完全，保温20 min；（2）降温至60℃，用烧杯分别称取一定量的丁二醇、对羟基苯乙酮和1,2-己二醇，预先溶解后加入不锈钢锅中，搅拌至完全溶解；（3）降温至45℃，在搅拌的同时加入突厥蔷薇花水，并搅拌溶解完全；（4）降温至38℃以下，用均质机均质15 min，为避免引入气泡，均质速度控制在700 r/min左右；（5）均质后，在制备好的面膜液化妆品基体中添加一定量的曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯标准品，充分混合均匀后，再进行分装（10 g/瓶），于透明塑料瓶密闭储存，共计500瓶。

表1 面膜液化妆品基体的配方表

Table 1 Formula table for facial mask liquid cosmetic matrix

1.3.2 样品预处理

称取样品0.2 g（精确到0.001 g），置于10 mL具塞比色管中，加入少量乙腈，在涡旋混合仪上振荡30 s至试样与提取溶剂混合均匀，然后加入乙腈至近刻度，超声提取20 min，静置至室温，用乙腈定容至刻度，摇匀，以4000 r/min离心10 min，经0.22 μm滤膜过滤，滤液作为样品溶液。

1.3.3 标准溶液配制

标准储备溶液：称取曲安奈德醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯标准品各约10 mg（精确到0.00001 g）置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，作为标准储备液。置-20℃保存。

混合标准工作溶液：取适量曲安奈德醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯标准储备溶液，用50%乙腈溶液稀释成质量浓度分别为2 ng/mL、4 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、60 ng/mL，现用现配。

1.4 仪器检测条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：BEH C₁₈色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，沃特世公司）；流动相：乙腈-水（体积比为85∶15）；流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；进样量：10 μL。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI源）；监测模式：正离子、负离子多离子反应监测模式，监测离子对及相关参数设定见表2。

表2 3种激素类成分监测离子对及相关参数设定表

Table 2 Ion pairs and related parameter settings for monitoring three hormone components

注: “*”表示定量离子对.

1.5 样品测定

在1.4仪器检测条件下，取曲安奈德醋酸酯、倍他米松戊酸酯和氯倍他索丙酸酯系列标准工作溶液分别进样，以标准工作溶液质量浓度为横坐标，记录定量离子对色谱峰面积并绘制峰面积-浓度的标准曲线，其线性相关系数r≥0.99。取待测样品溶液进样，测得定量离子色谱峰面积，利用标准曲线法得到样品溶液中曲安奈德醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯的质量。

1.6 样品均匀性和稳定性考察

依据CNAS-GL017：2018《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》^[8]、JJF 1343—2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》^[9]、GB/T 15000.3—2023《标准样品工作导则 第3部分：标准样品 定值和均匀性与稳定性评估》^[10]中关于均匀性、稳定性检验的要求进行统计分析。

1.6.1 均匀性检验

参照JJF 1343—2022和GB/T 15000.3—2023中均匀性检验对抽取单元数量和重复测定次数的要求，随机抽取15个独立包装，每个包装在重复性实验条件下测定3次，进行均匀性检验。采用单因素方差分析的F检验进行统计分析。

1.6.2 短期稳定性检验

模拟在极端运输条件40℃、湿度80%下，以均匀性检验测定结果的平均值为初始值（0天测定值），分别在第1天、第3天、第7天取样，每次取2个独立包装，每个样品测定3次，采用t检验法评价样品的短期稳定性。

1.6.3 长期稳定性检验

在4℃避光干燥的保存条件下，按照先密后疏原则，以均匀性检验测定结果的平均值为初始值（0月测定值），分别在第1个月、第2个月、第4个月、第6个月取样，每次取2个独立包装，每个样品测定3次，采用t检验法评价样品的长期稳定性。

1.7 定值方法及不确定度评定

标准物质定值参照 JJF 1343—2022和GB/T 15000.3—2023，采用一种方法多家实验室联合定值的方式，选择7家具备检验资质的机构，连同本实验室，共计8家，使用相同方法对面膜液中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯含量进行测定。向另外7家实验室分别发放2个独立包装的样品，每个样品重复测定3次，对回收数据使用格拉布斯（Grubbs）检验剔除组内离群值，使用狄克逊（Dixon）法检测各组数据的中位值是否有显著性差异。最终，使用各实验室检测结果中位值作为样品定值结果。

参照GB/T 15000.3—2023对均匀性、稳定性和指定值带来的不确定度进行定量，并将各来源不确定度进行合成及扩展，得到面膜液中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯含量的扩展不确定度。

2 结果与分析

2.1 面膜液化妆品基体的质量监控

面膜液基体对要制备的基体标准物质的均匀性、稳定性有一定的影响，基体质量监控至关重要。所有的配方成分及制备的化妆品基体均进行了测定，甘油、丙二醇、甜菜碱、卡波姆钠、氢化卵磷脂、羟乙基纤维素、透明质酸钠、丁二醇、对羟基苯乙酮、1,2-己二醇和突厥蔷薇花水分别按照1.3.2进行前处理，按1.4的仪器检测条件进行测定，经分析所有样品中均不含有目标添加物及影响添加物的干扰物。

2.2 目标添加物的质量控制

为确保制备的基体标准物质特性量值准确，用质谱法（Mass Spectrometry，MS）和紫外光谱吸收法（Ultraviolet and Visible Spectrometry，UV）对化合物作定性鉴定，确保添加的化合物结构准确、可靠。

2.2.1 定性分析

对购买的标准品曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯的结构进行确认，采用高效液相色谱仪串联质谱仪（High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）按照1.4的仪器检测条件进行检测，结果如图1所示，相关离子信息与表2中目标物的信息一致。

同时，对曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯用高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）进行分析，分析结果如图2所示，表明3种标准品的紫外吸收与目标物一致。

2.3 定值用标准品的质量控制

为确保制备的基体标准物质特性量值准确，参照JJF 1855—2020，首先应对定值用标准品用MS、UV对化合物做定性鉴定，确保添加的化合物结构准确、可靠。其次，采用两种不同原理的检测方法对标准物质的纯度进行测定。

因购买的标准品属于有证标准物质（Certificate Reference Material，CRM），曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯标准品随附的标准物质证书上标明上述3种标准物质已经过元素、质谱、红外光谱、紫外光谱分析及核磁定量，故只进行符合性检验。

2.3.1 定性鉴定

对购买的LGC标准品曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯的结构进行确认，采用高效液相色谱仪串联质谱仪（HPLC-MS/MS）按照1.4的仪器检测条件进行检测，过程和结果同2.2.1。

2.3.2 定值分析

采用定量核磁共振波谱法（Quantitative Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，qNMR）测定定值用标准品曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松戊酸酯的纯度，定量谱图如图3所示，结果见表3。纯度测得值与标准品证书标示浓度接近，故这3种标准品可以用来作为标准样品的定值依据。

表3 3种糖皮质激素标准品的纯度

Table 3 Purity of three corticosteroid standards

2.4 均匀性检验结果

按照1.6.1方法，从500个样品中随机抽取15个进行均匀性检验，面膜液中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯含量测定结果列于表4。采用单因素方差分析进行计算，面膜液中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯标准物质的F计算值分别为0.116、0.0090和2.133，对应的p值为0.891、0.991和0.131，p值结果均大于显著性水平α = 0.05，因此考虑结果无显著性差异，组内和组间无明显差异，面膜液中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯标准物质的均匀性良好。

2.5 稳定性检验结果

2.5.1 短期稳定性

标准物质短期稳定性的考察主要是模拟在运输过程中高温、高湿条件对面膜液中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯含量的影响。因此，将分装好的样品置于温度40℃、湿度80%的恒温恒湿箱中，考察其在7 d天内的稳定性，按照1.6.2方法考察短期稳定性，面膜液基体中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯含量测定结果见表5。

由表5可知，均匀性检测结果平均值作为短期稳定性0天的测定值，与第1天、第3天、第7天的测定结果以时间-测定值做线性拟合，置信水平为95%时，检验结果3组数据t值绝对值均小于t临界值（4.30），且曲安奈德醋酸酯p = 0.420＞0.05，氯倍他索丙酸酯p = 0.390＞0.05，倍他米松戊酸酯标准物质p = 0.996＞0.05，表明在温度40℃、湿度80%条件下，面膜液中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯标准物质在7 d内稳定。

2.5.2 长期稳定性

标准物质的长期稳定性主要考察指定储存条件下，标准物质保持特性值在一定限度内的特性。按照1.6.3方法，考察面膜液中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯标准物质在4℃避光干燥的保存条件下，6个月内的稳定性，结果见表6。

由表6可知，均匀性检测结果平均值作为长期稳定性0月的测定值，与第1个月、第2个月、第4个月、第6个月的测定结果以时间-测定值做线性拟合，置信水平为95%时，检验结果3组数据t值绝对值均小于t临界值（3.182），且曲安奈德醋酸酯p = 0.535＞0.05，氯倍他索丙酸酯p = 0.319＞0.05，倍他米松戊酸酯标准物质p = 0.320＞0.05，说明在4℃避光干燥的保存条件下，6个月内面膜液中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯标准物质长期稳定性良好。

2.6 协作定值结果及离群值检验

本标准物质采用多家协同定值的方式，由7家业内具备资质的检验机构（机构A、B、C、D、E、F和G）和样品制备方（机构H）共8家单位协作定值，分别向其他7家机构提供2个样品，每个样品重复测定3次。7家机构对面膜液中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯的质量分数测定结果见表7，制备方以均匀性检验结果参与定值，测定结果见表4。

对8家实验室的测定数据进行筛选，利用格拉布斯（Grubbs）检验剔除组内可疑值，每组数据G值均小于临界值1.822，无异常值剔除；采用狄克逊（Dixon）法检测各组数据的中位值是否有显著性差异，各组中位数值经狄克逊检验，Qmin、Qmax均小于Q临界值0.568，表明各组组间中位值无显著性差异。通过上述分析计算，可保留所有数据，样品定值结果为各实验室检测结果的中位值，见表8。

2.7 定值不确定度的计算

对于标准物质来说，其定值结果的不确定度由3个部分组成，分别为标准物质的均匀性引起的不确定度、标准物质的稳定性引起的不确定度以及标准物质的定值过程带来的不确定度。在置信水平为95%，k = 2时，得到面膜液中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯基体标准物质最终结果，不确定度表达采取只进不舍的原则进行修约，不确定度计算结果见表9、表10、表11。

2.8 定值不确定度的确定

经过均匀性检验、短期和长期稳定性检验以及8家实验室协作定值，最终确定面膜类化妆品中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯含量指定值分别为（1.92±0.140）μg/g（k = 2）、（1.84±0.127）μg/g（k = 2）、（1.72±0.0.092）μg/g（k = 2）。

3 结论

本研究研制了面膜类化妆品中曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯的基体标准物质，该标准物质均匀性、短期和长期稳定性良好，通过8家实验室定值，并对结果进行不确定度评估，最终得到曲安奈德醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松戊酸酯的标准值1.92 μg/g、1.84 μg/g、1.72 μg/g，扩展不确定度分别为0.140 μg/g （k = 2）、0.127 μg/g（k = 2）、0.092 μg/g（k = 2）。所获标准物质符合基体标准物质的要求，可作为实验室质控品准确、可靠地检测化妆品中此类糖皮质激素类化合物的含量，以及促进化妆品检测结果互认，进而为我国化妆品行业的产品质量把关提供技术支撑。

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图1 3种糖皮质激素标准物质提取离子质谱图

Fig.1 Ion mass spectrometry of three corticosteroid standard materials extraction

A: 曲安奈德醋酸酯紫外吸收谱图; B: 氯倍他索丙酸酯紫外吸收谱图; C: 倍他米松戊酸酯紫外吸收谱图

图2 3种糖皮质激素标准品的紫外吸收谱图

Fig.2 UV absorption spectra of three standard glucocorticoids

A: 曲安奈德醋酸酯定量核磁共振谱图; B: 氯倍他索丙酸酯定量核磁共振谱图; C: 倍他米松戊酸酯定量核磁共振谱图

图3 3种糖皮质激素标准品的定量核磁共振谱图

Fig.3 Quantitative nuclear magnetic resonance spectra of three standard glucocorticoids

表4 面膜液基体标准样品均匀性分析的测试数据

Table 4 Homogeneity analysis test data for facial mask liquid matrix standard samples

表5 面膜液基体标准短期稳定性的测试数据（ μg/g）

Table 5 Long-term stability test data for facial mask liquid matrix standard ( μg/g)

表6 面膜液基体标准长期稳定性的测试数据（ μg/g）

Table 6 Short-term stability test data for facial mask liquid matrix standard ( μg/g)

表7 面膜液基体标准协作定值结果（ μg/g）

Table 7 Collaborative value assignment results for facial mask liquid matrix standard ( μg/g)

表7（续）

表8 面膜液基体标准定值结果（ μg/g）

Table 8 Value assignment results of facial mask liquid matrix standard ( μg/g)

表9 曲安奈德醋酸酯不确定度计算结果

Table 9 Uncertainty calculation results of triamcinolone acetonide

表10 氯倍他索丙酸酯不确定度计算结果

Table 10 Uncertainty calculation results of clobetasol propionate

表11 倍他米松戊酸酯不确定度计算结果

Table 11 Uncertainty calculation results of betamethasone 17a-valerate