马丹 张晓龙 齐小峰 郭维娜 魏海燕 王艺凯 张捷

摘 要 致病菌防控效能与其检测技术的革新密切相关。为满足现代化安全监管体系对快速响应的需求，开发具有高特异性、高灵敏度的快速检测技术，可提升致病菌的预警和防控能力，保障人类健康。本文分析了免疫学检测方法、分子生物学检测方法和质谱鉴定技术三大类快速检测技术的原理和在微生物检测中的应用，并对致病菌快速检测技术的发展前景进行展望。

关键词 致病菌；快速检测；微生物检测

Research Progress and Prospect in Rapid Detection Technologies for Pathogens

MA Dan¹ ZHANG Xiao-Long¹ QI Xiao-Feng² GUO Wei-Na³

WEI Hai-Yan¹ WANG Yi-Kai¹ ZHANG Jie^1*

Abstract The efficacy of pathogenic bacteria control is closely linked to innovations in detection technologies. To meet the rapid-response requirements of modern safety supervision systems, developing detection technologies with high specificity, rapid testing capability, and ultra-high sensitivity can significantly enhance early warning capabilities for bacterial outbreaks, thereby playing a pivotal role in safeguarding human health. This article analyzes the principles and applications of three major rapid detection technologies used in microbial detection immunological methods, molecular biological techniques, and mass spectrometry identification and discusses future perspectives for advancing rapid pathogen detection.

Keywords pathogens; rapid detection; microbial detection

致病菌是指能够侵入宿主体内，突破宿主防御机制，引起感染或疾病的微生物。由于致病微生物引发的公共卫生事件频发，其导致的健康风险不容忽视，所以加强微生物监测是十分必要的。例如，公共场所环境的卫生状况与疾病的传播、流行密切相关，致病微生物是衡量环境卫生状况的重要指标；同时，部分致病菌作为重要的人兽共患病原体，通过食物链传播，经消化道感染引发典型食源性疾病。因此，建立灵敏度高、特异性强、检测快速的技术对于保障人民群众健康安全和防止疾病传播至关重要^[1]。近年来，随着免疫学、分子生物学和人工智能等领域的突破，检测技术不断向高灵敏度、快速化和便携化发展。

1 致病菌传统检测方法

目前，致病菌的传统检测方法主要基于微生物培养、形态学观察和生化鉴定。以下是传统检测方法的主要步骤：首先进行预增菌，用于复活受损菌体，增加目标菌数量等目的；其次为选择性增菌，用于抑制杂菌，促进目标菌生长；最后是平板划线，进行分离培养，培养一定时间后，进行形态学观察，挑取可疑菌落接种于普通琼脂平板，获得纯培养物，再进行生化鉴定，通过代谢特征确认菌种。传统检测方法是致病菌检测中最经典最稳定的方法，具有准确性高、成本低、设备要求简单、可获得活菌用于后续研究等优点，但操作繁琐、周期较长，工作量偏大，一般需要3～7 d才能鉴定出结果，而且在分离培养观察时依赖经验，结果的准确性与实验人员的专业技术水平密切相关，有时无法适应公共卫生事件应急快速响应需要。

2 致病菌快速检测方法

2.1 免疫学检测方法

2.1.1 酶联免疫吸附实验

酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked Immunosor-bent Assay，ELISA）的原理为将特异性抗体固定在固相载体，如微孔板上，加入待测样本后，目标抗原与抗体结合，再通过酶标记的二抗与底物显色反应进行定量或定性检测。根据反应的途径，ELISA技术分为直接法、间接法、夹心法、双抗体夹心法、酶标抗原竞争法等方法，其中致病菌的检测一般采用双抗体夹心ELISA法，检测灵敏度较高^[2]，可适用于大批量样本的高通量检测。国外研究者早在1977年就将ELISA 用于沙门氏菌的检测^[3]，其后不同的研究者将ELISA运用于致病菌的检测中，如大肠埃希氏菌 O157:H7 ^[4]或金黄色葡萄球菌肠毒素等。但该技术受制于抗原抗体反应，难以同时分析多种成分，当存在分析结构类似的化合物时，存在交叉反应，会出现假阴性^[5]。同时，需要专业设备酶标仪等，通常需要2～6 h。

2.1.2 侧向流动层析

侧向流动层析（Lateral Flow Assay，LFA）的原理为将标记抗体固定在试纸条上，样本中的抗原与标记抗体结合后，通过毛细作用迁移至检测线（T线）和质控线（C线），短时间内可直接形成可见条带。该方法的优点为快速，一般5～15 min出结果，操作简单，无需专业设备，肉眼即可直接判定检测结果，适合现场检测，可应用于沙门氏菌^[6]、单核细胞增生李斯特氏菌、霍乱弧菌等的快速筛查。但在检测灵敏度和选择性方面较差，检测结果易受到实验环境的影响，多为定性检测，因此其应用受到了限制。

2.2 分子生物学检测方法

2.2.1 聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）是以核酸为基础的检测技术，用于快速扩增特定目标基因，目前广泛应用于致病菌的快速检测。常规PCR通过特异性引物扩增目标病原菌的特定基因片段，如毒力基因、16S rRNA等，具有快速、灵敏度高等优点，但是该方法操作繁琐，无法区分死菌与活菌，而且通常需要结合培养法进行预增菌。实时荧光定量PCR（Quantitative Rreal-time PCR，qPCR）在PCR过程中通过荧光信号实时监测扩增产物，可定量分析，荧光信号一般通过TaqMan探针或者SYBR Green染料实现^[7-9]，该方法具有较好的特异性及较高的灵敏度，且无需对产物进行后续处理，可实时查看扩增结果，更准确高效地完成微生物的检测，是目前应用最为广泛的分子生物学检测技术，可应用于检测阪崎克罗诺杆菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌 O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌等常见致病菌^[10-14]。数字PCR（Digital PCR，dPCR）是继第一代常规PCR、第二代qPCR之后的第三代PCR技术^[15-17]，是绝对定量检测。由于其检测原理为首先将核酸样品分配到几万个反应单元中，使得每个反应单元含有一个或不含模板分子，之后对每一个反应单元进行 PCR 扩增，然后读取每一个反应单元的荧光信号，最后根据泊松分布原理和荧光信号阳性反应单元比例计算出目标核酸序列的拷贝数和浓度，因此适用于低丰度样本或复杂基质食品。该方法现主要应用于检测水产品中的副溶血性弧菌，食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌等致病菌^[18-22]，以及各种动物疫病的检测^[23-24]。

2.2.2 等温扩增技术

等温扩增技术（Isothermal Amplification Technology）是一类在恒定温度下快速扩增核酸的技术，无需传统PCR中的热循环过程。这类技术因操作简便、设备要求低、反应速度快等特点，广泛应用于分子诊断、病原体检测、环境监测和食品安全等领域。环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）使用包括内引物和外引物在内的4～6条引物，靶向目标DNA的多个区域，依赖链置换DNA聚合酶在60～65℃下扩增，形成茎环结构。其步骤包括“模板合成、循环扩增、延长再循环”三个阶段，整个反应持续约1 h^[25]。LAMP检测具有高灵敏度与特异性，并可通过其副产物焦磷酸镁沉淀的浊度或荧光染料直接观察结果，不依赖大型设备，并且结果可肉眼观察^[26]，在监测和控制食源性疾病的传播方面发挥了重要作用。但是LAMP需要设计多对引物，易出现非特异性扩增，而且开放式检测易导致气溶胶污染。重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术是继LAMP技术之后的另一种恒温快速扩增技术^[27]，其利用重组酶将引物与模板DNA结合，形成D-loop结构，随后DNA聚合酶在37～42℃下扩增。该方法对实验环境要求低，整个反应不需要高温变性，反应时间在5～45 min，耗时较短^[28-29]，但在检测过程中应注意气溶胶的产生与扩散，防止交叉污染。等温扩增技术凭借其简便性和高效性，在即时检测和资源有限场景中展现出巨大潜力。未来随着引物设计优化和抗污染策略的改进，其应用范围将进一步扩大，成为分子诊断领域的重要工具。

致病菌分子生物学快速检测方法的反应条件、引物数量以及特点等见表1。

2.3 质谱鉴定技术

致病菌质谱鉴定技术是一种基于质谱分析的高效微生物鉴定方法，通过电离生物分子的蛋白质、脂质等部分，主要分析细菌高度保守且物种特异性强的核糖体蛋白或细胞壁成分，形成独特的“指纹图谱”^[30]。将实验谱图与已知菌种的标准谱图数据库匹配，实现快速鉴定。传统生化鉴定需24～48 h，而质谱鉴定仅需数分钟，还可批量处理样本，单次检测成本远低于测序或生化试剂。但该项技术存在对罕见菌或新发病原体可能无法识别，某些近缘菌种，如大肠埃希氏菌与志贺氏菌可能难以区分的情况，而且需要先分离培养，无法直接用于混合样本等问题。但总体来说，致病菌质谱鉴定技术凭借其快速、精准的特点，已成为现代微生物学的重要工具，而且随着数据库的完善和技术的迭代，其在病原体诊断、抗微生物耐药监测等领域的应用潜力将进一步释放。

总体而言，免疫学检测方法因具有低成本和检测快速的特性，主要用于快检；分子生物学检测方法灵敏度高，可对特定致病菌进行定性或定量分析；质谱鉴定技术可快速、准确鉴定纯培养物，但设备投入和维保成本较高。三种检测方法的性能比较见表2。在实际应用中，这些技术常常是互补的，比如用免疫学方法初筛传染病，可疑样本再用分子生物学方法进行确认；用质谱鉴定技术鉴定出致病菌后用分子生物学方法，比如全基因组测序检测其携带的耐药基因等。

3 结语与展望

目前，致病微生物检测仍主要采用传统培养法，但多种快速检测方法在飞速发展中。快速检测方法目前面临以下技术挑战：一是复杂基质干扰，样本如存在蛋白质、脂肪等成分易导致假阳性或假阴性，需开发更高效的样本前处理技术；二是多重检测瓶颈，同时检测多种致病菌时，引物交叉反应和信号串扰问题亟待解决；三是标准化与成本，部分快速检测方法缺乏统一标准，同时设备成本制约基层推广。

免疫学检测方法在致病菌检测中平衡了速度与准确性，是传统培养法和分子生物学方法的重要补充。实际应用中常根据需求组合多种方法。例如，免疫磁珠富集后结合 ELISA进行检测，同时结合智能便携设备读数，推动现场即时检测。分子生物学检测方法目前也在大力研究多重PCR技术，能同时检测多种致病菌，同时结合EMA或者PMA进行预处理，抑制死菌DNA扩增，满足活菌检测需求。高通量测序已广泛应用于各领域，特别是在测序中加入人工智能辅助分析，用于测序数据或复杂样本的快速解析，这样就能及时解析出致病菌、毒素、耐药基因等数据。致病菌质谱鉴定技术以其高效、精准的优势，已成为现代微生物学研究的关键技术支撑。在数据库持续扩容与技术更新的驱动下，其在病原体诊断、微生物耐药监测等领域的应用场景将加速拓展。未来需进一步扩展数据库，纳入更多罕见菌种及地域特异性病原体，同时进行多组学整合，利用联合基因组学、代谢组学提升鉴定深度，还需开发小型质谱设备用于现场快速检测等。

随着科学技术的不断进步，致病微生物检测技术正经历从实验室到现场、从单一到多元、从离线到在线的转变，检测仪器将会向便携化、简易化、数字化、智能化方向发展。随着多种检测技术联用，更高灵敏度、更高准确性、更强特异性、更广适用范围、更快检测速度是未来致病菌检测技术的发展趋势。

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基金项目：海关总署科研项目（2023HK132）

第一作者：马丹（1987—），女，汉族，湖北孝感人，本科，高级工程师，主要从事食品安全检测工作，E-mail: madan1002cn@163.com

通信作者：张捷（1965—），男，汉族，北京人，博士，研究员，主要从事食品安全检测工作，E-mail: dofree1002@163.com

1. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

2. 深圳海关后勤管理中心 深圳 518045

3. 西安海关技术中心 西安 710068

1. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

2. Shenzhen Customs Logistics Management Center, Shenzhen 518045

3. Technology Center of Xi’an Customs, Xi’an 710068

表1 致病菌分子生物学快速检测方法对比

Table 1 Comparison of rapid molecular biological detection methods for pathogens

表2 3种致病菌快速检测方法的性能比较

Table 2 Comparison of three rapid detection methods for pathogens