胡美玲 李贺 陈宇 周卫川 赵晓丽 陈展册 杨倩倩 王沛

摘 要 灌丛蜗牛是近年来我国口岸频繁截获的外来有害生物。本研究根据灌丛蜗牛与近似种COⅠ基因序列的差异，设计了可特异性检测灌丛蜗牛的引物GCF1/ GCR1和探针GCP1，建立了基于TaqMan探针的灌丛蜗牛实时荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果表明，供试样品中仅灌丛蜗牛出现了典型扩增曲线，其他样品及空白对照均无荧光信号。灵敏度试验结果表明，在20 μL反应体系内，检测浓度可达1 fg/μL。在核酸拷贝数10¹¹～10³ copies/μL范围内，标准工作曲线为y = -3.680x + 47.503，相关系数r² = 0.997，反应浓度的对数值与循环数呈良好的线性关系。该方法特异性强、灵敏度高、稳定性好、速度快且污染少，能够满足口岸对灌丛蜗牛快速鉴定的需求。

关键词 灌丛蜗牛；荧光定量；植物检疫；快速鉴定

Establishment of Real-time Fluorescent Quantitative PCR Detection Method for Arianta arbustorum

HU Mei-Ling^1,2 LI He^1,2 CHEN Yu^1,2 ZHOU Wei-Chuan^1,2 ZHAO Xiao-Li³

CHEN Zhan-Ce⁴ YANG Qian-Qian⁵ WANG Pei^1,2*

Abstract The copse snail Arianta arbustorum (Linnaeus, 1758), is an important invasive pest frequently intercepted at ports in China in recent years. This study designed primers GCF1/GCR1 and GCP1 probe for specific detection of the copse snail based on the differences in COⅠsequences between the copse snail and allied species, and a real-time fluorescence quantitative PCR detection method based on TaqMan probe was established for the copse snail. The specificity test results showed that only the copse snail exhibited typical amplification curves in the tested samples, while other samples and blank controls showed no fluorescence signals. The sensitivity test results showed that the detection concentration can reach 1 fg/μL in a 20 μL reaction system. The established standard curve indicated a good linear relationship between the logarithm of reaction concentration and cycle number within the range of nucleic acid copy numbers 10¹¹-10³ copies/μL. The standard curve y = -3.680x + 47.503 was acquired, with a correlation coefficient r² = 0.997. This method has strong specificity, high sensitivity, good stability, and fast speed, which can meet the needs of rapid identification of copse snails at ports.

Keywords Arianta arbustorum (Linnaeus, 1758); real-time fluorescent quantitative PCR; plant quarantine; rapid identification

基金项目：海关总署科研项目（2024HK145）；福建省对外合作项目（2024I0033）；国家自然科学基金（31801960）

第一作者：胡美玲（1984—），女，汉族，江西婺源人，硕士，高级农艺师，主要从事植物检疫工作，E-mail: 93770092@qq.com

通信作者：王沛（1983—），女，汉族，河南南阳人，博士，正高级农艺师，主要从事软体动物检疫鉴定工作，E-mail: wangpei601@126.com

1. 福州海关技术中心 福州 350001

2. 福建省检验检疫技术研究重点实验室 福州 350001

3. 中国海关科学技术研究中心 北京 100020

4. 南宁海关技术中心 南宁 530000

5. 中国计量大学 杭州 310018

1. Technology Center of Fuzhou Customs District, Fuzhou 350001

2. Fujian Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research, Fuzhou 350001

3. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100020

4. Technology Center of Nanning Customs District, Nanning 530000

5. China Jiliang University, Hangzhou 310018

灌丛蜗牛Arianta arbustorum (Linnaeus，1758)隶属大蜗牛科Helicidae灌丛蜗牛属Arianta，其寄主范围广泛，包括大豆等农作物、苹果等果树及松树等园林观赏植物^[1]。灌丛蜗牛不但严重危害农林作物，而且传播人畜共患的脉管圆线虫（Angiostrongylus vasorum）病^[2]。截至目前，灌丛蜗牛已分布于全球约20个国家，涉及欧洲、亚洲、北美洲等^[1,3]，美国将其列入检疫性有害生物名录^[4]。我国尚未见发生分布的报道，但仍需加强对灌丛蜗牛鉴定技术的研究，对保护我国农业生产、生态环境及人民健康具有重要意义。

目前，关于灌丛蜗牛检疫鉴定的标准国内外尚未见报道。本课题组之前对灌丛蜗牛进行了传统形态学和分子测序比对的研究，国外研究也仅限于上述相关内容^[5-8]。灌丛蜗牛与其近似种外观极为相似，仅从贝壳形态上难以区别，需要鉴定人员具备较深的专业知识和专业背景。另外，灌丛蜗牛的贝壳因受外界地理环境、气候因素等影响而常常发生变异，检疫鉴定更为困难^[8]。在实际检疫鉴定工作中，口岸相关部门截获的多为幼体蜗牛或残缺蜗牛，无法进行形态学鉴定。传统聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）测序比对虽可实现不同状态标本的鉴定，但费时费力，且受数据库是否有相关基因序列限制，不能完全保证通过序列比对或构建系统发育树的方法达到准确鉴定目的^[9]。

实时荧光PCR是一种成熟的核酸定性及定量分析技术，具有操作简便、实时监测、污染少等优点，在生物学领域发挥着关键作用，已在细菌、真菌、转基因检测等领域广泛应用^[9-13]，但未见关于灌丛蜗牛实时荧光定量PCR检测方法的报道。本研究根据灌丛蜗牛与近似种COⅠ基因序列的差异，设计了可特异性检测灌丛蜗牛的引物和探针，建立了基于TaqMan探针的灌丛蜗牛实时荧光定量PCR检测方法，用于快速检疫鉴定灌丛蜗牛，以防止有害生物入侵，保护国门生物安全。

1 材料与方法

1.1 试验材料

阳性对照为包含灌丛蜗牛COⅠ基因的重组质粒稀释液，供试样品为灌丛蜗牛、灰巴蜗牛、同型巴蜗牛、江西巴蜗牛、单带巴蜗牛、沈氏巴蜗牛、条华蜗牛、短旋巴蜗牛、散大蜗牛、盖罩大蜗牛、忽视白蜗牛、森林葱蜗牛，以上样品通过口岸截获或采集获得，经福州海关技术中心软体动物检疫鉴定重点实验室确认后，置于-20℃保存。

1.2 试剂与仪器

动物组织基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；2×GoTaq Probe qPCR Master Mix（美国Promega公司）；NanoDrop超微量核酸蛋白分析仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；实时荧光PCR仪（西安天隆科技有限公司）等。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank已发表的灌丛蜗牛及近似种COⅠ基因序列，通过与近似种的比对找出种间变异和种内保守区域，用引物设计软件 Primer Express 3.0辅助设计和分析引物，经数据库Blast 检验其特异性后，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。经反复比对测试，最终确定的引物和探针序列见表1。其中，探针GCP1序列5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记的荧光淬灭基团是BHQ1。

1.4 DNA提取

取供试蜗牛腹足肌肉约0.03 g，采用动物组织基因组DNA提取试剂盒，根据产品说明书的方法提取基因组DNA。提取的DNA用NanoDrop超微量核酸蛋白分析仪测定核酸质量及浓度，保存于-20℃冰箱。

表1 灌丛蜗牛特异性引物/探针序列

Table 1 Specific primer and probe sequences of A. arbustoru (Linnaeus, 1758)

1.5 实时荧光定量PCR反应体系及条件

优化后的反应体系总体积为20 μL，其中2×GoTaq Probe qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物及探针（初浓度为10 μmol/L）各1 μL， DNA模板2 μL，ddH₂O 5 μL。反应程序为：95℃预变性2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环；结束反应。

1.6 特异性测试

以上述供试样品DNA为模板，根据优化后的反应体系及程序进行实时荧光定量PCR扩增，以测试引物特异性。

1.7 灵敏度测试

以10倍浓度梯度稀释法将含有灌丛蜗牛COⅠ基因的重组质粒干粉用TE缓冲液（Tris-EDTA buffer solution，TE）稀释成100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL的不同浓度，每个梯度设置3个重复，根据上述优化后的反应体系及程序进行实时荧光定量PCR扩增，以测试引物灵敏度。

1.8 线性关系及稳定性分析

标准品选取上述不同DNA浓度梯度稀释液，建立灌丛蜗牛实时荧光定量PCR检测的标准工作曲线并进行线性回归分析。根据重组质粒干粉重量及序列长度计算拷贝数，公式为：质粒拷贝数（copies/μL）=阿伏伽德罗常数×质粒浓度（ng/μL）×10^-9／1个碱基对的平均分子量×重组质粒序列长度。同时，计算标准偏差（Standard Deviation，SD）和变异系数（Coefficient of Variation，CV）以分析其稳定性。

2 结果与分析

2.1 特异性测试

按照1.6进行特异性测试，试验结果如图1所示。由图1可见，阳性对照Ct 值≤30并出现典型的扩增曲线，只有灌丛蜗牛样品在荧光定量PCR仪上出现典型的扩增曲线且Ct 值小于37，而其他样品和空白对照均无 Ct 值且无扩增曲线，表明本方法可用于灌丛蜗牛的特异性检测。

1: 阳性对照; 2: 灌丛蜗牛; 3—14: 灰巴蜗牛、同型巴蜗牛、江西巴蜗牛、单带巴蜗牛、沈氏巴蜗牛、条华蜗牛、短旋巴蜗牛、散大蜗牛、盖罩大蜗牛、忽视白蜗牛、森林葱蜗牛、空白对照

图1 灌丛蜗牛实时荧光定量PCR特异性检测结果

Fig.1 Specific amplification results of A. arbustorum (Linnaeus, 1758) by real-time fluorescence quantitative PCR

2.2 灵敏度测试

按照1.7进行灵敏度测试，试验结果如图2所示。由图2可见，100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL的不同浓度DNA均检测到荧光信号的增加，出现典型的扩增曲线。当DNA浓度为1 fg/μL时仍有扩增曲线出现，表明此方法具有较高的灵敏度，检测浓度可达到1 fg/μL。

2.3 线性关系及稳定性分析

灌丛蜗牛COⅠ基因质粒标准品DNA浓度为100 ng/μL，以10倍浓度梯度稀释后对应拷贝数梯度为1.41×10¹¹ copies/μL、1.41×10¹⁰ copies/μL、1.41×10⁹ copies/μL、1.41×10⁸ copies/μL、1.41×10⁷ copies/μL、1.41×10⁶ copies/μL、1.41×10⁵ copies/μL、1.41×10⁴ copies/μL、1.41×10³ copies/μL。由图3可见，在核酸拷贝数10¹¹～10³ copies/μL范围内，得到标准工作曲线y = -3.680x + 47.503，相关系数r² = 0.997，表明反应浓度的对数值与循环数呈良好的线性关系。表2显示的CV值均小于3%，表明该方法具有良好的稳定性。

3 结论

灌丛蜗牛移动缓慢，其自身的传播能力有限，主要通过蔬菜、瓜果等农副产品贸易和种苗、切花切枝调运传播，亦可附着在交通运输工具、集装箱、包装材料等物体表面进行远距离传播^[1,14]。目前该蜗牛在我国尚无分布记录，但随着中欧班列的运行及我国对欧洲贸易加速发展，其传入我国的可能性逐年增大。因此，为避免该蜗牛的传入，保护我国农业生产和人民健康，亟待研究稳定、快速、高效的技术对其进行检测鉴定。

经查阅文献资料，国内外对于软体动物、昆虫等直观性有害生物的检测鉴定大多依赖于传统的形态学方法^[6,8,15]，但该方法难以对卵、幼虫及残缺个体进行鉴定。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，实时荧光PCR、DNA条形码和环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）等技术也在物种鉴定方面得到广泛应用^[5,9]。国外学者对灌丛蜗牛的形态鉴别特征进行了较为深入的研究^[6,8]，但由于其贝壳形态变化大，生殖系统解剖对人员专业素养要求高等原因，国内非软体动物专业人员很难利用传统的分类学方法进行种水平的鉴定。本研究主要针对灌丛蜗牛与近似种COⅠ基因变异部分设计了目标种特异性引物和探针，建立了灌丛蜗牛实时荧光定量PCR检测方法。该方法可以对目标种进行双重控制，对于近似种均无扩增曲线，特异性强。经测试对灌丛蜗牛的检测灵敏度可达1 fg/μL，灵敏度高。该方法PCR扩增结果可以在电脑上直接显示，无需其他额外步骤，操作简单方便，结果判定直观准确，满足了口岸快速检测的要求，为防止外来有害生物传入，保护我国农业生产、生态环境和人民健康提供技术支撑。

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1: 100 ng/μL; 2: 10 ng/μL; 3: 1ng/μL; 4: 100 pg/μL; 5: 10 pg/μL; 6: 1 pg/μL; 7: 100 fg/μL; 8: 10 fg/μL; 9: 1 fg/μL

图2 灌丛蜗牛实时荧光定量PCR灵敏度检测结果

Fig.2 Sensitivity test results of A. arbustorum (Linnaeus, 1758) by real-time fluorescence quantitative PCR

图3 灌丛蜗牛实时荧光定量PCR扩增标准曲线

Fig.3 The standard curve of A. arbustorum (Linnaeus, 1758) by real-time fluorescence quantitative PCR

表2 稳定性测试结果

Table 2 Stability test results