董鑫 索朗卓玛 冯进 刘德星 陈健 冯娟

董 鑫 ¹ 索朗卓玛 ¹ 冯 进 ² 刘德星 ³ 陈 健 ³ 冯 娟 ^{1 *}

摘 要 本研究利用二代测序技术检测鼠形动物携带的病原体，筛选合适的基因片段，一次性检出多种病原体。选取16S rDNA V3V4扩增子，选择合适的基因片段，对已知阳性样本进行检测，应用符合预期基因片段进一步扩增2023年在西藏吉隆口岸捕获的鼠形动物的脏器样本。 针对捕获的41只鼠形动物采集肝脏、小肠样本，共送检样本75份，其中，肝脏样本41份，小肠样本34份，有22份样本目标片段扩增阳性。应用二代测序技术16S rDNA V3V4扩增子，选取特定的扩增片段，对已知巴尔通体阳性检出率为100%，同时也检出了其他病原体。

关键词 西藏吉隆口岸；二代测序技术；16S rDNA；鼠形动物

Application of Next-Generation Sequencing for Pathogen Detection in Murine Animals

at Gyirong Port of Xizang

DONG Xin ¹ SONAM Dolma ¹ FENG Jin ² LIU De-Xing ³ CHEN Jian ³ FENG Juan ^1*

Abstract This study utilized next-generation sequencing technology to detect pathogens carried by murine animals, screened suitable gene fragments, and detected multiple pathogens in a single assay. The 16S rDNA V3V4 amplicon was selected, appropriate gene fragments were chosen, known positive samples were tested, and the gene fragments meeting expectations were applied to further amplify organ samples from murine animals captured at the Gyirong Port of Xizang in 2023. Liver and small-intestine samples were collected from the 41 captured murine animals, totaling 75 submitted samples, of which 41 were liver samples and 34 were small-intestine samples, with 22 samples positive for target-fragment amplification. Using next-generation sequencing technology targeting the 16S rDNA V3V4 amplicon, specific amplification fragments were selected, achieving 100% detection rate for known Bartonella-positive samples and also detecting other pathogens.

Keywords Gyirong Port of Xizang; next-generation sequencing; 16S rDNA; murine animals

基金项目：海关总署科研项目（2022HK100）

第一作者：董鑫（1989—），男，汉族，浙江宁波人，本科，中级经济师，主要从事进出境传染病检测工作，E-mail: 342492678@qq.com

通信作者：冯娟（1988—），女，汉族，湖北汉川人，本科，副主任医师，主要从事病媒生物检测工作，E-mail: crystal8805@163.com

1. 拉萨海关 拉萨 850000

2. 张家港海关 苏州 215000

3. 拱北海关 中山 528400

1. Lhasa Customs, Lhasa 850000

2. Zhangjiagang Customs, Suzhou 215000

3. Gongbei Customs, Zhongshan 528400

西藏吉隆口岸作为中国与尼泊尔之间的重要通商口岸，人员和货物流动频繁，鼠形动物是多种病原体的主要宿主^[1]，能够传播多种人兽共患病。传统病原体检测方法存在灵敏度低、检测范围有限等问题，而二代测序技术，特别是宏基因组测序技术（Metagenomic Next Generation Sequencing，mNGS）可以对样本进行高通量、全基因组的分析，具有快速、准确、全面的优势^[2]。本研究应用mNGS技术，选择特定的基因片段，对吉隆口岸鼠形动物携带的病原体进行全面的基因组分析。

1 材料与方法

1.1 样本来源

于2023年6—10月，在西藏吉隆口岸捕获的鼠形动物。每只鼠形动物在无菌操作的基础上采集肝脏、小肠等组织样本，将样本充分研磨后（各管中提前放入6～8颗提前灭菌的3 mm氧化锆珠和600 μL灭菌生理盐水，振动频率50次/s，研磨90 s，使组织充分匀浆），取上清液作为核酸提取的样本。

1.2 仪器和设备

研磨使用组织匀浆机（MagNA lyser），核酸提取使用西安天隆科技公司生产的配套病毒DNA/RNA提取试剂盒和全自动核酸提取仪（Gene Rotex96）。提取的核酸样本置于1.5 mL EP管中置于-80℃冷冻保存。本次送检样本为41只鼠的肝脏样本41份，小肠样本34份，其中22份样本出现目标条带。

1.3 样本的PCR扩增与质检

扩增靶标为16S rDNA V3V4区的一段序列，扩增序列为：前端引物F前（5'-CTAYGGGCASCAG-3'）；后端引物R后（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）。

扩增体系：Taq酶25 μL，H₂O补足50 μL体系，F前（10 μM）1 μL，R后（10 μM）1 μL，DNA约50 ng，BSA 1 μL。

普通PCR扩增条件：变性95℃ 2 min；退火95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，31个循环；延伸72℃ 5 min。

电泳条件：1.5%琼脂糖凝胶，100 V，30 min。PCR产物上样量为3 μL。扩增过程设置阴性对照。

1.4 二代测序

二代基因测序过程委托广东美格基因科技有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 病原体构成

2.1.1 判定标准

返回的数据为OTU表分析模式：分析结果包含OTU表（带有注释信息）及OTU代表序列。病原体阳性判定标准：序列数≥50条^[3]。

2.1.2 鼠肠检测结果

从16份鼠肠的组织样本中检出志贺氏菌、幽门螺杆菌、梅毒螺旋体、巴尔通体、立克次小体属、肠球菌、葡萄球菌、链球菌、弧菌、不动杆菌等病原体，检出率分别为100%、100%、6.25%、25%、0、68.75%、43.75%、75%、31.25%、12.5%，见表1。

2.1.3 鼠肝检测结果

从6份鼠肝的组织样本中检出志贺氏菌、幽门螺杆菌、梅毒螺旋体、巴尔通体、立克次小体属、肠球菌、葡萄球菌、弧菌、不动杆菌等病原体，检出率分别为100%、100%、0、33.33%、16.67%、50.00%、33.33%、50.00%、0，见表2。

2.1.4 mNGS与传统检测方法对比

在编号为S2023018鼠的鼠肠（C018）和鼠肝（G018）中同时检出志贺氏菌、幽门螺杆菌。应用二代测序技术，巴尔通体在编号为C10、C36、C37、C38（鼠肠），G18、G29、G35（鼠肝）检出阳性，除C18样本外，其他样本与荧光定量PCR的检出结果一致（表3）。

荧光定量PCR检测方法使用巴尔通体核酸测定试剂盒（上海之江生物有限公司）进行检测，有明显扩增曲线且Ct值≤38即判定为阳性反应。

表3 不同检测方法检出巴尔通体情况

Table 3 Detection of Bartonella by different detection methods

注: “-”代表阴性, “+”代表阳性.

3 讨论

本研究采集了鼠的肝脏、小肠样本进行mNGS分析，除检出已知病原体外，还检出了其他病原体。通过传统的检测方法^[4-6]，使用鼠肝检测巴尔通体、钩端螺旋体、鼠疫杆菌、伯氏疏螺旋体、立克次体、土拉热弗朗西氏菌等病原体，仅检出巴尔通体4例，检出率为9.76%（4/41）。应用二代测序技术，巴尔通体检出率为17.07%（7/41），大大提高了检出效率。有研究表明，相较于传统检测方法，mNGS在病原体的检出方面具有更高的灵敏度^[7]，这与本研究结果一致。无论是传统的检测方法还是应用mNGS的方法，检出最多的病原体是巴尔通体。还有研究表明巴尔通体在啮齿动物中的感染很普遍，感染动物包括猫、狗、牛、羊、鼠和蝙蝠等，感染趋势由家鼠向野鼠转变^[8]。巴尔通体通过虱、蚤、蜱等吸血节肢动物从动物传播给人类，或者被受感染的动物抓伤等途径感染人类^[9]。在农牧地区，巴尔通体感染应纳入不明原因引起的发热和淋巴结肿大的病因考虑因素。

同时，在获得目标片段的16份鼠肠样本和6份鼠肝样本中，志贺氏菌、幽门螺杆菌检出率为100%。志贺氏菌是引起细菌性痢疾的重要病原体^[10]，幽门螺杆菌寄生在胃黏膜组织中，常引起慢性胃炎和消化性溃疡等疾病^[11]。这两种细菌都能通过粪口途径传播，导致疾病在人与动物之间、人与人之间的传播和流行。在鼠肠道中检出志贺氏菌和幽门螺杆菌，提示鼠形动物通过污染水源、土壤等介质传播疾病存在可能。

部分样本还检出梅毒螺旋体、立克次体、肠球菌、葡萄球菌、链球菌、弧菌、不动杆菌等病原体。应用传统检测方法，未检出立克次体。立克次体是引起斑疹伤寒的主要病原体，跟巴尔通体一样可以通过节肢动物吸血在人和动物之间传播疾病。肠球菌、葡萄球菌、弧菌、不动杆菌等都是与人类感染性疾病相关的细菌，鼠形动物可能通过粪便污染环境导致人类感染相关疾病。

本研究中，mNGS技术展现了其快速、准确、全面的优势，能够同时检测多种病原体，避免了传统方法的局限性。目前mNGS技术多用于临床上未知病原体的检测，没有统一的规范和质量控制标准，临床上为避免过度诊断和治疗，会根据标本类型、临床表现和传统病原学特征进行综合判断^[12-15]，既使报告序列数极低，也不能完全排除相应病原体感染的可能性^[13]。本研究将mNGS技术应用于鼠形动物携带的病原体检测，对报告结果的解读，除考虑样本类型的定值菌、条件致病菌外，重点关注可致病病原体，如鼠疫、钩端螺旋体、汉坦病毒、立克次体、巴尔通体、伯氏疏螺旋体等。参考夏宇等^[3]的研究，以OTU序列数≥50作为阳性判断标准。

根据监测结果，编号为S2023038的鼠是一只自毙鼠，检测结果中巴尔通体序列数达63542条，提示被捕获鼠形动物本身的生命状态可能与其是否携带病原体有关。在日常的病媒监测工作中，应重点关注出现动物尸体的区域，并做好人员防护。

通过应用mNGS技术，本研究对西藏吉隆口岸鼠形动物携带的病原体进行了全面的基因组分析，揭示了该地区鼠形动物携带多种病原体的存在，而mNGS技术在病原体检测中的应用具有广阔前景，对病原体的监控和防控、保障公共卫生安全具有积极作用。

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表1 鼠肠组织中检出病原体情况

Table 1 Detection of pathogens in intestinal tissues of murine animals

注: “+”代表检出相应病原体, “-”代表未检出相应病原体.

表2 鼠肝组织中检出病原体情况

Table 2 Detection of pathogens in liver tissues of murine animals

注: “+”代表检出相应病原体, “-”代表未检出相应病原体.