张娟 徐颖 张涛 于滢泉 杜建森 张瑾 徐翮飞

摘 要 重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）相对于传统的聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）而言，在37～42°C条件下，可在20～30 min内快速完成扩增，操作简单，设备费用低，是一种新型的核酸恒温扩增方法。本文对比了不同核酸扩增技术，概述了RPA技术的原理及其在细菌、病毒检测中的最新应用，为RPA技术的推广提供参考依据。

关键词 重组酶聚合酶扩增技术；疾病检测；研究进展

Research Progress in Recombinase Polymerase Amplification Technology for Pathogen Detection

ZHANG Juan¹ XU Ying¹ ZHANG Tao¹ YU Ying-Quan¹

DU Jian-Sen¹ ZHANG Jin¹ XU He-Fei^1*

Abstract Recombinase Polymerase Amplification (RPA) is a novel isothermal nucleic acid amplification method that can rapidly complete amplification within 20-30 minutes at 37-42°C. Compared with traditional Polymerase Chain Reaction (PCR), RPA offers simplicity in operation and lower equipment costs. This article compares different nucleic acid amplification technologies, summarizes the principle of RPA technology and its latest applications in the detection of bacteria and viruses, aiming to provide a reference basis for the promotion of RPA technology.

Keywords recombinant polymerase amplification (RPA); disease detection; research progress

近年来，核酸扩增技术在分子诊断学方面的研究已有显著成效。其中，重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）因操作简便、检测快速、高灵敏度和高特异性，且无需昂贵仪器，得到广泛关注。本文就核酸扩增技术的现状、RPA技术的原理、引物探针设计、产物分析方法及其应用于细菌和病毒检测等方面的问题进行了深入探讨。

1 核酸扩增技术的现状

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种特殊的DNA复制技术，被广泛用于特定DNA片段的扩增。然而，PCR流程需经历包括90～95℃变性、55～60℃退火、70～75℃延伸等步骤，这些都需要依靠控温设备来完成且耗时较长，限制了其推广。随着研究的深入，等温核酸扩增技术应运而生并快速发展，有望成为PCR技术的替代方案。等温核酸扩增技术包括核酸依赖性扩增检测（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）、环介导等温核酸扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）、链替代扩增（Strand Displacement Amplification，SDA）、滚环式等温扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）、多重链置换扩增（Multiple Displacement Amplification，MDA）及RPA等，各方法的比较见表1。

NASBA技术可以直接对RNA进行扩增分析，而扩增DNA之前需要先对样本进行高温变性，因此无法做到DNA的一步扩增，再加上扩增所需的酶热稳定性较差，导致扩增片段较短。LAMP技术因需设计多对特异性引物且流程繁琐，容易造成假阳性，同时该技术的扩增效率虽高，但通常仅适用于较短的核酸片段‌。SDA技术对脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside Triphosphate，dNTP）的要求较高，必须使用经过硫基修饰的核苷酸，这大大提高了反应成本，同时也不能实现长片段的扩增，使用范围受到限制。RCA技术对模板要求严格，仅适用于单链环状DNA样本‌，若待测样本不符合该结构，需额外进行退火和环化等预处理‌，其扩增反应耗时较长，在快速检测场景中应用受限。MDA技术反应时间也比较长，不适合用于快速检测。

2006年，Piepenburg等^[1]报道了RPA这种新兴的恒温扩增技术，后由英国公司TwistDx Inc研发推广。RPA技术在25～45℃恒温条件下，在30 min内可以达到指数式的增长，快速完成核酸扩增。其扩增得到的产物既可以通过探针法荧光定量进行实时检测，也可以与横向流层析试纸条、凝胶电泳、生物芯片等多种方法相结合进行检测。检测过程无需昂贵的仪器设备，这使得RPA技术在资源有限的环境中也能得到有效应用。RPA的基础反应体系与其他技术结合，能衍生出多功能多用途的核酸检测技术，不仅能真正实现便携式快速核酸检测，还能在公共卫生领域、临床诊断领域和疫情监测领域，完成对不同病原菌在常温下的核酸检测，显示出广阔的应用前景。

2 重组酶聚合酶等温扩增技术的原理

RPA技术是在T4噬菌体编码的重组酶蛋白（UvsX和UvsY）、单链结合蛋白（gp32）、Bsu DNA聚合酶的作用下，在体外完成DNA扩增的过程，依靠寡核苷酸、Mg²⁺，基于T4噬菌体核酸的复制机制。在目的DNA片段的扩增过程中，首先UvsX重组酶与引物结合形成复合物。该复合物在模板上定位后可以直接引发链交换反应，形成D状环，从而将氢键打开，实现模板链分离。同时，单链结合蛋白（Single-Stranded DNA-Binding Protein，SSB）与单链DNA链结合，阻止形成双链。之后，Bsu DNA聚合酶从发生链交换反应的位置开始复制DNA。同时，反应体系中含有UvsY酶，能与UvsX结合并促进UvsX与单链DNA更加紧密地结合，提高链交换反应的效率。这一过程循环往复，目的DNA片段的扩增最终完成。

3 RPA引物和探针设计原则

3.1 RPA引物设计原则

RPA引物设计与PCR引物设计有一定的相似性，但存在差异。RPA引物设计需要考虑引物长度、引物序列组成和引物选择标准3个关键参数。首先，RPA引物的长度明显长于PCR引物，建议上下游引物的长度选择在30～35 bp之间。这一要求是基于UvsX 重组酶蛋白将寡核苷酸嵌入双链 DNA 所需的最小物理尺寸，因为过短可能导致特异性不足，而过长则可能降低扩增效率。在扩增过程中，RPA的产物长度通常以100～300 bp为宜。引物的选择标准方面要注意以下问题：5'端起始的3～5个碱基避免出现重复G，最好为C或T；3'端后3个碱基最好有G和C；GC含量不要大于60%或小于30%；避免引物间形成二级结构、引物二聚体等。为验证引物的有效性，可通过实验筛选几个寡核苷酸来验证，挑选最佳的引物。

3.2 RPA荧光探针设计原则

探针长度一般在46～52 bp之间；四氢呋喃（Tetrahydrofuran，THF）位点一般设在探针的中间位置，从5'端到THF位点间至少要间隔30个碱基，从THF位点到3'端间至少要间隔15个碱基，THF修饰位点需与荧光基团或淬灭基团相邻；探针序列应避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；5'端通常标有抗原标记物，如FAM基团或羧基荧光素，3'端需加上阻断基团，如C3-spacer、磷酸基或双脱氧核苷酸。遵循上述设计原则，可以有效提高RPA反应的特异性及灵敏度，从而提升核酸检测的准确性和可靠性。

4 扩增产物的检测方式

4.1 琼脂糖凝胶电泳

最初的RPA扩增产物采用的是凝胶电泳检测，该方法具有较强的灵敏度，且操作简单，但是会增加检测时间。为避免产生抹带现象，在利用凝胶电泳分析之前，需要对扩增产物进行纯化。尽管存在这些不足之处，结合凝胶电泳分析RPA扩增产物的研究依然广泛。

4.2 实时荧光探针检测

实时荧光探针检测是RPA扩增产物分析的另一种重要方法，荧光报告基团（如FAM）与淬灭基团（如BHQ-1）通过共价方式连接在一起，通过荧光共振能量转移效应来抑制初始荧光。RPA扩增时，探针特异性结合靶序列，核酸内切酶切割探针，引起荧光基团分离从而释放信号。其特点是高灵敏度，可实时监测荧光强度，实现靶标核酸的定量分析，支持多通道检测，局限性在于‌依赖专用设备，野外场景适用性受限。Euler等^[2]在2012年首次系统开发RPA技术用于‌生物威胁剂检测‌，涵盖炭疽杆菌、鼠疫杆菌等6种高危病原体，灵敏度达到10拷贝/反应，特异性＞99%。

4.3 横向流试纸条检测方法

横向流试纸条检测方法是一种创新的检测手段，它将免疫技术、分子杂交技术、胶体金标记技术和横向流层析技术整合在一起。RPA扩增采用生物素和荧光标记引物，产物通过试纸条层析，与固定化抗体或互补探针结合，形成可见条带，从而达到快速检测 RPA扩增产物的目的。该方法的特点‌是成本低、耗时短，肉眼可判读结果，局限性在于灵敏度较低，常适用于定性分析。‌Kim等^[3]采用将 DNA提取、RPA扩增及LF探针检测相结合的方式来检测分析沙门氏菌，结果表明，从提取DNA开始到得到检测结果仅需要30 min，并且检测限可以达到10 cfu/mL。

4.4 微流控芯片集成检测

‌RPA产物与电极表面固定化探针杂交，触发氧化还原反应，通过电流或阻抗变化定量靶标。将RPA扩增与检测模块（荧光、比色、电化学）集成于单一芯片，实现“样本进-结果出”全封闭检测。但局限性‌在于研发与生产成本高，尚未大规模普及。

4.5 CRISPR-Cas耦合检测

RPA扩增后，利用Cas12a/Cas13a蛋白的侧切活性，剪切荧光或比色报告分子，放大检测信号。试纸条化CRISPR检测，支持野外快速筛查，但‌步骤繁琐，常温稳定性待提升。Y Yang等^[4]开发了一种基于CRISPR-Cas13a与逆转录重组酶聚合酶扩增（Reverse Transcription Recombinase Polymerase Amplification，RT-RPA）技术结合的一体式现场快速检测方法，用于废水中SARS-CoV-2病毒的检测。通过单管反应体系即可完成对病毒RNA的提取、逆转录、扩增及检测，极大简化了操作流程。

5 RPA技术的应用

目前基于RPA技术建立的检测方法正越来越广泛地应用于疾病诊断、病原学检测等领域。

5.1 RPA技术在细菌检测领域的应用

Piepenburg等^[1]最初提出用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性基因SCCmec的RPA方法，并且成功建立实时荧光RPA方法，对于拷贝数低于10的模板都可以得到检测结果。Boyle等^[5]建立的用于结核分枝杆菌的荧光RPA检测方法，可以快速检测结核分枝杆菌的复合群，与荧光显微镜方法相比，RPA方法更快、特异性更强。Raja等^[6]采用RPA技术对常引起尿路感染的5种细菌进行检测，可在12 min内检测到尿液样本中100个拷贝数的细菌，并且与其他菌无交叉反应。周广彪等^[7]建立了针对拟态弧菌vmhA基因的RPA检测方法，仅需在37℃下恒温反应40 min，就能够从拟态弧菌中扩增得到467 bp的特异性条带，灵敏度与PCR一致，均达到0.1 ng/μL，适用于快速检测。

5.2 RPA技术在病毒检测领域的应用

Sun Y等^[8]设计了针对SARS-CoV-2 RdRp和N基因的RT-RPA引物，通过优化反应体系，使扩增和检测在同一管内完成。CRISPR/Cas12a系统利用特定的CRISPR RNA识别目标序列，并通过酶的非特异性切割作用释放荧光信号，进而实现检测。该方法在SARS-CoV-2阳性和阴性样本中测试，结果与实时荧光RT-PCR完全一致，检测限为2.5拷贝/μL，展现出极高的灵敏度。该方法将检测时间压缩至约50 min，远快于传统方法，同时单管操作能降低污染风险，简化流程。Cherkaoui D等^[9]提出为扩大诊断范围以实现在高峰需求时期进行大量检测的需求，RT-RPA是RT-PCR的可行替代方案，两者相比，RT-RPA检测显示出高灵敏度和特异性，分别为96%和97%。该检测方法与所测试的呼吸道病原体组没有交叉反应。此检测法能检测包括4种变体（Alpha、Beta、Delta、Omicron）在内的11个SARS-COV-2 谱系。Sridhar S等^[10]报告了3种针对基孔肯雅病毒（Chikungunya Virus，CHIKV）、奥尼昂-尼昂病毒（O’nyong-nyong Virus，ONNV）和马亚罗病毒（Mayaro Virus，MAYV）的病毒特异性 RT-RPA快速检测的开发和验证，既快速又灵敏，能够在扩增后20 min内检测到10～100个病毒拷贝，且不会出现交叉反应。研究人员使用CHIKV、ONNV 和MAYV感染小鼠以及CHIKV感染人类患者的血清和组织样本评估了这些检测的临床潜力。这些研究结果强调了快速而具体的诊断方法在改善这些虫媒病毒感染的早期检测和管理方面的重要性，尤其是在资源有限的环境中。在婴儿艾滋病毒检测中^[11]，RPA技术可以在31～43℃的条件下，20 min内检测到低拷贝量的HIV-1亚型的前DNA，同时通过增加逆转录RPA反应，该方法还可检测HIV-1 RNA，方法更敏感、更快速。Faye O等^[12]报道了在几内亚埃博拉疫情暴发期间，埃博拉病毒的核衣壳蛋白（Nucleoprotein，NP）基因采用RT-RPA的检测方法，8 min内检测到血浆样品中15个拷贝数的RNA。在临床样本检测中，该方法与RT -PCR方法的符合率达到100%，展示出良好的特异性、灵敏度。国内外也有学者应用RT-RPA技术建立了中东呼吸综合征冠状病毒^[13]、禽流感病毒H7亚型^[14]、流感病毒H5N1血凝素（Hemagglutinin，HA）基因^[15]、裂谷热病毒^[16]快速检测方法，均表现出与实时荧光定量PCR相同的高灵敏度和高特异性。‌新加坡樟宜国际机场建立了全球首个全数字化病原筛查枢纽‌，对入境旅客的唾液样本，采用12台微流控数字RPA检测站（集成AI分液系统），云端变异株数据库实时比对，2 h内完成唾液样本中Omicron亚系BA.2.86的拷贝数定量，阳性检出率较传统PCR大幅提升。

6 结语

RPA技术具有优于非等温核酸扩增技术的显著优势，具体表现在以下几个方面：（1）快速动力学，样品加入体系即开始反应，无需对目标双链DNA进行解链处理；（2）恒温反应，这一特点大大减少了技术及仪器所需要的成本；（3）广泛的目的基因适应性，目标基因不限制于DNA或RNA，甚至可以是处理后适合于进行RPA的RNA病毒，如HCV病毒；（4）与基于探针的检测技术的结合，将对便携式快速精确的核酸检测具有重大意义；（5）在技术兼容性上，与CRISPR、微流控等技术的联合应用，检测灵敏度更高，应用场景更加广阔。综上所述，随着RPA技术的广泛应用，将极大提高检测效率，为疾病的早期诊断和实地检测提供简易快捷的检测手段。

参考文献

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基金项目：国家重点研发计划项目（2022YFC2302800）

第一作者：张娟（1982—），女，汉族，山东泰安人，硕士，副主任技师，主要从事传染病检测研究工作，E-mail: 5477272jsl@163.com

通信作者：徐翮飞（1975—），女，汉族，山东青岛人，硕士，主任技师，主要从事传染病检测及分子生物学研究等工作，E-mail: fei3579@163.com

1. 青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部） 青岛 266071

1. Qingdao International Travel Health Care Center (Outpatient Department of Qingdao Customs), Qingdao 266071

表1 主要核酸等温扩增技术的比较

Table 1 Comparison of major isothermal nucleic acid amplification techniques