李丹丹 李佳潼 安微 王朝政 韩佃刚 艾军 王丹云 赵芳

李丹丹 ¹ 李佳潼 ¹ 安 微 ² 王朝政 ³ 韩佃刚 ⁴ 艾 军 ⁴ 王丹云 ^{3 *} 赵 芳 ^{5 *}

摘 要 为快速准确地检测小肠结肠炎耶尔森氏菌，本研究选取小肠结肠炎耶尔森氏菌16s rRNA设计引物探针，建立了一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法。结果表明，方法的灵敏度为10 fg/mL，与22株非小肠结肠炎耶尔森氏菌无交叉反应。用本方法检测小肠结肠炎耶尔森氏菌人工污染的鸡肉样本，检测结果与国家标准方法检测结果一致。本研究建立的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光PCR方法具有良好的特异性和灵敏性，操作简便易行，可以用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测。

关键词 小肠结肠炎耶尔森氏菌；16S rRNA；实时荧光聚合酶链式反应

Establishment of a Real-Time Fluorescent PCR Method for the Detection of Yersinia enterocolitica

LI Dan-Dan¹ LI Jia-Tong¹ AN Wei² WANG Chao-Zheng³

HAN Dian-Gang⁴ AI Jun⁴ WANG Dan-Yun^3* ZHAO Fang^5*

Abstract To enable the rapid and accurate detection of Yersinia enterocolitica, a real-time fluorescent PCR method was developed by designing primers and probes using the 16S rRNA gene of Yersinia enterocolitica. The method demonstrated a detection sensitivity of 10 fg/mL and showed no cross reactivity with 22 non-Yersinia enterocolitica bacteria. When applied to chicken samples artificially contaminated with Yersinia enterocolitica, the assay yielded results consistent with those obtained using the national standard method. Therefore, these findings indicate that the real-time fluorescent PCR method possesses high good specificity and sensitivity, is simple to perform, and is suitable for the rapid detection of Yersinia enterocolitica.

Keywords Yersinia enterocolitica; 16S rRNA; real-time fluorescent PCR

基金项目：海关总署科研项目（2024HK024）

第一作者：李丹丹（1979—），女，汉族，黑龙江哈尔滨人，博士，研究员，主要从事病原微生物快速检测工作，E-mail: 108074182@qq.com

通信作者：王丹云（1979—），女，汉族，海南海口人，本科，高级工程师，主要从事病原微生物快速检测工作，E-mail: 88351425@qq.com

共同通信作者：赵芳（1981—），女，汉族，青海贵德人，硕士，高级工程师，主要从事食品微生物检测工作，E-mail: 5021665571@163.com

1. 海口海关动植物检疫中心 海口 570311

2. 成都海关技术中心 成都 610041

3. 海口海关技术中心 海口 570311

4. 昆明海关技术中心 昆明 650228

5. 深圳海关食品检验检疫技术中心 深圳 518045

1. Animal and Plant Quarantine Center of Haikou Customs District, Haikou 570311

2. Technology Center of Chengdu Customs District, Chengdu 610041

3. Technology Center of Haikou Customs District, Haikou 570311

4. Technology Center of Kunming Customs District, Kunming 650228

5. Food Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Customs District, Shenzhen 518045

小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica），属肠杆菌科，广泛分布于自然界，是一种重要的人兽共患病病原，主要引起人类的急性肠炎。小肠结肠炎耶尔森氏菌能在冷藏温度下生长繁殖。基于生化反应可以将小肠结肠炎耶尔森氏菌分为1A、1B、2、3、4、5共6种生物型，这些生物型又可以进一步分为70多种血清型。致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌与生物1B、2、3、4、5型有密切相关，其中1B被认为是高致病菌，生物2—5型为低致病菌^[1]。致病与否是根据小肠结肠炎耶尔森氏菌否携带染色体的粘附侵袭基因ail、小肠结肠炎耶尔森氏菌耐热性肠毒素A基因ystA以及毒力质粒上的粘附素基因yadA、yop调节子的转录活化因子virF等来确定的^[2]。ail基因通常存在于致病性菌株中，但近年来发现在生物1A型菌株中也可能会检测到该基因^[3-4]。既往研究中，从腹泻患者粪便中分离到的小肠结肠炎耶尔森氏菌以致病性菌株为主，但目前越来越多的研究表明，非致病性菌株在腹泻病人中也有较高的分离率^[5]。2022年上海市质量监督检验技术研究院对240份生禽肉样本检测为例，该菌检出率达0.83%^[6]。在世界多国的食品进出口监管体系里，小肠结肠炎耶尔森氏菌检测被列为必检项目^[7-8]，检测结果直接决定食品能否顺利通关。在此形势下，深入探究小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测现状，优化检测方法，构建快速精准的检测模式，对保障公众健康、推动国际贸易发展具有重要意义。

现有检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法主要有分离培养^[9-12]、实时荧光聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）^[10-13]、等温扩增^[14-17]等。Foley 等^[18]通过同时检测yadA、ystB、inv 3个基因，实现了对所有小肠结肠炎耶尔森氏菌的不区分检测，其检测特异性为100%，灵敏性为98%。Mastrodonato等^[19]建立了检测 的PCR方法，该方法既有良好的灵敏性，也有良好的检测特异性，不与其他耶尔森氏菌和肠杆菌科菌反应。Ikeuchi等^[20]以ail、fyuA、inv 3个基因为检测对象，建立了高致病性、中致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的实时PCR检测方法，具有良好的检测特异性和灵敏性。本研究根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的保守序列16S rRNA来设计引物和探针，通过反复试验与参数优化，建立了一套用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

菌种来源：菌株购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）和中国医学细菌菌种保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）。

1.1.2 主要试剂及仪器

试剂：血平板（2240815，北京陆桥技术股份有限公司）；改良磷酸盐缓冲液（240110，北京陆桥技术股份有限公司）；细菌核酸提取试剂盒（K116KA2726，生工生物工程（上海）股份有限公司）；PCR反应液（K624KA4899，生工生物工程（上海）股份有限公司）。

仪器：荧光PCR仪（SLAN-96S，上海宏石医疗科技有限公司）；超微量分光光度计（NanoDrop 2000C，美国赛默飞世尔科技）。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针设计

根据美国国家生物技术信息中心DNA序列数据库（GenBank）中已经发表的小肠结肠炎耶尔森氏菌 16S rRNA基因序列（AM286415.1）设计实时荧光PCR引物和探针，见表1。

1.2.2 核酸提取

将待测菌株接种于血平板，于37℃培养18～24 h，挑取菌落用细菌核酸提取试剂盒提取基因组DNA，置于-20℃保存。

表1 引物和探针序列

Table 1 Sequences of Primers and Probe

1.2.3 反应体系及扩增条件

25 μL反应体系：5 μL 5×PCR mix，镁离子4.5 mM，上下游引物0.2 μM，探针0.1 μM，DNA模板2 μL。

PCR扩增程序：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 40 s（收集荧光），40个循环。

1.2.4 特异性试验

用建立的实时荧光PCR体系检测22株非小肠结肠炎耶尔森氏菌，评估方法的特异性。

1.2.5 灵敏性试验

使用超微量分光光度计测定小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组DNA的浓度，用无菌蒸馏水将基因组DNA按10倍梯度进行连续稀释。用建立的实时荧光PCR方法对每个浓度进行检测，以确定方法的灵敏性。

1.2.6 人工污染样品检测

将小肠结肠炎耶尔森氏菌（ATCC 23715）过夜培养，用生理盐水比浊，稀释至一定浓度。将不同浓度的菌液分别添加至经检测无小肠结肠炎耶尔森氏菌污染的25 g鸡肉样品中，添加浓度分别为10² CFU/25 g、10¹ CFU/25 g、10⁰ CFU/25 g、10^-1 CFU/25 g。人工污染的25 g鸡肉样品中加入改良磷酸盐缓冲液225 mL均质，置于37℃培养48 h，用建立的方法和GB 4789.8—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》对其进行检测，重复检测3次。

2 结果

2.1 特异性试验结果

用所建立的实时荧光PCR方法检测浓度为500 ng/mL的22种非小肠结肠炎耶尔森氏菌DNA。结果表明，该方法与大肠埃希氏菌O157: H7（CMCC 44828）、双相亚利桑那菌（ATCC 29934）、沙门氏菌（ATCC 35640）、弗氏柠檬酸杆菌（ATCC 43864）、阴沟肠杆菌（ATCC 49141）、阴沟肠杆菌（ATCC 35030）、霍氏肠杆菌（ATCC 700323）、大肠埃希氏菌（ATCC 11775）、大肠埃希氏菌（ATCC 8739）、大肠埃希氏菌（ATCC 35218）、大肠埃希氏菌（ATCC 25922）、普通变形杆菌（ATCC 33420）、奇异变形杆菌（ATCC 25933）、金黄色葡萄球菌（ATCC 33592）、粪肠球菌（ATCC19433）、单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC 19111）、副溶血性弧菌（ATCC 17802）、蜡样芽孢杆菌（ATCC 10876）、肺炎链球菌（ATCC 6303）、阪崎克罗诺杆菌（ATCC 25944）、克氏柠檬酸杆菌（ATCC27156）、宋内氏志贺氏菌（ATCC 9290）均无反应（表2）。

表2 特异性试验结果

Table 2 Results of specificity experiment

注: “+”表示阳性反应; “-”表示阴性反应.

2.2 灵敏性试验结果

将小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组10倍梯度稀释，用本研究所建立方法进行检测。检测结果表明，该方法的检测灵敏度为10 fg/mL，如图1所示。

1—6: DNA浓度分别为1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 fg/mL、10 fg/mL

图1 灵敏性试验结果

Fig.1 Results of sensitivity experiment

2.3 检测人工污染样本检测结果

用GB 4789.8—2016中方法和本研究建立的实时荧光PCR方法对人工污染的鸡肉样品进行检测，重复检测3次。根据表3结果显示，两种方法均能检测出10⁰ CFU/25 g以上人工污染的小肠结肠炎耶尔森氏菌鸡肉样品。

表3 国标法与本方法比对实验

Table 3 Comparison between the national standard method and the developed PCR method

注: “+”表示阳性反应; “-”表示阴性反应.

3 讨论

本研究基于小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA基因建立的实时荧光PCR检测方法，具有良好的检测灵敏度（10 fg/mL），与国标方法一致，但检测时间大幅度缩短。同时，特异性验证覆盖了肠杆菌（如大肠杆菌O157: H7、沙门氏菌）、非发酵菌（如铜绿假单胞菌）及革兰氏阳性菌（如单核细胞增生李斯特氏菌），证实了所建立的实时荧光PCR方法的特异性，为食品复杂基质中目标菌的特异性筛查提供了技术支撑。

16S rRNA作为细菌分类的“金标准”基因，其高拷贝数特性是实现超高灵敏度的基础，同时保证了检测方法的特异性。但研究仍需进一步改进：（1）本检测方法不能检测毒力基因，无法区分菌株的致病性，可能导致过度预警的发生。因此，未来可开发多靶标联检体系（如同时检测毒力基因和16S rRNA），形成“初筛+确证”的联合方案，兼顾检出率与风险评估。（2）尽管PCR方法检测快速，但仍需增菌以满足检测灵敏性的要求。未来可结合免疫磁珠富集^[21]、过滤浓缩^[22]等技术缩短增菌时间，将总检测时长压缩至8 h内。（3）本研究实际样品基质（如高脂鸡肉、加工肉制品）、样品数量还相对较少，未来需要就此做更多的研究。

综上所述，本研究根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的保守序列16S rRNA设计引物和探针，通过试验与参数优化，建立了一套高效检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光 PCR 方法。该方法灵敏度高、特异性强、操作简单，可有效地满足进出口食品对于小肠结肠炎耶尔森氏菌检测时长的需求。

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