董卓 周艳 吴畅 钟洁 龚睿 栾秀丽 秦勇 武长礼

周傲白雪 ¹ 赵福振 ¹ 张 洪 ¹ 罗宝正 ¹ 陈 轩 ^{1 *}

摘 要 针对水体中H1N1流感病毒检测灵敏度不足的问题，本研究通过优化铁絮凝法和聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）沉淀法的最佳工作浓度，建立了两种水体中H1N1流感病毒富集方法，联合采用反转录实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR）进行检测，计算并比较回收率。结果表明，当Fe³⁺终浓度为0.1 mg/L时，铁絮凝法病毒富集效果显著优于其他浓度组，最高回收率达62.447%；PEG 8000浓度为50 g/L时，回收率最高为5.760%。根据回收率比较结果，铁絮凝法富集的病毒核酸量显著高于聚乙二醇（PEG）沉淀法（p ＜0.05）。本研究建立的水体中H1N1流感病毒的两种富集方法，为水体流感病毒监测提供了可靠的技术支持，实际应用中可根据需求选择方法应用。

关键词 H1N1流感病毒；病毒富集；铁絮凝法；聚乙二醇沉淀法

Optimization and Comparison of Two Enrichment Methods for H1N1 Influenza Virus in Water

ZHOU Ao-BaiXue ¹ ZHAO Fu-Zhen ¹ ZHANG Hong ¹ LUO Bao-Zheng ¹ CHEN Xuan ^1*

Abstract To enhance the sensitivity indetecting H1N1 influenza virus in water, this study optimized two viral enrichment methods-iron flocculation and polyethylene glycol (PEG) precipitation-by determining their optimal working concentrations. Enriched viral RNA was quantified using reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR), and recovery rates were calculated and compared between the two methods. The results showed that the iron flocculation achieved maximal recovery (62.447%) at a final Fe³⁺ concentration of 0.1 mg/L. In contrast, the PEG precipitation method yielded a maximum recovery rate of only 5.760% at a PEG8000 concentration of 50 g/L. Statistical analysis confirmed that the iron flocculation method recovered significantly more viral RNA than the PEG precipitation method (p ＜0.05). These results demonstrate that this study established two enrichment methods for H1N1 influenza virus in environmental waters, providing reliable technical support for influenza virus in environmental waters. This work provides a technical foundation for waterborne viral surveillance. The choice between methods can be adapted based on practical monitoring needs.

Keywords H1N1 influenza virus; virus enrichment; iron flocculation; polyethylene glycol (PEG) precipitation method

基金项目：海关总署科研项目（2024HK306）

第一作者：周傲白雪（1994—），女，汉族，河北保定人，硕士，兽医师，主要从事动物检疫防控技术研究工作，E-mail: zabx0808@163.com

通信作者：陈轩（1983—），男，汉族，广东梅州人，硕士，正高级兽医师，主要从事动物检疫鉴定技术研究工作，E-mail: 65561977@qq.com

1. 拱北海关技术中心 珠海 519015

1. Technology Center of Gongbei Customs District, Zhuhai 519015

随着全球气候变化和人类活动范围的不断扩大，流感病毒等病原微生物在环境中的传播风险持续增加^[1-2]。甲型流感病毒（Influenza A virus）作为一种高度传染性的呼吸道病毒，主要通过气溶胶传播，有研究表明其在水体环境中也可保持较长时间的感染活性^[3-4]。H1N1是甲型流感病毒的重要致病亚型，Brown等^[5]研究表明H1N1在4℃水环境中可维持传染性达77.7 d。水体环境具有复杂性、流动性及病毒浓度低的特点，直接检测病毒难度较大，因此建立高效、稳定的病毒富集方法成为亟待解决的关键问题。

目前常用的水体中病毒富集方法主要包括絮凝沉淀法、超滤法、聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）沉淀法、磁珠富集法以及免疫磁性纳米颗粒法等。其中，絮凝沉淀法和PEG沉淀法是较为常用的富集方法。铁絮凝法通过Fe³⁺絮凝作用使病毒颗粒聚集，该方法操作简便、成本低廉，能有效去除杂质干扰，已被成功应用于鲤疱疹病毒Ⅱ型等水生病毒的检测^[4]。PEG沉淀法利用其高亲水性在特定盐浓度下促进病毒颗粒聚集沉淀，在诺如病毒等病原体的富集浓缩中得到广泛应用^{[2, 4, 6]}。

尽管两种方法在病毒富集领域各有特点，但针对H1N1流感病毒的富集方法与效率比较的研究尚未见系统性报道。H1N1流感病毒为分节段的RNA病毒，其易变性和脆弱性对富集方法要求较高。同时，水体环境的复杂性也可能对富集方法的选择提出更苛刻的要求。本研究以H1N1流感病毒为对象，结合反转录实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR）技术，优化铁絮凝法和PEG沉淀富集方法，并评估其在水体样本中流感病毒的富集效率，为水体环境中流感病毒的监测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Nalgene可重复使用过滤装置（美国赛默飞世尔科技公司）；无油真空泵（广州华誉仪器科技有限公司）；磁力搅拌器（群安科学仪器有限公司）；Q5实时荧光PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；0.8 μm聚碳酸酯膜（英国沃特曼公司）；氯化高铁六水（生工生物工程股份有限公司）；聚乙二醇（生工生物工程股份有限公司）；氯化钠（生工生物工程股份有限公司）；FastPure Complex Tissue/Cell Total RNA Isolation Kit RNA提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；Evo M-MLV一步法 RT-qPCR 试剂盒（探针法）（艾科瑞生物有限公司）。本实验引物探针均由生工生物工程股份有限公司合成。本次实验使用的H1N1病毒株为本实验室保存的灭活样本。

1.2 水样制备

实验水样的制备采用200 μL病毒原液加至800 mL水中，混匀后分成7组，其中，4组为100 mL水样，3组为70 mL水样，现配现用。

1.3 病毒富集

1.3.1 铁絮凝法

向4组制备后的100 mL水体中分别添加10 μL、50 μL、100 μL、1 mL 的1 g/L FeCl₃· 6H₂O絮凝剂，使Fe³⁺终浓度分别为0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、10 mg/L，磁力搅拌器搅拌30 min。将处理后的水样使用0.8 μm孔径的聚碳酸酯膜负压过滤，收集滤膜并用剪刀剪碎，与留存的500 μL原水样一并进行核酸提取，比较回收率确定Fe³⁺使用浓度。

1.3.2 PEG沉淀法

向3组制备后的70 mL水体中添加1.17 g NaCl，每组分别添加 3.5 g、7 g、10.5 g PEG 8000粉末，上下颠倒混匀，使其终浓度分别为50 g/L、100 g/L、150 g/L，4℃静置24 h。将处理后的水样8000 r/min离心40 min，缓慢倒掉上层液体，留取沉淀；取1.5 mL 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）重悬沉淀后，转移至 1.5 mL 离心管中，-20℃保存，与留存的500 μL原水样一并进行核酸提取，比较回收率确定PEG 8000使用浓度。

1.4 核酸提取与检测

按照RNA提取试剂盒的说明书对样品进行RNA 提取，使用GB/T 18936—2020《高致病性禽流感诊断技术》中禽流感RT-qPCR方法M基因的引物探针对上述样品进行检测。

1.5 标准曲线制备

以本实验室保存的H1N1流感病毒样本（已灭活）为绘制标准曲线的标准品，用紫外分光光度计测定其浓度，再将浓度换算成拷贝数。将标准品1∶10倍比稀释5个稀释度，分别为1∶10²、1∶10³、1∶10⁴、1∶10⁵、1∶10⁶。按照样品检测条件进行标准品检测，以稀释标准品浓度的lg值（X）对Ct值（Y）制备标准曲线。

1.6 回收率的测定

将样品RT-qPCR检测结果代入标准曲线中，计算提取的核酸浓度。根据公式回收率=（富集后样本病毒浓度×体积）/（富集前样本病毒浓度×体积）×100%计算病毒回收率，并进行比较。

1.7 统计学分析

采用Excel和GraphPad Prism 8软件进行数据统计和分析。所有数据用（平均值±标准差）来表示，使用t检验分析两种方法间回收率的差异，p＜0. 05为差异有统计学意义，ns代表无显著性差异。

2 结果

2.1 标准曲线的建立

将制备的所有梯度标准品进行RT-qPCR检测，获得对应的Ct值，分析显示5个值具有良好线性关系，如图1所示。拟合的标准曲线公式为Y = -3.5365X+ 44.763（R = 0.9974）。

图1 HINI病毒标准曲线

Fig.1 Standard curve of H1N1 influenza virus

2.2 H1N1流感病毒富集方法的建立

2.2.1 铁絮凝法

本研究通过添加不同剂量的FeCl₃· 6H₂O絮凝剂（10 μL、50 μL、100 μL、1 mL，对应Fe³⁺终浓度分别为0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、10 mg/L）优化病毒富集条件。每组设置双平行实验，经病毒富集后采用RT-qPCR检测，记录平均Ct值并计算回收率。结果表明，当Fe³⁺终浓度为0.1 mg/L时，病毒富集效果显著优于其他浓度组（p＜0.05），最高回收率达62.447%，见表1。因此，确定H1N1流感病毒富集的最佳Fe³⁺终浓度为0.1 mg/L。

2.2.2 PEG沉淀法

本实验设置了3个浓度梯度（50 g/L、100 g/L、150 g/L），每组进行双平行检测，通过RT-qPCR测定病毒回收率。结果显示，50 g/L PEG 8000处理组的病毒富集效果显著优于高浓度组（p＜0.05），回收率达到5.760%（表2）。基于此，最终确定50 g/L为H1N1流感病毒富集的最佳PEG 8000工作浓度。

2.3 两种方法对H1N1流感病毒富集的回收率比较

本研究系统比较了铁絮凝法与 PEG沉淀法对H1N1流感病毒的富集效果。实验数据显示，两种方法在最佳工作浓度下（Fe³⁺ 0.1 mg/L和PEG8000 50 g/L）均能有效富集病毒，但富集效率存在显著差异。铁絮凝法表现出更优异的病毒回收能力，铁絮凝法Ct值降低幅度（ΔCt = 9.264）显著高于PEG沉淀法（ΔCt = 2.067），铁絮凝法的病毒回收率（62.447%）较PEG沉淀法（5.760%）提升10.8倍（p＜0.05）。

3 讨论

近年来，随着社会经济发展和公共卫生研究的深入，环境水体被病原污染导致的公共卫生安全风险日益突出，水体中病原微生物的监测已成为公共卫生领域的重要课题。甲型流感传染性强、变异快，可能引发高热、肺炎等严重并发症，是危害严重的人兽共患病之一。其长期存在、频繁变异和跨物种传播的能力，很大程度上源于病毒在水禽自然宿主群体及其栖息水环境中的持续循环与保藏^[7]。田国斌等^[8]研究证实，环境（特别是水体）保毒是禽流感得以长期存在和传播的重要因素和媒介。通常情况下，病毒在水中的浓度非常低，直接检测难以检出，需要对大体积液体样本进行富集浓缩后再检测。在常用的富集方法中，无机絮凝法沉淀法是将Fe³⁺或Al³⁺等化学类的絮凝剂加入待测水样，通过形成沉淀的方式对病毒进行富集浓缩，具有操作简单、成本低的优点^[4]，但其富集效率易受水质（如浊度、pH）影响。PEG沉淀法则利用PEG的脱水效应促使病毒颗粒聚集沉淀，操作简单，适用于多种病毒，但用时较长，对环境和离心设备具有一定的要求。本研究针对水体中病毒浓度低、直接检测困难的技术瓶颈，通过优化实验条件，系统建立了H1N1流感病毒铁絮凝法和PEG沉淀法两种富集方法，并对其富集性能进行了比较，为水体中H1N1流感病毒监测提供了方法参考。

富集效率结果显示，铁絮凝法在0.1 mg/L Fe³⁺条件病毒平均回收率为62.447%，显著高于PEG沉淀法（5.760%）。这一差异可能源于两种方法的作用机制不同。铁絮凝法通过Fe³⁺与病毒表面糖蛋白的特异性结合及电荷中和效应实现高效富集。本实验中铁絮凝法在浓度超过0.1 mg/L时回收率急剧下降，这可能是由于过量Fe³⁺导致病毒颗粒过度聚集，形成不稳定的絮体，从而降低目标物的回收率^[9]。

PEG沉淀法在本研究中的回收率介于0.911%～5.760%之间，当PEG 8000浓度为50 g/L时回收率达到最高，继续增加浓度反而导致回收效率降低。对比铁絮凝法回收率结果，PEG沉淀法对H1N1流感病毒的富集效率有限。这可能是因为该方法主要依靠空间位阻效应使病毒颗粒聚集，其温和的作用方式虽然有利于保持病毒完整性，但富集效率相对较低^[10]。在实际应用中应根据样本形式和需求选择适宜的方法，以获得最佳富集效果。

综上所述，本研究建立了水体中H1N1流感病毒的两种富集方法并进行对比，为流感病毒的环境监测提供了可靠的技术支持，也为其他病原微生物的水体富集研究提供了重要参考。未来的研究将会通过考虑病毒核酸完整性、操作便捷性和成本效益等多方因素，进一步优化富集条件，建立更全面的方法评价体系。

参考文献

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[2] 普春敏, 陈丽丽, 索玉娟, 等. 食品中诺如病毒的分离、富集与分子检测技术研究进展[J]. 上海农业学报, 2024, 40(5): 131-141.

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[9] 王红宇. 高浓度聚合氯化铁絮凝剂的应用基础研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2004.

[10] 普春敏, 陈丽丽, 索玉娟, 等. 食品中诺如病毒的分离、富集与分子检测技术研究进展[J]. 上海农业学报, 2024, 40(5): 131-141.

表1 铁絮凝法对水体中HINI病毒的回收率结果

Table 1 Recovery rates of HINI influenza virus in water using the iron flocculation method

表2 PEG沉淀法对水体中HINI病毒的回收率结果

Table 2 Recovery rates of HINI influenza virus in water using the PEG precipitation method

第7卷 第8期

2025年8月

Health Quarantine / 卫生检疫

广谱病原多重聚合酶链式反应

在口岸传染病检测中的应用

董 卓 ¹ 周 艳 ¹ 吴 畅 ¹ 钟 洁 ¹ 龚 睿 ¹ 栾秀丽 ¹ 秦 勇 ¹ 武长礼 ^{1 *}

摘 要 为加强对广谱病原多重聚合酶链式反应（Multiplex Polymerase Chain Reaction）技术在口岸传染病检测中的应用探索，本研究通过对100例咽拭子样本核酸进行常规PCR和广谱病原多重PCR检测结果进行对比发现，相较于常规PCR检测方式，广谱病原多重PCR检测具有一定优势，其中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌检出优势显著，对比差异具有统计学意义。另外，通过采用高效快速、操作简单的广谱病原多重PCR检测技术进行口岸传染病检测，初步评价分析该技术在口岸传染病检测中的应用价值。研究表明，该技术在提高检出率的同时可缩短检测时效，为口岸卫生检疫提供更有力的技术支撑。

关键词 多重聚合酶链式反应；口岸；传染病；检测

The Application of Broad-Spectrum Pathogen Multiplex Polymerase Chain Reaction in the Detection of Infectious Diseases at Ports

DONG Zhuo¹ ZHOU Yan¹ WU Chang¹ ZHONG Jie¹

GONG Rui¹ LUAN Xiu-Li¹ QIN Yong¹ WU Chang-Li^1*

Abstract In order to further explore the application of broad-spectrum pathogen multiplex polymerase chain reaction (multiplex PCR) technology in the detection of infectious diseases at ports, this study compared the nucleic acid detection results of 100 pharyngeal swab samples using conventional PCR and broad-spectrum pathogen multiplex PCR. It was found that compared with the conventional PCR detection method, broad-spectrum pathogen multiplex PCR had certain advantages, among which the detection of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis have significant advantages, and the comparison difference is statistically significant. This paper uses the broad-spectrum pathogen multiplex PCR detection method that is efficient, rapid and simple to conduct port infectious disease detection. It preliminarily evaluates and analyzes the application value of this technology in port infectious disease detection. The results show that this technology can improve the detection rate and shorten the detection time, and provide more powerful technical support for port health quarantine.

Keywords multiplex PCR; port; infectious disease; detection

基金项目：武汉海关科研项目（2023WK014）

第一作者：董卓（1993—），男，汉族，湖北孝感人，硕士，工程师，主要从事口岸传染病实验室检测工作，E-mail: dongzhuo_dz@163.com

通信作者：武长礼（1986—），男，汉族，湖北孝感人，硕士，主治医师，主要从事口岸传染病监测与防控研究工作，E-mail: changliw2018@163.com

1. 湖北国际旅行卫生保健中心（武汉海关口岸门诊部） 武汉 430070

1. Hubei International Travel Health Care Center (Outpatient Department of Wuhan Customs Port), Wuhan 430070

广谱病原多重聚合酶链式反应（Multiplex Polymerase Chain Reaction）技术，简称广谱病原多重PCR，‌其利用聚合酶链反应技术，对多类病原体进行有效检出^[1-2]。近年来，广谱病原多重PCR技术在临床诊断学，尤其是与感染相关的疾病诊断以及监测方面应用率较高^[3-4]‌，但其在口岸传染病检测中的应用报道较少。

当前，国际上霍乱、黄热病、登革热、猴痘、拉沙热等传染病疫情频发^[5-6]。“多病同检”是一项重要工作，需严防各类传染病的跨境传播^[7]。对于入境人员不明原因发热等症状，实验室需精准定位找出病因，如何快速有效且成本可控地确定病原体是当前工作的一个难点^[8]。开展广谱病原多重PCR在口岸传染病检测中的应用不仅能够优化实验室技术工作，实现降本增效，更是为守牢外防输入关口提供有力的技术支撑。

用于识别病原体的传统检测方法包括微生物培养、血清学检测以及PCR等，这些传统方法虽然可以诊断和鉴别呼吸道病原体^[9]，但都有一定的缺陷，比如：培养法耗费时间长，且可培养微生物有限，难以满足检测需求；免疫学方法面临特异性较差以及窗口期的问题；病原体核酸的聚合酶链反应技术方法多，但仅能定性检测常见病原体，而定量PCR仅局限于病毒及部分特定细菌的检测^[10]。宏基因组测序存在性价比低、特殊病原体检测能力不足等问题^[11]。目前在口岸传染病筛查中，尚没有能兼具快速、准确、成本低等特性的方法精准找出病原体。因此，本研究针对广谱病原多重PCR技术应用于口岸传染病检测的可行性进行研究。

1 材料与方法

本研究主要对常规PCR检测以及广谱病原多重PCR在口岸传染病检测中的应用效果进行对比分析。样本来源为武汉口岸出入境法定监测对象且有呼吸道症状人员，均签署了采样知情同意书。随机选取2024年1月—2024年11月咽拭子样本100例。提取样本DNA/RNA，应用广谱病原多重PCR技术靶向富集病原体核酸，再结合实时荧光定量PCR技术（qPCR），提供包括细菌、真菌、病毒、分枝杆菌、支原体/衣原体等36种常见病原微生物检测，检测范围见表1。

1.1 材料与试剂

常规PCR试剂（湖北朗德医疗科技有限公司、上海之江生物科技股份有限公司、上海伯杰医疗科技股份有限公司）；广谱病原通用扩增试剂（上海冰缘医疗科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

荧光定量PCR仪 CFX96（Bio-Rad Laborato- ries）；全自动核酸提取仪S-48（武汉纳磁生物科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 核酸提取

在生物安全柜中将咽拭子折断，直接放入预装玻璃珠（0.1 mm & 0.5 mm）的研磨管中，加入1.0 mL无菌PBS缓冲液，将研磨管置于恒温震荡金属浴上56℃，600 rpm震荡混匀10 min。弃去管中拭子。

向研磨管中加入20 μL核酸保护剂NP、40 μL裂解加强液SD，涡旋混匀后短暂离心，然后再加入20 μL蛋白酶K，涡旋混匀并短暂离心。随后将研磨管转至恒温金属浴中，70℃温浴20 min后将研磨管取出，涡旋震荡混匀30 s，然后瞬时离心30 s，将研磨管转移至生物安全柜中，进行DNA/RNA的提取与纯化，具体操作方法按说明书执行（磁珠法液体样本病原微生物总核酸提取试剂盒，CJ0004）。

1.3.2 核酸富集

吸取样本核酸10 μL加入分装有富集试剂的PCR管中，密封后使用离心机离心。按说明书中的核酸富集反应程序进行扩增，具体操作方法依照说明书执行（广谱病原通用扩增试剂盒Ⅰ型说明书）。

1.3.3 qPCR扩增

使用移液器吸取15 μL富集产物，连续加入装有试剂的相应区域，完毕后震荡混匀，按加样顺序，使用荧光定量PCR仪进行扩增检测，具体操作方法按说明书执行（广谱病原通用扩增试剂盒Ⅰ型说明书）。

1.3.4 结果分析

根据荧光定量PCR仪显示的各通道扩增曲线以及导出的Ct值结果判断各样本的总体病原检出结果。然后，对比统计分析广谱病原多重PCR技术与常规PCR技术在口岸传染病检出情况，初步评价分析该技术在口岸传染病检测中的应用价值。

1.4 统计学处理

本研究中所有数据收集后经Excel 2024进行录入，统计学软件应用SPSS 27.0进行处理分析，采用频数或构成比（%）进行表示计数数据，通过χ²检验比较两种检测方法差异，以P＜0.05认为数据对比差异具有统计学意义。

2 结果

本研究中100份样本实验室检测结果显示，单传染病菌检出率最高的是甲型流感病毒（18%）以及腺病毒（14%），肺炎支原体（2%）以及新型冠状病毒（5%）检出率最低，另有肺炎链球菌+新型冠状病毒以及肺炎链球菌+甲型流感病毒的多重传染病菌检出的情况。

根据广谱病原多重PCR检测结果，流感嗜血杆菌检出率最高为75%，其次是肺炎链球菌检出率为37%，相较于实验室常规检测，甲型流感病毒（22%）、腺病毒（15%）、人鼻病毒（15%）、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）（12%）、肺炎支原体（3%）、白色念珠菌（1%）、巨细胞病毒（2%）以及卡他莫拉菌（4%）的检测中优势显著。

由常规PCR检测与广谱病原多重PCR检测结果可见，相较于常规检测方法，广谱病原多重PCR检测检出甲型流感病毒22例（常规PCR检出18例）、腺病毒检出15例（常规PCR检出14例）、乙型流感病毒检出12例（常规PCR检出12例）、人鼻病毒检出15例（常规PCR检出11例）、肺炎链球菌检出37例（常规PCR检出8例）、副流感病毒检出10例（常规PCR检出10例）、流感嗜血杆菌检出75例（常规PCR检出10例）、呼吸道合胞病毒检出5例（常规PCR检出5例）、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）检出12例（常规PCR检出5例）、肺炎支原体检出3例（常规PCR检出2例）、巨细胞病毒检出2例（常规PCR检出0例）、卡他莫拉菌检出4例（常规PCR检出0例）、金黄色葡萄球菌检出1例（常规PCR检出0例）、白色念珠菌检出1例（常规PCR检出0例），其中，肺炎链球菌检出（χ² = 24.115，P＜0.001）、流感嗜血杆菌检出（χ² = 86.445，P＜0.001）、卡他莫拉菌检出（χ² = 4.082，P = 0.043，＜0.05）对比差异具有统计学意义，见表2。

表2 实验室常规PCR检测与广谱病原多重PCR检测的

对比分析

Table 2 Comparative analysis of conventional PCR detection and broad-spectrum pathogen multiplex PCR detection

in the laboratory

3 讨论

PCR作为一项基因扩增技术，由于其简单易操作的特点，已经得到了广泛应用。然而，常规PCR检测范围较窄，检测项目单一，并存在假阴性结果的可能性，比如PCR仪器的设计理念不同，以及频繁出现的温度控制误差等质量问题。离心机的品质或者操作方法的错误导致了离心标本模板未能完全分离^[12]。在临床实验中，如果样本中的抑制物被完全剔除，目标核酸的遗失以及在样本或核酸纯化过程中遇到了提取试剂的残余、扩增反应抑制物等问题，都可能出现假阴性结果。

相较于实验室常规PCR检测，首先，广谱病原多重PCR技术病原体检测范围覆盖常见细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒、非典型病原体共计36种，不仅满足对常见传染性病原体的常规检测，而且能够对由细菌、病毒、真菌、非典型病原体等引起的不明原因发热进行一次性检测，可为“多病同检”提供思路和有效的操作流程。其次，广谱病原多重PCR耗时较短，全实验流程可控制在5 h内完成，相同检测项目下普通PCR全实验流程需要3 d，宏基因组测序全实验流程需要1～2 d，并且主要设备为荧光定量PCR仪，该检测技术在不需额外购置设备的前提下，即可在分子生物学实验室开展检测，可有效缩短检测时效和控制设施设备成本。再次，相比普通PCR及宏基因组测序，广谱病原多重PCR检测试剂成本更低。最后，通过100例咽拭子样本数据比对，该技术不仅在传统传染病检测方面优势明显，并且在流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）、人鼻病毒、甲型流感病毒、肺炎支原体、巨细胞病毒、卡他莫拉菌、白色念珠菌等病原体检测中均具有一定优势，其中在肺炎链球菌、甲型流感病毒、人鼻病毒、流感嗜血杆菌以及卡他莫拉菌的检测中优势显著。与此同时，本方案检测项目可覆盖新冠检测，操作简单，无需额外配置设备与人员。

但是，由于该检测技术涵盖病原体范围较广，加之灵敏性较高，使得检出人体定值菌的概率高于常规PCR，如本次结果中的流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等。所以，其检测结果需要结合实际情况综合判断。另外，该实验流程为二步法PCR，即第一步PCR扩增产物需要经过转管后，进行第二轮的荧光定量PCR检测，在转管期间存在污染的风险，对操作人员要求较高。为此，可采取风险防控措施有效降低污染风险：一是核酸富集步骤的PCR扩增产物转管，使用的八连管经密封袋密封后转移到生物安全柜内进行操作；二是在实验过程设置阴性对照、阳性对照，在转管过程设置环境对照，监测实验过程及实验环境是否发生污染，保证检测结果的有效性。

综上所述，广谱病原多重PCR技术能够一次性检测数十种常见病原体，性价比高，在提高实验室“多病同检”能力、提升检测效能、降低检测成本，以及维护口岸公共卫生安全方面具有重要作用。

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表1 qPCR广谱病原多重检测试剂检测病原体范围

Table 1 Range of pathogens detected by qPCR broad-spectrum pathogen multiplex detection reagents