李响 吴连鹏 宋战昀 刘博 鲍明宇 刘艳琪 齐燕飞 张西萌

李 响 ¹ 吴连鹏 ¹ 宋战昀 ¹ 刘 博 ¹ 鲍明宇 ¹ 刘艳琪 ² 齐燕飞 ² 张西萌 ^{3 *}

摘 要 近年来，随着分子生物学技术的不断发展，犬冠状病毒（Canine Coronavirus，CCoV）的基因研究取得了显著进展，包括病毒的基因组结构、基因功能、遗传变异以及分子诊断技术等方面。本文综述了CCoV基因学的研究进展，阐述病毒的分子特性、进化规律以及致病机制，为开发有效的治疗方法、优化临床管理和制定精准防控策略提供理论参考。

关键词 犬冠状病毒；基因学；研究概况

Overview of Genomic Research on Canine Coronavirus

LI Xiang¹ WU Lian-Peng¹ SONG Zhan-Yun¹ LIU Bo¹

BAO Ming-Yu¹ LIU Yan-Qi² QI Yan-Fei² Zhang Xi-Meng^3*

Abstract In recent years, with the continuous advancement of molecular biology technologies, significant progress has been made in the genetic research of canine coronavirus (CCoV), including the genome structure, gene function, genetic variation, and molecular diagnostic technology of the virus. In this review, we synthesize current knowledge on CCoV genetic characteristics, phylogenetic dynamics, and pathogenic mechanisms. The insights presented provide a theoretical framework for the rational design of therapeutic interventions, refinement of clinical management protocols, and formulation of precision prevention and control strategies.

Keywords canine coronavirus (CCoV); genomics; research progress

犬冠状病毒（Canine Coronavirus，CCoV）是一种主要感染犬类的病毒 ，其流行情况常给犬类养殖业、经济动物生产业和野生动物保护等工作带来较大影响^[1]。犬类在发病时会有不同程度的胃肠炎症状出现，表现为高频次的呕吐、腹泻、精神沉郁、基本不进食等。患病犬类是主要传染源，通过患病犬呼吸道、消化道传播，患病犬粪便及污染物亦为主要传播媒介，与患病犬在同一物理空间内的其他犬类也将感染。CCoV经常和犬细小病毒、轮状病毒等对犬类消化道造成混合感染，使幼犬死亡率大幅增加，且一年四季均可传播，以冬春季节发病率略高。CCoV在1971年首次从德国军事用犬的腹泻样本中被分离到^[2]，此后其他国家也开始陆续报道，我国于1985年首次发现并报道^[3]。

1 犬冠状病毒的病原特征

依据国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）分类系统，CCoV在病毒分类学上隶属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒亚科α属^[4]。该属病毒具有相似的基因组结构特征，其遗传物质为单股正链RNA，病毒粒子表面呈日冕状的刺突蛋白（S蛋白）是重要的分类依据之一。与犬冠状病毒同属的病毒还包括猪流行性腹泻病毒、猫冠状病毒，以及可感染人类的人冠状病毒229E，这些病毒在宿主嗜性、致病机制和进化关系上存在显著差异，但其分子生物学特性为研究病毒进化与跨物种传播提供了重要依据。

犬冠状病毒的形态及大小无固定参照模板，其中大多数呈圆形或椭圆形，病毒粒子直径介于60～200 nm之间，有囊膜；对热溶剂、脂溶剂、甲醛和氧化剂敏感；对酸稳定，在-70℃或冻干后在4℃下可保存多年。犬冠状病毒在自然条件下的生存能力极强，在物体表面数日后其传染性依然存在。

2 犬冠状病毒病临床症状

犬冠状病毒感染特征较为明显，呈现发病率高、死亡率低的特点。患病犬类在排粪时会将犬冠状病毒一同排出，病毒在其他犬类的口腔内再次引起感染。流行病学研究表明，在未出现继发感染的情况下，该病毒感染通常呈自限性经过，较少导致患病犬死亡^[5]。CCoV属于冠状病毒科冠状病毒属单股正链RNA病毒，其野生型毒株毒力相对较弱。然而，由于RNA病毒固有的高突变率及基因重组特性，CCoV在长期进化过程中，可通过基因片段重组产生具有新型生物学特性的变异毒株。其中，高毒力变异株感染可引发犬只出现发热、顽固性呕吐、水样腹泻等典型临床症状，实验室检查常伴随白细胞数量显著减少等血液学异常，病情进展迅速且预后相对较差^[6]。

经科学研究证实，在自然生态环境下，犬冠状病毒感染犬类肠道后，其生物学潜伏期通常为1～4 d；而在人工控制的实验环境条件下，受病毒接种剂量、实验犬个体差异及环境干预等因素影响，潜伏期显著缩短，一般仅为1～2 d。病毒感染机体后，在完成病毒复制、组装及释放过程后，于感染后3～14 d期间，主要通过病犬粪便实现外环境排毒，进而引发水平传播。犬冠状病毒感染初期可导致犬轻中度肠炎，感染后期排出褐色、黄绿色的糊状稀便，便中夹杂黏液或少量血液，有恶臭味。感染犬冠状病毒的犬类，病情较重的则表现为严重腹痛，出现血便，腹泻可以引起肛周红肿发炎^[7]，其结果是因脱水而引起的死亡。犬冠状病毒与其他肠道病原体对犬类造成混合感染时，能够引起更加严重的消化道临床症状，使死亡率升高^[8]。幼犬死亡率高于成年犬，成年犬感染犬冠状病毒后一般情况下可以康复，病死率较低。

3 犬冠状病毒基因组结构与功能

CCoV为圆球形包膜，呈颗粒状，CCoV粒子直径为100～120 nm，该病毒的基因组为5'端戴帽、3'端聚腺苷酸化的单链正义RNA。其前导 RNA由5'末端65～98个核苷酸序列组成。此外，CCoV基因组的3'末端存在一段长度可观的非翻译区（Untranslated Region，UTR），该区域尾端为长度可变的poly（A）尾结构。在CCoV RNA的复制与转录机制方面，5'端和3'端的UTR发挥着极其重要的作用。CCoV在各个基因的5'端最后的位置，存在一个约由7个碱基组成的共同序列，其对亚基因组RNA的形成有着重要作用^[9]。

CCoV基因长度为30 kb，具有5'端前导结构和3' 端polyA尾结构。在基因组的5'端存在2个相互重叠的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），ORF1a和ORF1b，约占据整个基因的65%。其mRNA通常被译为多肽1a或1ab，病毒基因组3'端约35% 的区域包含ORF，这些ORF编码病毒的主要结构蛋白，包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白。此外，这些开放阅读框中还存在多个编码不同非结构蛋白的可阅读片段，目前，这些非结构蛋白片段所具备的生物学功能仍需通过进一步的科学研究加以明确和阐释。

S蛋白作为冠状病毒的关键结构蛋白，在病毒中和抗体的诱导过程中发挥核心作用。从病毒感染及发病机制层面来看，S蛋白通过特异性识别表面受体，该过程对病毒入侵宿主细胞、启动感染进程具有决定性意义。E蛋白作为病毒包膜的组成成分之一，主要参与病毒包膜的结构维持与功能调控。在病毒生命周期中，E蛋白与M蛋白协同作用，二者在病毒颗粒的组装、出芽以及释放过程中发挥着不可或缺的作用，共同保障子代病毒的完整形态与感染活性。M蛋白属于Ⅲ型跨膜糖蛋白，在病毒结构中占比最高。其拓扑结构呈现为氨基末端较短，且暴露于病毒包膜外侧；而羧基末端较长，主要位于病毒颗粒内部。这种独特的结构特征为病毒包膜的形成、维持以及病毒颗粒的形态构建提供了重要的结构基础^[10]。根据病毒学相关研究成果，N蛋白主要以碱性磷酸化蛋白的形式存在。N蛋白与病毒RNA通过特异性相互作用，组装形成具有螺旋对称结构的核衣壳^[11]。在病毒RNA的合成与病毒颗粒组装过程中，N蛋白与M蛋白协同发挥关键作用，二者共同参与并完成病毒颗粒的形态发生与成熟过程。在病毒基因组中，仍存在部分ORF的生物学功能尚未明确。经研究发现，其中多数此类未知功能的ORF并不直接参与病毒的复制过程；然而，这些开放阅读框可能通过复杂的分子机制，对病毒的毒力水平及宿主嗜性产生调控作用，进而影响病毒的致病特性及传播范围^[12]。

S蛋白包括S1和S2两个功能域，S2在表达上不是很明显，S1在不同属甚至不同毒株的表达上皆会出现明显不同。S1 结构域具备受体结合功能，其特殊的空间构象与受体分子间存在高度特异性的相互作用，这种结合能力在细胞黏附过程中起着关键作用，是病毒实现细胞附着的核心决定因素。E蛋白与M蛋白通过分子间特异性的相互作用，协同调控病毒的组装进程，并在病毒从宿主细胞释放环节中发挥决定性作用，二者共同构成了病毒生命周期中关键的分子调控网络。在遗传学上，可将CCoV分为CCoV-Ⅰ型和CCoV-Ⅱ型两种基因型^[13]，两种基因亚型主要在S蛋白上进行表现。在蛋白编码产物层面，这两种基因亚型所编码的S蛋白在氨基酸序列上的同源性显著降低，仅接近55%^[14]。此外，CCoV-Ⅱ在分类学框架下可进一步细分为CCoV-Ⅱa和CCoV-Ⅱb两个亚型^[15]。有研究介绍还存在另一种基因亚型，且被命名为CCoV-Ⅱc^[16]。

S蛋白在宿主感染过程中起到重要作用，其作为病毒细胞膜与宿主细胞膜融合的重要膜蛋白，具有重要作用^[17]。α-冠状病毒在氨肽酶N（Access Point Name，APN）的作用下感染犬类而非猫科动物。与犬类APN相比，猫科APN相对缺乏糖基化可能是导致特异性感染的主要原因^[18]。S蛋白的激活依赖于蛋白水解过程，其水解激活位点主要集中在一个或者两个特定位置，即S1/S2位点以及S2'位点，这一结论已在相关研究^[19]中得以论证。在众多不同种类的冠状病毒中，S1/S2位点的切割现象呈现出不确定性。有些冠状病毒株中，该位点能够发生切割；而在另外一些冠状病毒株里，这种切割却不会出现。相较之下，S2'位点的切割现象在冠状病毒中更为广泛地存在。从病毒感染机制的角度深入分析，S2'位点的切割与病毒融合肽的暴露有着极为紧密的直接联系。病毒融合肽的成功暴露，是病毒得以顺利入侵宿主细胞的关键步骤之一，所以S2'位点的切割对于病毒的感染进程有着不可或缺的作用^[20]。从分子作用机制层面来讲，S1/S2位点和S2'位点的切割反应，是多种蛋白酶协同作用的结果。在这个过程中，胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、组织蛋白酶以及弹性蛋白酶等多种蛋白酶发挥着重要功效。这些蛋白酶凭借自身独特的结构和催化活性，能够特异性地识别并作用于S蛋白上的相应位点，促使切割反应得以顺利进行^[21]。在冠状病毒的分类体系中，CCoV-Ⅵ型和CCoV-Ⅱ型在S蛋白切割激活机制上展现出显著的差异。具体来看，CCoV-Ⅵ型拥有两个截然不同的蛋白酶切割基序。其中，一个位于S1/S2位点，其氨基酸序列表现为R-R- S/A-R-R-S/A ，这种特定的序列结构决定了它能够被特定的蛋白酶识别并切割；另一个位于S2'位点，其氨基酸序列为G/K-R-S 。而CCoV-Ⅱ型的情况则有所不同，在S1/S2位点，它缺乏明显的可被常见蛋白酶识别的切割基序；不过在S2'位点，它却拥有一个极为独特的切割基序，其氨基酸序列为R-K-R-Y/F-R-S。这种在切割基序上的差异，使得CCoV-Ⅵ型和CCoV-Ⅱ型在S蛋白切割激活的方式和效率上存在明显不同，进而对它们各自的感染特性、传播能力以及在宿主群体中的流行规律等方面产生深远影响。

S蛋白为Ⅰ类膜融合蛋白，在病毒感染宿主细胞的过程中发挥着核心作用。在冠状病毒结构生物学领域，刺突蛋白（S蛋白）作为介导病毒感染宿主细胞的关键膜蛋白，其功能实现依赖于S1与S2亚单位的协同作用。其中，S1亚单位通过非共价相互作用组装形成S蛋白的球状头部结构域，S2亚单位主要参与形成S蛋白的柄状结构域，最终实现病毒基因组向宿主细胞的释放。在S1亚单位识别宿主细胞受体后，S2亚单位发挥其与宿主细胞膜融合的功能。在融合过程中，S2亚单位会发生一系列复杂的构象变化，最终形成稳定的螺旋结构，这一结构变化对于病毒进入细胞的融合反应至关重要，它是病毒核酸得以进入宿主细胞内部的必要条件^[22-23]。​

M蛋白广泛存在，其在病毒的生命周期中扮演着多重重要角色。在病毒组装过程中，M蛋白除参与病毒的形态外，还参与病毒包装。研究表明，M 蛋白通过与病毒的其他结构蛋白以及核酸相互作用，将病毒的各个组成部分组装成具有感染性的病毒颗粒。此外，M蛋白还具有重要的免疫调节功能，帮助宿主细胞抵御病毒感染，同时具有病毒中和作用，通过与病毒表面的特定结构结合，阻止病毒感染其他健康细胞，从而有效限制病毒在宿主体内的传播。M蛋白的中和效应呈现显著的条件依赖性特征，其作用机制的有效发挥严格依赖于补体系统的参与，即仅在补体存在的环境下，M蛋白方能展现其中和活性。更为重要的是，实验证据确凿地证实，M蛋白能够有效中和冠状病毒在犬类动物体内的感染性，该研究成果为后续相关领域的深入探索提供了重要的理论依据与数据支撑^[24]。N蛋白作为冠状病毒结构蛋白的重要组成部分，呈现出保守的碱性磷酸化修饰特征。虽然N蛋白在不同冠状病毒属间的序列同源性相对较低，表现出一定的种属特异性，但这并不妨碍其在病毒生命周期中执行关键且不可替代的生物学功能。从病毒结构层面来看，N蛋白主要定位于病毒核衣壳内，在病毒颗粒组装进程中发挥着核心作用，具体涉及病毒基因组RNA的结合、包装及病毒核衣壳的形态维持等多个关键环节，N蛋白与病毒核酸紧密结合，参与形成稳定的核衣壳结构，为病毒基因组提供保护，并在病毒包膜的形成过程中发挥关键作用。N蛋白能够激活T淋巴细胞和B淋巴细胞，帮助宿主识别和清除病毒感染^[25-26]。E蛋白是CCoV中含量相对较低的蛋白质，但其在病毒的组装和形态发生过程中却发挥着不可忽视的作用。E蛋白的N端含有约30个氨基酸，这些氨基酸具有特殊的结构和理化性质，能够与病毒膜发生特异性相互作用。尽管E蛋白在病毒中的含量稀少，但它参与了病毒体组装的多个关键步骤，对病毒的形态形成和稳定性起着至关重要的作用 ^[27]。

CCoV非编码区不编码蛋白质，但其二级结构在病毒的生命活动中具有重要的调控功能。研究发现，5' UTR 和 3' UTR 的二级结构不仅对RNA复制过程起着精确的调控作用，确保病毒基因组能够准确、高效地复制，而且在ORF的翻译过程中也发挥着关键作用，影响着病毒蛋白质的合成效率和质量^[28]。此外，有因素表明亚基因的合成涉及病毒基因组的结构、宿主细胞的环境以及多种病毒蛋白和宿主蛋白之间的相互作用^[29]。

4 结论

在过去的数十年间，科研人员针对来自不同地域、不同时间段分离出的CCoV毒株开展了全面且深入的基因测序与分析工作，取得了一系列具有深远影响力的成果。通过全基因组测序、基因片段扩增以及序列比对等技术手段，成功揭示了CCoV基因结构的精细特征，包括ORF的分布、基因编码蛋白的功能域等；同时，深入解析了其遗传变异的内在规律，如点突变、基因重组等遗传变异事件的发生频率、分布区域以及与病毒生物学特性改变之间的关联。此外，还通过系统发育分析，明确了CCoV与其他冠状病毒，如猫冠状病毒（Feline Coronavirus，FCoV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）等之间复杂的亲缘关系。这些研究成果不仅极大地增进了科研人员对CCoV生物学特性的理解，从分子层面深入探究了其致病机制，如病毒如何通过基因编码的蛋白与宿主细胞受体结合、侵入宿主细胞并进行复制等，还为疫苗研制以及诊断试剂的开发奠定了重要的理论基础。

然而，CCoV始终处于持续的进化与变异进程中，这一动态变化引发了一系列全新的问题。新型毒株的不断涌现，其基因序列发生了显著改变，导致病毒抗原性变异，使得传统的检测方法和疫苗效果受到挑战；病毒实现跨物种传播的现象，如 CCoV在犬科动物与其他动物之间传播，不仅拓宽了病毒的宿主范围，还增加了病毒进化的复杂性，这些都给CCoV的防控工作带来了严峻挑战。因此，深入研究CCoV的基因特征，精准把握其遗传进化规律，对于实时追踪病毒的变异动态，进而制定科学有效的防控策略具有极为关键的现实意义。

随着分子生物学技术的飞速发展，对CCoV的基因研究必将朝着更深入、更全面的方向推进。展望未来，研究有望在以下几个关键领域实现重大突破。

（1）进一步深化对 CCoV 的基因变异机制和遗传进化规律的研究。通过构建完善的理论模型，如基于群体遗传学的病毒进化模型，运用大数据分析、人工智能算法等前沿技术，整合海量的病毒基因序列数据、宿主信息以及环境因素等，精准预测病毒的变异趋势，为疫情防控提供坚实的理论支撑。

（2）强化基于基因检测技术的诊断方法的研究与实际应用。利用CRISPR基因编辑技术、纳米技术等前沿生物技术，如基于CRISPR-Cas系统的高特异性核酸检测技术，结合纳米材料的高灵敏度信号放大特性，优化检测流程，提高诊断的准确性和时效性，研发出操作更便捷、检测速度更快、灵敏度更高的诊断试剂盒，满足临床快速诊断的需求。

（3）加大对基因工程疫苗的研发投入。借助先进的基因编辑技术，如mRNA技术、重组蛋白技术等，优化疫苗的设计方案，改进制备工艺。例如，通过mRNA技术精准编码病毒关键抗原蛋白，在提高疫苗免疫效果的同时，确保其安全性；致力于开发针对不同基因型CCoV的多价疫苗，如包含多种主要流行毒株抗原表位的重组蛋白多价疫苗，增强疫苗的普适性和防护效力。

（4）深入探究CCoV与宿主细胞之间的相互作用机制。从基因层面出发，运用单细胞测序、蛋白质组学等技术，分析病毒感染前后宿主细胞基因表达谱的变化、蛋白质修饰与互作网络的改变，揭示病毒的致病奥秘，为探寻全新的治疗靶点，推动药物研发工作发展提供坚实的理论基础。

综上所述，CCoV的基因研究对于维护犬类健康、推动养犬业的稳健发展具有重要意义。相信在未来，相关研究将为CCoV的防控工作提供更高效的技术支持和科学的策略指导，助力养犬业的可持续发展。

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基金项目：海关总署科研项目（2022HK098）

第一作者：李响（1989—），男，汉族，吉林白城人，本科，兽医师，主要从事进出境动物检疫工作，E-mail: 653667606@qq.com

通信作者：张西萌（1984—），女，汉族，北京人，硕士，高级工程师，主要从事病原微生物研究工作，E-mail: mengshen0609@163.com

1. 长春海关技术中心 长春 130062

2. 吉林大学公共卫生学院 长春 130021

3. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

1. Changchun Customs Technology Center, Changchun 130062

2. School of Public Health, Jilin University, Changchun 130021

3. China Customs Science and Technology Research Center, Beijing 100026