周傲白雪 赵福振 张洪 罗宝正 陈轩

周傲白雪 ¹ 赵福振 ¹ 张 洪 ¹ 罗宝正 ¹ 陈 轩 ^{1 *}

摘 要 针对水体中H1N1流感病毒检测灵敏度不足的问题，本研究通过优化铁絮凝法和聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）沉淀法的最佳工作浓度，建立了两种水体中H1N1流感病毒富集方法，联合采用反转录实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR）进行检测，计算并比较回收率。结果表明，当Fe³⁺终浓度为0.1 mg/L时，铁絮凝法病毒富集效果显著优于其他浓度组，最高回收率达62.447%；PEG 8000浓度为50 g/L时，回收率最高为5.760%。根据回收率比较结果，铁絮凝法富集的病毒核酸量显著高于聚乙二醇（PEG）沉淀法（p ＜0.05）。本研究建立的水体中H1N1流感病毒的两种富集方法，为水体流感病毒监测提供了可靠的技术支持，实际应用中可根据需求选择方法应用。

关键词 H1N1流感病毒；病毒富集；铁絮凝法；聚乙二醇沉淀法

Optimization and Comparison of Two Enrichment Methods for H1N1 Influenza Virus in Water

ZHOU Ao-BaiXue ¹ ZHAO Fu-Zhen ¹ ZHANG Hong ¹ LUO Bao-Zheng ¹ CHEN Xuan ^1*

Abstract To enhance the sensitivity indetecting H1N1 influenza virus in water, this study optimized two viral enrichment methods-iron flocculation and polyethylene glycol (PEG) precipitation-by determining their optimal working concentrations. Enriched viral RNA was quantified using reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR), and recovery rates were calculated and compared between the two methods. The results showed that the iron flocculation achieved maximal recovery (62.447%) at a final Fe³⁺ concentration of 0.1 mg/L. In contrast, the PEG precipitation method yielded a maximum recovery rate of only 5.760% at a PEG8000 concentration of 50 g/L. Statistical analysis confirmed that the iron flocculation method recovered significantly more viral RNA than the PEG precipitation method (p ＜0.05). These results demonstrate that this study established two enrichment methods for H1N1 influenza virus in environmental waters, providing reliable technical support for influenza virus in environmental waters. This work provides a technical foundation for waterborne viral surveillance. The choice between methods can be adapted based on practical monitoring needs.

Keywords H1N1 influenza virus; virus enrichment; iron flocculation; polyethylene glycol (PEG) precipitation method

基金项目：海关总署科研项目（2024HK306）

第一作者：周傲白雪（1994—），女，汉族，河北保定人，硕士，兽医师，主要从事动物检疫防控技术研究工作，E-mail: zabx0808@163.com

通信作者：陈轩（1983—），男，汉族，广东梅州人，硕士，正高级兽医师，主要从事动物检疫鉴定技术研究工作，E-mail: 65561977@qq.com

1. 拱北海关技术中心 珠海 519015

1. Technology Center of Gongbei Customs District, Zhuhai 519015

随着全球气候变化和人类活动范围的不断扩大，流感病毒等病原微生物在环境中的传播风险持续增加^[1-2]。甲型流感病毒（Influenza A virus）作为一种高度传染性的呼吸道病毒，主要通过气溶胶传播，有研究表明其在水体环境中也可保持较长时间的感染活性^[3-4]。H1N1是甲型流感病毒的重要致病亚型，Brown等^[5]研究表明H1N1在4℃水环境中可维持传染性达77.7 d。水体环境具有复杂性、流动性及病毒浓度低的特点，直接检测病毒难度较大，因此建立高效、稳定的病毒富集方法成为亟待解决的关键问题。

目前常用的水体中病毒富集方法主要包括絮凝沉淀法、超滤法、聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）沉淀法、磁珠富集法以及免疫磁性纳米颗粒法等。其中，絮凝沉淀法和PEG沉淀法是较为常用的富集方法。铁絮凝法通过Fe³⁺絮凝作用使病毒颗粒聚集，该方法操作简便、成本低廉，能有效去除杂质干扰，已被成功应用于鲤疱疹病毒Ⅱ型等水生病毒的检测^[4]。PEG沉淀法利用其高亲水性在特定盐浓度下促进病毒颗粒聚集沉淀，在诺如病毒等病原体的富集浓缩中得到广泛应用^{[2, 4, 6]}。

尽管两种方法在病毒富集领域各有特点，但针对H1N1流感病毒的富集方法与效率比较的研究尚未见系统性报道。H1N1流感病毒为分节段的RNA病毒，其易变性和脆弱性对富集方法要求较高。同时，水体环境的复杂性也可能对富集方法的选择提出更苛刻的要求。本研究以H1N1流感病毒为对象，结合反转录实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR）技术，优化铁絮凝法和PEG沉淀富集方法，并评估其在水体样本中流感病毒的富集效率，为水体环境中流感病毒的监测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Nalgene可重复使用过滤装置（美国赛默飞世尔科技公司）；无油真空泵（广州华誉仪器科技有限公司）；磁力搅拌器（群安科学仪器有限公司）；Q5实时荧光PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；0.8 μm聚碳酸酯膜（英国沃特曼公司）；氯化高铁六水（生工生物工程股份有限公司）；聚乙二醇（生工生物工程股份有限公司）；氯化钠（生工生物工程股份有限公司）；FastPure Complex Tissue/Cell Total RNA Isolation Kit RNA提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；Evo M-MLV一步法 RT-qPCR 试剂盒（探针法）（艾科瑞生物有限公司）。本实验引物探针均由生工生物工程股份有限公司合成。本次实验使用的H1N1病毒株为本实验室保存的灭活样本。

1.2 水样制备

实验水样的制备采用200 μL病毒原液加至800 mL水中，混匀后分成7组，其中，4组为100 mL水样，3组为70 mL水样，现配现用。

1.3 病毒富集

1.3.1 铁絮凝法

向4组制备后的100 mL水体中分别添加10 μL、50 μL、100 μL、1 mL 的1 g/L FeCl₃· 6H₂O絮凝剂，使Fe³⁺终浓度分别为0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、10 mg/L，磁力搅拌器搅拌30 min。将处理后的水样使用0.8 μm孔径的聚碳酸酯膜负压过滤，收集滤膜并用剪刀剪碎，与留存的500 μL原水样一并进行核酸提取，比较回收率确定Fe³⁺使用浓度。

1.3.2 PEG沉淀法

向3组制备后的70 mL水体中添加1.17 g NaCl，每组分别添加 3.5 g、7 g、10.5 g PEG 8000粉末，上下颠倒混匀，使其终浓度分别为50 g/L、100 g/L、150 g/L，4℃静置24 h。将处理后的水样8000 r/min离心40 min，缓慢倒掉上层液体，留取沉淀；取1.5 mL 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）重悬沉淀后，转移至 1.5 mL 离心管中，-20℃保存，与留存的500 μL原水样一并进行核酸提取，比较回收率确定PEG 8000使用浓度。

1.4 核酸提取与检测

按照RNA提取试剂盒的说明书对样品进行RNA 提取，使用GB/T 18936—2020《高致病性禽流感诊断技术》中禽流感RT-qPCR方法M基因的引物探针对上述样品进行检测。

1.5 标准曲线制备

以本实验室保存的H1N1流感病毒样本（已灭活）为绘制标准曲线的标准品，用紫外分光光度计测定其浓度，再将浓度换算成拷贝数。将标准品1∶10倍比稀释5个稀释度，分别为1∶10²、1∶10³、1∶10⁴、1∶10⁵、1∶10⁶。按照样品检测条件进行标准品检测，以稀释标准品浓度的lg值（X）对Ct值（Y）制备标准曲线。

1.6 回收率的测定

将样品RT-qPCR检测结果代入标准曲线中，计算提取的核酸浓度。根据公式回收率=（富集后样本病毒浓度×体积）/（富集前样本病毒浓度×体积）×100%计算病毒回收率，并进行比较。

1.7 统计学分析

采用Excel和GraphPad Prism 8软件进行数据统计和分析。所有数据用（平均值±标准差）来表示，使用t检验分析两种方法间回收率的差异，p＜0. 05为差异有统计学意义，ns代表无显著性差异。

2 结果

2.1 标准曲线的建立

将制备的所有梯度标准品进行RT-qPCR检测，获得对应的Ct值，分析显示5个值具有良好线性关系，如图1所示。拟合的标准曲线公式为Y = -3.5365X+ 44.763（R = 0.9974）。

图1 HINI病毒标准曲线

Fig.1 Standard curve of H1N1 influenza virus

2.2 H1N1流感病毒富集方法的建立

2.2.1 铁絮凝法

本研究通过添加不同剂量的FeCl₃· 6H₂O絮凝剂（10 μL、50 μL、100 μL、1 mL，对应Fe³⁺终浓度分别为0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、10 mg/L）优化病毒富集条件。每组设置双平行实验，经病毒富集后采用RT-qPCR检测，记录平均Ct值并计算回收率。结果表明，当Fe³⁺终浓度为0.1 mg/L时，病毒富集效果显著优于其他浓度组（p＜0.05），最高回收率达62.447%，见表1。因此，确定H1N1流感病毒富集的最佳Fe³⁺终浓度为0.1 mg/L。

2.2.2 PEG沉淀法

本实验设置了3个浓度梯度（50 g/L、100 g/L、150 g/L），每组进行双平行检测，通过RT-qPCR测定病毒回收率。结果显示，50 g/L PEG 8000处理组的病毒富集效果显著优于高浓度组（p＜0.05），回收率达到5.760%（表2）。基于此，最终确定50 g/L为H1N1流感病毒富集的最佳PEG 8000工作浓度。

2.3 两种方法对H1N1流感病毒富集的回收率比较

本研究系统比较了铁絮凝法与 PEG沉淀法对H1N1流感病毒的富集效果。实验数据显示，两种方法在最佳工作浓度下（Fe³⁺ 0.1 mg/L和PEG8000 50 g/L）均能有效富集病毒，但富集效率存在显著差异。铁絮凝法表现出更优异的病毒回收能力，铁絮凝法Ct值降低幅度（ΔCt = 9.264）显著高于PEG沉淀法（ΔCt = 2.067），铁絮凝法的病毒回收率（62.447%）较PEG沉淀法（5.760%）提升10.8倍（p＜0.05）。

3 讨论

近年来，随着社会经济发展和公共卫生研究的深入，环境水体被病原污染导致的公共卫生安全风险日益突出，水体中病原微生物的监测已成为公共卫生领域的重要课题。甲型流感传染性强、变异快，可能引发高热、肺炎等严重并发症，是危害严重的人兽共患病之一。其长期存在、频繁变异和跨物种传播的能力，很大程度上源于病毒在水禽自然宿主群体及其栖息水环境中的持续循环与保藏^[7]。田国斌等^[8]研究证实，环境（特别是水体）保毒是禽流感得以长期存在和传播的重要因素和媒介。通常情况下，病毒在水中的浓度非常低，直接检测难以检出，需要对大体积液体样本进行富集浓缩后再检测。在常用的富集方法中，无机絮凝法沉淀法是将Fe³⁺或Al³⁺等化学类的絮凝剂加入待测水样，通过形成沉淀的方式对病毒进行富集浓缩，具有操作简单、成本低的优点^[4]，但其富集效率易受水质（如浊度、pH）影响。PEG沉淀法则利用PEG的脱水效应促使病毒颗粒聚集沉淀，操作简单，适用于多种病毒，但用时较长，对环境和离心设备具有一定的要求。本研究针对水体中病毒浓度低、直接检测困难的技术瓶颈，通过优化实验条件，系统建立了H1N1流感病毒铁絮凝法和PEG沉淀法两种富集方法，并对其富集性能进行了比较，为水体中H1N1流感病毒监测提供了方法参考。

富集效率结果显示，铁絮凝法在0.1 mg/L Fe³⁺条件病毒平均回收率为62.447%，显著高于PEG沉淀法（5.760%）。这一差异可能源于两种方法的作用机制不同。铁絮凝法通过Fe³⁺与病毒表面糖蛋白的特异性结合及电荷中和效应实现高效富集。本实验中铁絮凝法在浓度超过0.1 mg/L时回收率急剧下降，这可能是由于过量Fe³⁺导致病毒颗粒过度聚集，形成不稳定的絮体，从而降低目标物的回收率^[9]。

PEG沉淀法在本研究中的回收率介于0.911%～5.760%之间，当PEG 8000浓度为50 g/L时回收率达到最高，继续增加浓度反而导致回收效率降低。对比铁絮凝法回收率结果，PEG沉淀法对H1N1流感病毒的富集效率有限。这可能是因为该方法主要依靠空间位阻效应使病毒颗粒聚集，其温和的作用方式虽然有利于保持病毒完整性，但富集效率相对较低^[10]。在实际应用中应根据样本形式和需求选择适宜的方法，以获得最佳富集效果。

综上所述，本研究建立了水体中H1N1流感病毒的两种富集方法并进行对比，为流感病毒的环境监测提供了可靠的技术支持，也为其他病原微生物的水体富集研究提供了重要参考。未来的研究将会通过考虑病毒核酸完整性、操作便捷性和成本效益等多方因素，进一步优化富集条件，建立更全面的方法评价体系。

参考文献

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[2] 普春敏, 陈丽丽, 索玉娟, 等. 食品中诺如病毒的分离、富集与分子检测技术研究进展[J]. 上海农业学报, 2024, 40(5): 131-141.

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[10] 普春敏, 陈丽丽, 索玉娟, 等. 食品中诺如病毒的分离、富集与分子检测技术研究进展[J]. 上海农业学报, 2024, 40(5): 131-141.

表1 铁絮凝法对水体中HINI病毒的回收率结果

Table 1 Recovery rates of HINI influenza virus in water using the iron flocculation method

表2 PEG沉淀法对水体中HINI病毒的回收率结果

Table 2 Recovery rates of HINI influenza virus in water using the PEG precipitation method