张继东 史晓峰 沈莉 麦晓霞 谭智毅

周傲白雪 ¹ 赵福振 ¹ 张 洪 ¹ 罗宝正 ¹ 陈 轩 ^{1 *}

摘 要 针对水体中H1N1流感病毒检测灵敏度不足的问题，本研究通过优化铁絮凝法和聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）沉淀法的最佳工作浓度，建立了两种水体中H1N1流感病毒富集方法，联合采用反转录实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR）进行检测，计算并比较回收率。结果表明，当Fe³⁺终浓度为0.1 mg/L时，铁絮凝法病毒富集效果显著优于其他浓度组，最高回收率达62.447%；PEG 8000浓度为50 g/L时，回收率最高为5.760%。根据回收率比较结果，铁絮凝法富集的病毒核酸量显著高于聚乙二醇（PEG）沉淀法（p ＜0.05）。本研究建立的水体中H1N1流感病毒的两种富集方法，为水体流感病毒监测提供了可靠的技术支持，实际应用中可根据需求选择方法应用。

关键词 H1N1流感病毒；病毒富集；铁絮凝法；聚乙二醇沉淀法

Optimization and Comparison of Two Enrichment Methods for H1N1 Influenza Virus in Water

ZHOU Ao-BaiXue ¹ ZHAO Fu-Zhen ¹ ZHANG Hong ¹ LUO Bao-Zheng ¹ CHEN Xuan ^1*

Abstract To enhance the sensitivity indetecting H1N1 influenza virus in water, this study optimized two viral enrichment methods-iron flocculation and polyethylene glycol (PEG) precipitation-by determining their optimal working concentrations. Enriched viral RNA was quantified using reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR), and recovery rates were calculated and compared between the two methods. The results showed that the iron flocculation achieved maximal recovery (62.447%) at a final Fe³⁺ concentration of 0.1 mg/L. In contrast, the PEG precipitation method yielded a maximum recovery rate of only 5.760% at a PEG8000 concentration of 50 g/L. Statistical analysis confirmed that the iron flocculation method recovered significantly more viral RNA than the PEG precipitation method (p ＜0.05). These results demonstrate that this study established two enrichment methods for H1N1 influenza virus in environmental waters, providing reliable technical support for influenza virus in environmental waters. This work provides a technical foundation for waterborne viral surveillance. The choice between methods can be adapted based on practical monitoring needs.

Keywords H1N1 influenza virus; virus enrichment; iron flocculation; polyethylene glycol (PEG) precipitation method

基金项目：海关总署科研项目（2024HK306）

第一作者：周傲白雪（1994—），女，汉族，河北保定人，硕士，兽医师，主要从事动物检疫防控技术研究工作，E-mail: zabx0808@163.com

通信作者：陈轩（1983—），男，汉族，广东梅州人，硕士，正高级兽医师，主要从事动物检疫鉴定技术研究工作，E-mail: 65561977@qq.com

1. 拱北海关技术中心 珠海 519015

1. Technology Center of Gongbei Customs District, Zhuhai 519015

随着全球气候变化和人类活动范围的不断扩大，流感病毒等病原微生物在环境中的传播风险持续增加^[1-2]。甲型流感病毒（Influenza A virus）作为一种高度传染性的呼吸道病毒，主要通过气溶胶传播，有研究表明其在水体环境中也可保持较长时间的感染活性^[3-4]。H1N1是甲型流感病毒的重要致病亚型，Brown等^[5]研究表明H1N1在4℃水环境中可维持传染性达77.7 d。水体环境具有复杂性、流动性及病毒浓度低的特点，直接检测病毒难度较大，因此建立高效、稳定的病毒富集方法成为亟待解决的关键问题。

目前常用的水体中病毒富集方法主要包括絮凝沉淀法、超滤法、聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）沉淀法、磁珠富集法以及免疫磁性纳米颗粒法等。其中，絮凝沉淀法和PEG沉淀法是较为常用的富集方法。铁絮凝法通过Fe³⁺絮凝作用使病毒颗粒聚集，该方法操作简便、成本低廉，能有效去除杂质干扰，已被成功应用于鲤疱疹病毒Ⅱ型等水生病毒的检测^[4]。PEG沉淀法利用其高亲水性在特定盐浓度下促进病毒颗粒聚集沉淀，在诺如病毒等病原体的富集浓缩中得到广泛应用^{[2, 4, 6]}。

尽管两种方法在病毒富集领域各有特点，但针对H1N1流感病毒的富集方法与效率比较的研究尚未见系统性报道。H1N1流感病毒为分节段的RNA病毒，其易变性和脆弱性对富集方法要求较高。同时，水体环境的复杂性也可能对富集方法的选择提出更苛刻的要求。本研究以H1N1流感病毒为对象，结合反转录实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR）技术，优化铁絮凝法和PEG沉淀富集方法，并评估其在水体样本中流感病毒的富集效率，为水体环境中流感病毒的监测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Nalgene可重复使用过滤装置（美国赛默飞世尔科技公司）；无油真空泵（广州华誉仪器科技有限公司）；磁力搅拌器（群安科学仪器有限公司）；Q5实时荧光PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；0.8 μm聚碳酸酯膜（英国沃特曼公司）；氯化高铁六水（生工生物工程股份有限公司）；聚乙二醇（生工生物工程股份有限公司）；氯化钠（生工生物工程股份有限公司）；FastPure Complex Tissue/Cell Total RNA Isolation Kit RNA提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；Evo M-MLV一步法 RT-qPCR 试剂盒（探针法）（艾科瑞生物有限公司）。本实验引物探针均由生工生物工程股份有限公司合成。本次实验使用的H1N1病毒株为本实验室保存的灭活样本。

1.2 水样制备

实验水样的制备采用200 μL病毒原液加至800 mL水中，混匀后分成7组，其中，4组为100 mL水样，3组为70 mL水样，现配现用。

1.3 病毒富集

1.3.1 铁絮凝法

向4组制备后的100 mL水体中分别添加10 μL、50 μL、100 μL、1 mL 的1 g/L FeCl₃· 6H₂O絮凝剂，使Fe³⁺终浓度分别为0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、10 mg/L，磁力搅拌器搅拌30 min。将处理后的水样使用0.8 μm孔径的聚碳酸酯膜负压过滤，收集滤膜并用剪刀剪碎，与留存的500 μL原水样一并进行核酸提取，比较回收率确定Fe³⁺使用浓度。

1.3.2 PEG沉淀法

向3组制备后的70 mL水体中添加1.17 g NaCl，每组分别添加 3.5 g、7 g、10.5 g PEG 8000粉末，上下颠倒混匀，使其终浓度分别为50 g/L、100 g/L、150 g/L，4℃静置24 h。将处理后的水样8000 r/min离心40 min，缓慢倒掉上层液体，留取沉淀；取1.5 mL 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）重悬沉淀后，转移至 1.5 mL 离心管中，-20℃保存，与留存的500 μL原水样一并进行核酸提取，比较回收率确定PEG 8000使用浓度。

1.4 核酸提取与检测

按照RNA提取试剂盒的说明书对样品进行RNA 提取，使用GB/T 18936—2020《高致病性禽流感诊断技术》中禽流感RT-qPCR方法M基因的引物探针对上述样品进行检测。

1.5 标准曲线制备

以本实验室保存的H1N1流感病毒样本（已灭活）为绘制标准曲线的标准品，用紫外分光光度计测定其浓度，再将浓度换算成拷贝数。将标准品1∶10倍比稀释5个稀释度，分别为1∶10²、1∶10³、1∶10⁴、1∶10⁵、1∶10⁶。按照样品检测条件进行标准品检测，以稀释标准品浓度的lg值（X）对Ct值（Y）制备标准曲线。

1.6 回收率的测定

将样品RT-qPCR检测结果代入标准曲线中，计算提取的核酸浓度。根据公式回收率=（富集后样本病毒浓度×体积）/（富集前样本病毒浓度×体积）×100%计算病毒回收率，并进行比较。

1.7 统计学分析

采用Excel和GraphPad Prism 8软件进行数据统计和分析。所有数据用（平均值±标准差）来表示，使用t检验分析两种方法间回收率的差异，p＜0. 05为差异有统计学意义，ns代表无显著性差异。

2 结果

2.1 标准曲线的建立

将制备的所有梯度标准品进行RT-qPCR检测，获得对应的Ct值，分析显示5个值具有良好线性关系，如图1所示。拟合的标准曲线公式为Y = -3.5365X+ 44.763（R = 0.9974）。

图1 HINI病毒标准曲线

Fig.1 Standard curve of H1N1 influenza virus

2.2 H1N1流感病毒富集方法的建立

2.2.1 铁絮凝法

本研究通过添加不同剂量的FeCl₃· 6H₂O絮凝剂（10 μL、50 μL、100 μL、1 mL，对应Fe³⁺终浓度分别为0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、10 mg/L）优化病毒富集条件。每组设置双平行实验，经病毒富集后采用RT-qPCR检测，记录平均Ct值并计算回收率。结果表明，当Fe³⁺终浓度为0.1 mg/L时，病毒富集效果显著优于其他浓度组（p＜0.05），最高回收率达62.447%，见表1。因此，确定H1N1流感病毒富集的最佳Fe³⁺终浓度为0.1 mg/L。

2.2.2 PEG沉淀法

本实验设置了3个浓度梯度（50 g/L、100 g/L、150 g/L），每组进行双平行检测，通过RT-qPCR测定病毒回收率。结果显示，50 g/L PEG 8000处理组的病毒富集效果显著优于高浓度组（p＜0.05），回收率达到5.760%（表2）。基于此，最终确定50 g/L为H1N1流感病毒富集的最佳PEG 8000工作浓度。

2.3 两种方法对H1N1流感病毒富集的回收率比较

本研究系统比较了铁絮凝法与 PEG沉淀法对H1N1流感病毒的富集效果。实验数据显示，两种方法在最佳工作浓度下（Fe³⁺ 0.1 mg/L和PEG8000 50 g/L）均能有效富集病毒，但富集效率存在显著差异。铁絮凝法表现出更优异的病毒回收能力，铁絮凝法Ct值降低幅度（ΔCt = 9.264）显著高于PEG沉淀法（ΔCt = 2.067），铁絮凝法的病毒回收率（62.447%）较PEG沉淀法（5.760%）提升10.8倍（p＜0.05）。

3 讨论

近年来，随着社会经济发展和公共卫生研究的深入，环境水体被病原污染导致的公共卫生安全风险日益突出，水体中病原微生物的监测已成为公共卫生领域的重要课题。甲型流感传染性强、变异快，可能引发高热、肺炎等严重并发症，是危害严重的人兽共患病之一。其长期存在、频繁变异和跨物种传播的能力，很大程度上源于病毒在水禽自然宿主群体及其栖息水环境中的持续循环与保藏^[7]。田国斌等^[8]研究证实，环境（特别是水体）保毒是禽流感得以长期存在和传播的重要因素和媒介。通常情况下，病毒在水中的浓度非常低，直接检测难以检出，需要对大体积液体样本进行富集浓缩后再检测。在常用的富集方法中，无机絮凝法沉淀法是将Fe³⁺或Al³⁺等化学类的絮凝剂加入待测水样，通过形成沉淀的方式对病毒进行富集浓缩，具有操作简单、成本低的优点^[4]，但其富集效率易受水质（如浊度、pH）影响。PEG沉淀法则利用PEG的脱水效应促使病毒颗粒聚集沉淀，操作简单，适用于多种病毒，但用时较长，对环境和离心设备具有一定的要求。本研究针对水体中病毒浓度低、直接检测困难的技术瓶颈，通过优化实验条件，系统建立了H1N1流感病毒铁絮凝法和PEG沉淀法两种富集方法，并对其富集性能进行了比较，为水体中H1N1流感病毒监测提供了方法参考。

富集效率结果显示，铁絮凝法在0.1 mg/L Fe³⁺条件病毒平均回收率为62.447%，显著高于PEG沉淀法（5.760%）。这一差异可能源于两种方法的作用机制不同。铁絮凝法通过Fe³⁺与病毒表面糖蛋白的特异性结合及电荷中和效应实现高效富集。本实验中铁絮凝法在浓度超过0.1 mg/L时回收率急剧下降，这可能是由于过量Fe³⁺导致病毒颗粒过度聚集，形成不稳定的絮体，从而降低目标物的回收率^[9]。

PEG沉淀法在本研究中的回收率介于0.911%～5.760%之间，当PEG 8000浓度为50 g/L时回收率达到最高，继续增加浓度反而导致回收效率降低。对比铁絮凝法回收率结果，PEG沉淀法对H1N1流感病毒的富集效率有限。这可能是因为该方法主要依靠空间位阻效应使病毒颗粒聚集，其温和的作用方式虽然有利于保持病毒完整性，但富集效率相对较低^[10]。在实际应用中应根据样本形式和需求选择适宜的方法，以获得最佳富集效果。

综上所述，本研究建立了水体中H1N1流感病毒的两种富集方法并进行对比，为流感病毒的环境监测提供了可靠的技术支持，也为其他病原微生物的水体富集研究提供了重要参考。未来的研究将会通过考虑病毒核酸完整性、操作便捷性和成本效益等多方因素，进一步优化富集条件，建立更全面的方法评价体系。

参考文献

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[2] 普春敏, 陈丽丽, 索玉娟, 等. 食品中诺如病毒的分离、富集与分子检测技术研究进展[J]. 上海农业学报, 2024, 40(5): 131-141.

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[10] 普春敏, 陈丽丽, 索玉娟, 等. 食品中诺如病毒的分离、富集与分子检测技术研究进展[J]. 上海农业学报, 2024, 40(5): 131-141.

表1 铁絮凝法对水体中HINI病毒的回收率结果

Table 1 Recovery rates of HINI influenza virus in water using the iron flocculation method

表2 PEG沉淀法对水体中HINI病毒的回收率结果

Table 2 Recovery rates of HINI influenza virus in water using the PEG precipitation method

第7卷 第8期

2025年8月

Health Quarantine / 卫生检疫

广谱病原多重聚合酶链式反应

在口岸传染病检测中的应用

董 卓 ¹ 周 艳 ¹ 吴 畅 ¹ 钟 洁 ¹ 龚 睿 ¹ 栾秀丽 ¹ 秦 勇 ¹ 武长礼 ^{1 *}

摘 要 为加强对广谱病原多重聚合酶链式反应（Multiplex Polymerase Chain Reaction）技术在口岸传染病检测中的应用探索，本研究通过对100例咽拭子样本核酸进行常规PCR和广谱病原多重PCR检测结果进行对比发现，相较于常规PCR检测方式，广谱病原多重PCR检测具有一定优势，其中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌检出优势显著，对比差异具有统计学意义。另外，通过采用高效快速、操作简单的广谱病原多重PCR检测技术进行口岸传染病检测，初步评价分析该技术在口岸传染病检测中的应用价值。研究表明，该技术在提高检出率的同时可缩短检测时效，为口岸卫生检疫提供更有力的技术支撑。

关键词 多重聚合酶链式反应；口岸；传染病；检测

The Application of Broad-Spectrum Pathogen Multiplex Polymerase Chain Reaction in the Detection of Infectious Diseases at Ports

DONG Zhuo¹ ZHOU Yan¹ WU Chang¹ ZHONG Jie¹

GONG Rui¹ LUAN Xiu-Li¹ QIN Yong¹ WU Chang-Li^1*

Abstract In order to further explore the application of broad-spectrum pathogen multiplex polymerase chain reaction (multiplex PCR) technology in the detection of infectious diseases at ports, this study compared the nucleic acid detection results of 100 pharyngeal swab samples using conventional PCR and broad-spectrum pathogen multiplex PCR. It was found that compared with the conventional PCR detection method, broad-spectrum pathogen multiplex PCR had certain advantages, among which the detection of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis have significant advantages, and the comparison difference is statistically significant. This paper uses the broad-spectrum pathogen multiplex PCR detection method that is efficient, rapid and simple to conduct port infectious disease detection. It preliminarily evaluates and analyzes the application value of this technology in port infectious disease detection. The results show that this technology can improve the detection rate and shorten the detection time, and provide more powerful technical support for port health quarantine.

Keywords multiplex PCR; port; infectious disease; detection

基金项目：武汉海关科研项目（2023WK014）

第一作者：董卓（1993—），男，汉族，湖北孝感人，硕士，工程师，主要从事口岸传染病实验室检测工作，E-mail: dongzhuo_dz@163.com

通信作者：武长礼（1986—），男，汉族，湖北孝感人，硕士，主治医师，主要从事口岸传染病监测与防控研究工作，E-mail: changliw2018@163.com

1. 湖北国际旅行卫生保健中心（武汉海关口岸门诊部） 武汉 430070

1. Hubei International Travel Health Care Center (Outpatient Department of Wuhan Customs Port), Wuhan 430070

广谱病原多重聚合酶链式反应（Multiplex Polymerase Chain Reaction）技术，简称广谱病原多重PCR，‌其利用聚合酶链反应技术，对多类病原体进行有效检出^[1-2]。近年来，广谱病原多重PCR技术在临床诊断学，尤其是与感染相关的疾病诊断以及监测方面应用率较高^[3-4]‌，但其在口岸传染病检测中的应用报道较少。

当前，国际上霍乱、黄热病、登革热、猴痘、拉沙热等传染病疫情频发^[5-6]。“多病同检”是一项重要工作，需严防各类传染病的跨境传播^[7]。对于入境人员不明原因发热等症状，实验室需精准定位找出病因，如何快速有效且成本可控地确定病原体是当前工作的一个难点^[8]。开展广谱病原多重PCR在口岸传染病检测中的应用不仅能够优化实验室技术工作，实现降本增效，更是为守牢外防输入关口提供有力的技术支撑。

用于识别病原体的传统检测方法包括微生物培养、血清学检测以及PCR等，这些传统方法虽然可以诊断和鉴别呼吸道病原体^[9]，但都有一定的缺陷，比如：培养法耗费时间长，且可培养微生物有限，难以满足检测需求；免疫学方法面临特异性较差以及窗口期的问题；病原体核酸的聚合酶链反应技术方法多，但仅能定性检测常见病原体，而定量PCR仅局限于病毒及部分特定细菌的检测^[10]。宏基因组测序存在性价比低、特殊病原体检测能力不足等问题^[11]。目前在口岸传染病筛查中，尚没有能兼具快速、准确、成本低等特性的方法精准找出病原体。因此，本研究针对广谱病原多重PCR技术应用于口岸传染病检测的可行性进行研究。

1 材料与方法

本研究主要对常规PCR检测以及广谱病原多重PCR在口岸传染病检测中的应用效果进行对比分析。样本来源为武汉口岸出入境法定监测对象且有呼吸道症状人员，均签署了采样知情同意书。随机选取2024年1月—2024年11月咽拭子样本100例。提取样本DNA/RNA，应用广谱病原多重PCR技术靶向富集病原体核酸，再结合实时荧光定量PCR技术（qPCR），提供包括细菌、真菌、病毒、分枝杆菌、支原体/衣原体等36种常见病原微生物检测，检测范围见表1。

1.1 材料与试剂

常规PCR试剂（湖北朗德医疗科技有限公司、上海之江生物科技股份有限公司、上海伯杰医疗科技股份有限公司）；广谱病原通用扩增试剂（上海冰缘医疗科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

荧光定量PCR仪 CFX96（Bio-Rad Laborato- ries）；全自动核酸提取仪S-48（武汉纳磁生物科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 核酸提取

在生物安全柜中将咽拭子折断，直接放入预装玻璃珠（0.1 mm & 0.5 mm）的研磨管中，加入1.0 mL无菌PBS缓冲液，将研磨管置于恒温震荡金属浴上56℃，600 rpm震荡混匀10 min。弃去管中拭子。

向研磨管中加入20 μL核酸保护剂NP、40 μL裂解加强液SD，涡旋混匀后短暂离心，然后再加入20 μL蛋白酶K，涡旋混匀并短暂离心。随后将研磨管转至恒温金属浴中，70℃温浴20 min后将研磨管取出，涡旋震荡混匀30 s，然后瞬时离心30 s，将研磨管转移至生物安全柜中，进行DNA/RNA的提取与纯化，具体操作方法按说明书执行（磁珠法液体样本病原微生物总核酸提取试剂盒，CJ0004）。

1.3.2 核酸富集

吸取样本核酸10 μL加入分装有富集试剂的PCR管中，密封后使用离心机离心。按说明书中的核酸富集反应程序进行扩增，具体操作方法依照说明书执行（广谱病原通用扩增试剂盒Ⅰ型说明书）。

1.3.3 qPCR扩增

使用移液器吸取15 μL富集产物，连续加入装有试剂的相应区域，完毕后震荡混匀，按加样顺序，使用荧光定量PCR仪进行扩增检测，具体操作方法按说明书执行（广谱病原通用扩增试剂盒Ⅰ型说明书）。

1.3.4 结果分析

根据荧光定量PCR仪显示的各通道扩增曲线以及导出的Ct值结果判断各样本的总体病原检出结果。然后，对比统计分析广谱病原多重PCR技术与常规PCR技术在口岸传染病检出情况，初步评价分析该技术在口岸传染病检测中的应用价值。

1.4 统计学处理

本研究中所有数据收集后经Excel 2024进行录入，统计学软件应用SPSS 27.0进行处理分析，采用频数或构成比（%）进行表示计数数据，通过χ²检验比较两种检测方法差异，以P＜0.05认为数据对比差异具有统计学意义。

2 结果

本研究中100份样本实验室检测结果显示，单传染病菌检出率最高的是甲型流感病毒（18%）以及腺病毒（14%），肺炎支原体（2%）以及新型冠状病毒（5%）检出率最低，另有肺炎链球菌+新型冠状病毒以及肺炎链球菌+甲型流感病毒的多重传染病菌检出的情况。

根据广谱病原多重PCR检测结果，流感嗜血杆菌检出率最高为75%，其次是肺炎链球菌检出率为37%，相较于实验室常规检测，甲型流感病毒（22%）、腺病毒（15%）、人鼻病毒（15%）、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）（12%）、肺炎支原体（3%）、白色念珠菌（1%）、巨细胞病毒（2%）以及卡他莫拉菌（4%）的检测中优势显著。

由常规PCR检测与广谱病原多重PCR检测结果可见，相较于常规检测方法，广谱病原多重PCR检测检出甲型流感病毒22例（常规PCR检出18例）、腺病毒检出15例（常规PCR检出14例）、乙型流感病毒检出12例（常规PCR检出12例）、人鼻病毒检出15例（常规PCR检出11例）、肺炎链球菌检出37例（常规PCR检出8例）、副流感病毒检出10例（常规PCR检出10例）、流感嗜血杆菌检出75例（常规PCR检出10例）、呼吸道合胞病毒检出5例（常规PCR检出5例）、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）检出12例（常规PCR检出5例）、肺炎支原体检出3例（常规PCR检出2例）、巨细胞病毒检出2例（常规PCR检出0例）、卡他莫拉菌检出4例（常规PCR检出0例）、金黄色葡萄球菌检出1例（常规PCR检出0例）、白色念珠菌检出1例（常规PCR检出0例），其中，肺炎链球菌检出（χ² = 24.115，P＜0.001）、流感嗜血杆菌检出（χ² = 86.445，P＜0.001）、卡他莫拉菌检出（χ² = 4.082，P = 0.043，＜0.05）对比差异具有统计学意义，见表2。

表2 实验室常规PCR检测与广谱病原多重PCR检测的

对比分析

Table 2 Comparative analysis of conventional PCR detection and broad-spectrum pathogen multiplex PCR detection

in the laboratory

3 讨论

PCR作为一项基因扩增技术，由于其简单易操作的特点，已经得到了广泛应用。然而，常规PCR检测范围较窄，检测项目单一，并存在假阴性结果的可能性，比如PCR仪器的设计理念不同，以及频繁出现的温度控制误差等质量问题。离心机的品质或者操作方法的错误导致了离心标本模板未能完全分离^[12]。在临床实验中，如果样本中的抑制物被完全剔除，目标核酸的遗失以及在样本或核酸纯化过程中遇到了提取试剂的残余、扩增反应抑制物等问题，都可能出现假阴性结果。

相较于实验室常规PCR检测，首先，广谱病原多重PCR技术病原体检测范围覆盖常见细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒、非典型病原体共计36种，不仅满足对常见传染性病原体的常规检测，而且能够对由细菌、病毒、真菌、非典型病原体等引起的不明原因发热进行一次性检测，可为“多病同检”提供思路和有效的操作流程。其次，广谱病原多重PCR耗时较短，全实验流程可控制在5 h内完成，相同检测项目下普通PCR全实验流程需要3 d，宏基因组测序全实验流程需要1～2 d，并且主要设备为荧光定量PCR仪，该检测技术在不需额外购置设备的前提下，即可在分子生物学实验室开展检测，可有效缩短检测时效和控制设施设备成本。再次，相比普通PCR及宏基因组测序，广谱病原多重PCR检测试剂成本更低。最后，通过100例咽拭子样本数据比对，该技术不仅在传统传染病检测方面优势明显，并且在流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）、人鼻病毒、甲型流感病毒、肺炎支原体、巨细胞病毒、卡他莫拉菌、白色念珠菌等病原体检测中均具有一定优势，其中在肺炎链球菌、甲型流感病毒、人鼻病毒、流感嗜血杆菌以及卡他莫拉菌的检测中优势显著。与此同时，本方案检测项目可覆盖新冠检测，操作简单，无需额外配置设备与人员。

但是，由于该检测技术涵盖病原体范围较广，加之灵敏性较高，使得检出人体定值菌的概率高于常规PCR，如本次结果中的流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等。所以，其检测结果需要结合实际情况综合判断。另外，该实验流程为二步法PCR，即第一步PCR扩增产物需要经过转管后，进行第二轮的荧光定量PCR检测，在转管期间存在污染的风险，对操作人员要求较高。为此，可采取风险防控措施有效降低污染风险：一是核酸富集步骤的PCR扩增产物转管，使用的八连管经密封袋密封后转移到生物安全柜内进行操作；二是在实验过程设置阴性对照、阳性对照，在转管过程设置环境对照，监测实验过程及实验环境是否发生污染，保证检测结果的有效性。

综上所述，广谱病原多重PCR技术能够一次性检测数十种常见病原体，性价比高，在提高实验室“多病同检”能力、提升检测效能、降低检测成本，以及维护口岸公共卫生安全方面具有重要作用。

参考文献

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表1 qPCR广谱病原多重检测试剂检测病原体范围

Table 1 Range of pathogens detected by qPCR broad-spectrum pathogen multiplex detection reagents

第7卷 第8期

2025年8月

口岸监管 / Port Control

视觉大模型在口岸杂草识别中的应用

季晓飞 ¹ 薛华杰 ¹ 江锦海 ¹ 程云辉 ² 黄小水 ³ 姚伟华 ²

摘 要 目前，大量的杂草智能识别软件工具能够识别园林花卉类等常见杂草，但无法满足口岸杂草监测、普查和疫情防控识别的专业需求。本研究通过“视觉大模型基座+任务头”的模型架构，借助开源视觉大模型基座获取杂草图像表征向量，设计多层全连接网络模型作为分类任务头识别上海口岸216种常见、重点关注和检疫性杂草及其同属近似种。实验对比了基于不同开源视觉大模型基座以及不同单物种最低样本量数据集的识别效果，并引入基于AdaptFormer框架的参数高效微调方法提升识别准确率，实现训练参数效率与性能之间的均衡。在单物种最低样本量为100～3000时，模型的top1识别准确率为90.49%～94.43%，top5识别准确率为98.84%～99.27%，可满足口岸杂草识别应用需求。

关键词 大模型；杂草识别；深度学习

Research on the Application of Large Vision Models in Weed Identification at Ports

JI Xiao-Fei¹ XUE Hua-Jie¹ JIANG Jin-Hai¹

CHENG Yun-Hui² HUANG Xiao-Shui³ YAO Wei-Hua²

Abstract While a large number of intelligent weed identification software tools exist for recognizing common plants such as ornamental and garden flora, they fall short of meeting the specialized requirements of weed monitoring, weed surveys and epidemic prevention and control identification at ports. This study adopted a “large vision models backbone + task head” architecture that employs large open-source vision models to extract image representation vectors of weeds, and a multi-layer fully connected neural network was designed as the classification task head to identify 216 weed species at Shanghai port, including common varieties, species of special concern, quarantine-targeted weeds, and their congeneric relatives. The experimental evaluation compared the recognition performance based on different open-source large vision models backbones and datasets with varying minimum sample sizes per species. By integrating parameter-efficient fine-tuning via AdaptFormer, we achieve an optimal balance between model performance and training efficiency. When the minimum sample size per species ranged from 100 to 3000, the model achieves a top-1 identification accuracy of 90.49%-94.43% and a top-5 identification accuracy of 98.84%-99.27%, meeting application requirements for weed identification at ports.

Keywords large model; weed identification; deep learning

基金项目：海关总署科研项目（2024HK217）

第一作者：季晓飞（1976—），男，汉族，江苏南通人，博士，正高级工程师，主要从事海关信息化工作，E-mail: ji_xiaofei@customs.gov.cn

1. 上海海关 上海 210135

2. 上海亿通国际股份有限公司 上海 201203

3. 上海交通大学 上海 200025

1. Shanghai Customs, Shanghai 210135

2. Shanghai E&P International INC, Shanghai 201203

3. Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025

杂草的准确识别是进出境口岸开展疫情监测、普查及防控工作的前提和基础。传统识别方法以人工鉴定为主，不仅耗时耗力，而且对鉴定人员的专业水平和实践经验要求较高。

深度学习是常用的杂草图像识别技术，众多学者在此领域展开了深入探索，取得了一系列具有价值的研究成果，但仍存在一些需要进一步研究的问题^[1-2]。一方面，深度学习模型的训练高度依赖大规模的标注数据集，而构建高质量的杂草图像标注数据集需要耗费大量的人力、物力和时间，且数据标注的准确性和一致性难以保证。不同标注人员对杂草特征的理解和判断可能存在差异，这会影响数据集的质量，进而影响模型的训练效果。另一方面，杂草的生长环境复杂多样，不同环境因素如光照、湿度、土壤条件等会导致杂草外观发生变化，增加了图像识别分类的难度。在野外环境中，杂草可能会受到遮挡、病虫害等影响，使得获取的图像特征不完整，从而降低模型的识别准确率。此外，现有的深度学习模型在小样本杂草分类任务上表现欠佳，对于一些样本数量较少的杂草种类，模型难以学习到足够的特征来进行准确分类。

近年来，大模型的能力涌现给杂草识别带来了新的思路。视觉大模型的发展主要围绕自监督学习和视觉变换器（Vision Transformer，ViT）展开，旨在构建具有强泛化能力的视觉主干网络^[3]。语言—图像预对比训练（Contrastive Language–Image Pretraining，CLIP）通过对比学习同时训练图像和文本编码器，将图像和文本映射到共享的嵌入空间^[4]。该方法在图像分类、跨模态检索等任务中表现出色，尤其在零样本学习场景中展现了强大的泛化能力。无标签自蒸馏（Self-DIstillation with NO Labels，DINO）采用自监督的方式训练ViT模型，通过教师—学生网络结构进行无标签的自我蒸馏学习^[5]。该方法在ImageNet上实现了80.1%的top1准确率，且在语义分割等任务中展现出良好的特征迁移能力。作为DINO的升级版本，DINOv2在架构、损失函数和优化技术上进行了改进，并在更大规模的数据集（1.42亿张图像）上进行自监督训练^[6]。该模型无需微调即可在多个下游任务中达到或超过行业标准，展现出更强的泛化性能。国内研究机构也陆续发布开源视觉语言大模型，包括InternVL、Qwen-VL、CogVLM等，均在多项图文多模态标准测试中获得高分，堪比GPT-4o、Gemini等国际视觉大模型^[7-13]。

基于以上研究基础，本研究探索采用视觉大模型技术构建高效、准确的杂草图像分类模型，为口岸杂草识别提供技术支撑。

1 模型架构

本文采用的模型架构图如图1所示。

图1 基于视觉大模型的杂草识别模型

Fig.1 Weed identification model based on large vision models

视觉大模型基座作为整个架构的核心，负责对输入的杂草图像进行特征提取。其接受图像文件作为输入，图像经预处理后分辨率统一为224×224，通过一系列复杂的神经网络层进行计算和处理，输出图像表征向量。该向量是对杂草图像的一种高维抽象表示，包含了图像中丰富的图像信息和特征信息。不同的大模型在网络结构、参数数量、计算方式等方面存在差异，这些差异会直接影响到图像表征向量的维度和特征表达能力。在实际应用中，选择合适的大模型对于提取准确有效的杂草图像特征至关重要。本研究选用InternViT-6B-448px-V2_5（以下简称InternViT-6B）、DINOv2-base作为基座，其输出的杂草图像表征向量维度分别为3200和768。

任务头则是连接在大模型之后，专门用于完成杂草图像分类任务的模块。它以大模型输出的图像表征向量作为输入，通过一系列的全连接层、激活函数以及分类器等组件，对图像的类别进行预测。任务头的设计紧密围绕杂草图像分类任务的特点和需求，通过对图像表征向量的进一步处理和分析，将其映射到具体的杂草类别上。本研究使用多层全连接神经网络模型作为任务头分类模型，相关参数见表1。

表1 任务头模型参数

Table 1 Parameters of task head model

在设计任务头模型时，需要考虑多个因素。例如，全连接层的层数和节点数量会影响任务头对图像特征的学习和表达能力，适当增加全连接层的层数和节点数量可以提高模型的拟合能力，但也可能导致过拟合问题；激活函数的选择会影响模型的非线性表达能力，常用的激活函数如ReLU、Sigmoid等具有不同的特性，需要根据具体情况进行选择；分类器的设计则直接决定了模型对杂草类别的预测方式，常见的分类器如Softmax分类器，通过计算每个类别对应的概率，选择概率最大的类别作为预测结果，实现对杂草图像的分类。

2 数据集

本研究的训练数据集涉及杂草图片数据来源广泛，涵盖了实地拍摄、网络资源库等多个渠道，充分反映了光照、自然遮挡等干扰因素，以及不同的拍摄者、拍摄设备和拍摄风格等人为因素对杂草图片形态的影响。

根据口岸杂草检疫需求，本研究对数据集进行了针对性的处理和筛选。将部分种级杂草数据作为重点关注识别样本，这些样本对于海关在杂草监测、普查、疫情防控等实际业务中具有重要意义。将与重点关注种在同属下的其他种数据作为同属近似种识别数据纳入数据集的构建中，以增加数据的多样性和模型的泛化能力。数据集包含了87属216种杂草，基本覆盖了上海口岸常见、重点关注和检疫性杂草及其近似种，样本总数共1028448张，见表2。

表2 数据集种数及样本数

Table 2 Number of species and samples in the dataset

为了使模型能够更好地学习和泛化，将数据集各类别按9∶1比例划分训练集和测试集。训练集用于模型的参数学习和优化，通过大量的样本数据让模型逐渐掌握杂草图像的特征和分类规律。测试集则用于评估模型的性能，在模型训练完成后，使用测试集对模型进行测试，以客观地衡量模型在未知数据上的分类准确性和泛化能力。

3 建模实验

为了深入研究和优化杂草图像分类模型的性能，本研究基于前文所述模型架构进行了一系列建模实验。这些实验从不同的角度出发，对模型的各个关键要素进行了探索和分析，以找到最适合杂草图像识别任务的模型配置和参数设置，从而提高模型的准确性、泛化能力和稳定性。

3.1 不同大模型基座的对比

本实验选择的开源视觉大模型基座分别为InternViT-6B和DINOv2-base，以探究不同基座模型对杂草图像分类性能的影响。InternViT-6B采用了视觉Transformer架构，在大规模数据上进行预训练，具备强大的特征提取能力，尤其擅长捕捉图像中的全局特征和复杂语义信息。DINOv2-base 同样基于Transformer架构，通过自监督学习方式进行训练，能够学习到丰富的图像特征表示，在多种计算机视觉任务中表现出色。

实验分别将杂草图像数据输入作为图像特征提取器的InternViT-6B和DINOv2-base，获取图像表征向量。然后，将这些向量输入到相同结构的分类任务头模型中，预测输出杂草种类。通过该实验，可初步评估杂草识别场景下，两个基座模型的适配优劣性。识别结果见表3。

表3 基于不同视觉大模型基座的杂草识别情况

Table 3 Weed identification performance using different large vision models foundations

由表3可知，总体上DINOv2-base模型表现优于InternViT-6B模型。无论是在训练集上的最优准确率（87.48%对比72.2%），还是在测试集上的准确率（84.17%对比69.1%），DINOv2-base模型的准确率都明显更高。

杂草图像的表征向量维度与最终模型的预测性能并非简单的正相关关系。InternViT-6B的表征向量维度为3200，高于768的DINOv2-base的表征向量维度，但它的模型的预测准确率却低于DINOv2-base。

DINOv2-base相比InternViT-6B模型在训练集上能获取更高的预测准确率，表明DINOv2-base模型对杂草训练数据的拟合能力更强，能够更好地挖掘杂草图像数据中的图像信息和特征信息。测试集的预测效果可反映模型的泛化能力，即对新数据的预测能力。DINOv2-base模型的测试集准确率高于InternViT-6B，说明DINOv2-base模型在面对未见过的数据时，能够更准确地进行预测，具有更好的泛化性能。

3.2 不同单物种最低样本量数据集的对比

为了研究数据集中样本数量对模型性能的影响，设定了多个单物种最低样本量阈值，从而得到多个不同的数据集。具体来说，分别设置单物种最低样本量阈值为100、500、1000、1500、2000、3000，根据这些阈值对原始数据集进行筛选，保证每个类别的样本数都不低于相应的阈值，得到6个不同的数据集，见表4。

表4 不同单物种最低样本量下的数据集

Table 4 Dataset statistics with varying minimum sample

size per species

实验中，对于每个数据集都使用基座大模型提取样本图像表征向量，并连接相同结构的分类任务头模型进行训练和预测评估，即对6个不同的数据集均使用DINOv2-base作为基座大模型连接相同的分类任务头模型进行训练，并评估模型在测试集上的top1及top5准确率，对比结果如图2所示。

图2 各类单物种最低样本量数据集的测试集预测结果

Fig.2 Prediction results on test datasets with varying minimum sample sizes per species

随着数据集单物种最低样本量的增加，模型在各数据集上的准确率都呈上升趋势，其中top1准确率从类最低样本数100时的84.17%上升至3000时的91.19%，top5准确率同样从93.96%上升至96.3%。这表明更多的类别样本数有助于模型更好地学习和拟合相应的类别特征，且与中国科学院植物研究所研发的植物物种识别模型79.3%的top1识别准确率和91.0%的top5识别准确率相比，均有一定的提升^[14]。

在各个数据集的验证中，测试集的top5准确率均高于top1准确率，且提升幅度较大，说明模型在进行多类别预测时给出多个候选预测结果，命中正确类别的可能性更高。

当最低样本数从1000增加至3000时，top1准确率的提升幅度大于top5准确率，表明随着样本数的不断增加，模型预测单一类别的效果提升更明显。

随着单物种最低样本量的增加，模型预测标签种数逐渐减少，从100时的216降至3000时的85。在样本数有限的情况下，为了保证模型性能，可减少种别数量，以集中数据特征，提高模型对主要类别的学习效果。当种数减少时，模型可能更容易聚焦于主要种，减少了种别之间的混淆，从而提高了预测准确率。这也说明在数据集中时，种别之间的样本分布可能存在不均衡的情况，适当调整种别数量有助于优化模型性能。

3.3 参数高效微调方法

为进一步提高识别准确率，本研究基于AdaptFormer 框架的参数高效微调方法（Parameter-Efficient Fine-Tuning，PEFT）^[15]，对DINOv2-Base 预训练模型进行适配，以实现高效的下游视觉任务处理。整体架构由三部分协同构成：冻结的 DINOv2 主干网络、插入式可训练的 AdaptFormer 模块以及自定义的任务头（Classification Head），如图3所示。

DINOv2-Base模型是一个预训练的图像表征模型，由 12 层Transformer Encoder搭建而成，具备卓越的图像特征提取能力。在整体架构中，该主干网络参数保持冻结状态，旨在降低训练过程中的计算与存储开销。

AdaptFormer模块是提升参数利用效率的关键组件，其由图3中的Down、Relu、Up和S等组成，被并行嵌入至每个Transformer层的前馈子网络（Feed-Forward Network，FFN）中。具体而言，AdaptFormer模块首先对中间特征维度进行压缩，将其降至较低维度（如64维），此操作有效减少了后续计算量与参数数量。接着，经过线性变换将压缩后的特征还原至原始维度，并通过缩放因子（如0.1）对输出进行调控，实现与主干特征的有机融合。这种设计在大幅降低参数数量的同时，巧妙增强了模型对下游任务的适应能力，使模型能够在有限参数调整下快速适配新任务。

分类头采用增强型多层感知机结构，其核心功能是将输入的图像特征（如768维CLS token）精准映射至高维隐藏空间。在此过程中，特征首先经过线性变换实现维度提升，随后通过非线性激活函数引入非线性因素，增强模型的表达能力，再经Dropout正则化防止过拟合，最终输出至最终分类层，完成下游任务的预测功能。

在参数分布方面，DINOv2-Base Backbone 包含约 85.7 M 参数，占据总模型参数的 97%，可训练部分仅涵盖AdaptFormer模块（约1.19 M，占比 1.4%）和任务头（约0.8～1.0 M，占比 1.1%）。因此，在整体训练过程中，仅需更新2%～3% 的参数，为大规模视觉模型的快速适配提供了可行方案。

本研究将图像数据集按照 ImageNet 格式随机分配为训练集（80%）、验证集（10%）和测试集（10%）。在具体设置中，仍然按照每类图像样本的最小数量（100、500、1000、1500、2000、3000）构建不同规模的数据子集，并评估模型在测试集上的top1及top5准确率，结果如图4所示。

图4 各类单物种最低样本量数据集的测试集预测结果（PEFT）

Fig.4 Prediction results across datasets with varying minimum sample sizes per species (PEFT)

随着每类图像数量的逐步增加，模型的性能同样呈现出显著提升趋势，其中top1准确率从类最低样本数100时的90.49%上升至3000时的94.43%，分别比未经过微调的提高了6.32和3.24个百分点；top5准确率从98.84%上升至99.27%，分别比未经过微调的提高了4.92和2.97个百分点。

这一结果充分表明模型具有较高的类别覆盖能力与预测鲁棒性，能够在复杂多变的图像分类任务中准确识别目标类别，有效避免误判情况的发生，同时验证了在参数效率与性能之间可以实现良好平衡。尽管仅对极少部分参数进行微调，模型在多种数据规模设置下均能保持稳定的表现，充分体现了参数高效微调方法在视觉表示学习领域的可行性与实用性。该方法为视觉大模型在不同资源条件下的快速适配与高效应用提供了新的思路与解决方案，有望推动视觉大模型在更多实际场景中的广泛应用。

4 结语

本研究探索了视觉大模型在口岸杂草检疫领域的应用，系统分析了国内外视觉大模型应用于口岸杂草检疫领域的可行性，针对口岸杂草监测、普查和疫情防控识别的专业需求构建了一个包含87属216种、共计1028448个样本的大规模杂草图像数据集，创新性地采用大模型结合任务头的方式构建杂草图像分类模型，并通过基于 AdaptFormer框架的参数高效微调方法取得了较好的性能。

通过构建大规模数据集、设计合理的模型架构、利用有限的训练资源，实现了对上海口岸216种常见、重点关注和检疫性杂草及其同属近似种的精准识别。经在上海部分口岸试点应用，该模型可满足辅助现场关员识别杂草的需求。该方法也可推广应用于农业生产、生态保护、林业资源管理等领域。

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图3 基于 AdaptFormer 框架的参数高效微调方法

Fig.3 The parameter-efficient fine-tuning method based on the AdaptFormer framework

第7卷 第8期

2025年8月

Biotechnology / 生物技术

小肠结肠炎耶尔森氏菌

实时荧光 PCR 方法的建立

李丹丹 ¹ 李佳潼 ¹ 安 微 ² 王朝政 ³ 韩佃刚 ⁴ 艾 军 ⁴ 王丹云 ^{3 *} 赵 芳 ^{5 *}

摘 要 为快速准确地检测小肠结肠炎耶尔森氏菌，本研究选取小肠结肠炎耶尔森氏菌16s rRNA设计引物探针，建立了一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法。结果表明，方法的灵敏度为10 fg/mL，与22株非小肠结肠炎耶尔森氏菌无交叉反应。用本方法检测小肠结肠炎耶尔森氏菌人工污染的鸡肉样本，检测结果与国家标准方法检测结果一致。本研究建立的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光PCR方法具有良好的特异性和灵敏性，操作简便易行，可以用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测。

关键词 小肠结肠炎耶尔森氏菌；16S rRNA；实时荧光聚合酶链式反应

Establishment of a Real-Time Fluorescent PCR Method for the Detection of Yersinia enterocolitica

LI Dan-Dan¹ LI Jia-Tong¹ AN Wei² WANG Chao-Zheng³

HAN Dian-Gang⁴ AI Jun⁴ WANG Dan-Yun^3* ZHAO Fang^5*

Abstract To enable the rapid and accurate detection of Yersinia enterocolitica, a real-time fluorescent PCR method was developed by designing primers and probes using the 16S rRNA gene of Yersinia enterocolitica. The method demonstrated a detection sensitivity of 10 fg/mL and showed no cross reactivity with 22 non-Yersinia enterocolitica bacteria. When applied to chicken samples artificially contaminated with Yersinia enterocolitica, the assay yielded results consistent with those obtained using the national standard method. Therefore, these findings indicate that the real-time fluorescent PCR method possesses high good specificity and sensitivity, is simple to perform, and is suitable for the rapid detection of Yersinia enterocolitica.

Keywords Yersinia enterocolitica; 16S rRNA; real-time fluorescent PCR

基金项目：海关总署科研项目（2024HK024）

第一作者：李丹丹（1979—），女，汉族，黑龙江哈尔滨人，博士，研究员，主要从事病原微生物快速检测工作，E-mail: 108074182@qq.com

通信作者：王丹云（1979—），女，汉族，海南海口人，本科，高级工程师，主要从事病原微生物快速检测工作，E-mail: 88351425@qq.com

共同通信作者：赵芳（1981—），女，汉族，青海贵德人，硕士，高级工程师，主要从事食品微生物检测工作，E-mail: 5021665571@163.com

1. 海口海关动植物检疫中心 海口 570311

2. 成都海关技术中心 成都 610041

3. 海口海关技术中心 海口 570311

4. 昆明海关技术中心 昆明 650228

5. 深圳海关食品检验检疫技术中心 深圳 518045

1. Animal and Plant Quarantine Center of Haikou Customs District, Haikou 570311

2. Technology Center of Chengdu Customs District, Chengdu 610041

3. Technology Center of Haikou Customs District, Haikou 570311

4. Technology Center of Kunming Customs District, Kunming 650228

5. Food Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Customs District, Shenzhen 518045

小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica），属肠杆菌科，广泛分布于自然界，是一种重要的人兽共患病病原，主要引起人类的急性肠炎。小肠结肠炎耶尔森氏菌能在冷藏温度下生长繁殖。基于生化反应可以将小肠结肠炎耶尔森氏菌分为1A、1B、2、3、4、5共6种生物型，这些生物型又可以进一步分为70多种血清型。致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌与生物1B、2、3、4、5型有密切相关，其中1B被认为是高致病菌，生物2—5型为低致病菌^[1]。致病与否是根据小肠结肠炎耶尔森氏菌否携带染色体的粘附侵袭基因ail、小肠结肠炎耶尔森氏菌耐热性肠毒素A基因ystA以及毒力质粒上的粘附素基因yadA、yop调节子的转录活化因子virF等来确定的^[2]。ail基因通常存在于致病性菌株中，但近年来发现在生物1A型菌株中也可能会检测到该基因^[3-4]。既往研究中，从腹泻患者粪便中分离到的小肠结肠炎耶尔森氏菌以致病性菌株为主，但目前越来越多的研究表明，非致病性菌株在腹泻病人中也有较高的分离率^[5]。2022年上海市质量监督检验技术研究院对240份生禽肉样本检测为例，该菌检出率达0.83%^[6]。在世界多国的食品进出口监管体系里，小肠结肠炎耶尔森氏菌检测被列为必检项目^[7-8]，检测结果直接决定食品能否顺利通关。在此形势下，深入探究小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测现状，优化检测方法，构建快速精准的检测模式，对保障公众健康、推动国际贸易发展具有重要意义。

现有检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法主要有分离培养^[9-12]、实时荧光聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）^[10-13]、等温扩增^[14-17]等。Foley 等^[18]通过同时检测yadA、ystB、inv 3个基因，实现了对所有小肠结肠炎耶尔森氏菌的不区分检测，其检测特异性为100%，灵敏性为98%。Mastrodonato等^[19]建立了检测 的PCR方法，该方法既有良好的灵敏性，也有良好的检测特异性，不与其他耶尔森氏菌和肠杆菌科菌反应。Ikeuchi等^[20]以ail、fyuA、inv 3个基因为检测对象，建立了高致病性、中致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的实时PCR检测方法，具有良好的检测特异性和灵敏性。本研究根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的保守序列16S rRNA来设计引物和探针，通过反复试验与参数优化，建立了一套用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

菌种来源：菌株购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）和中国医学细菌菌种保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）。

1.1.2 主要试剂及仪器

试剂：血平板（2240815，北京陆桥技术股份有限公司）；改良磷酸盐缓冲液（240110，北京陆桥技术股份有限公司）；细菌核酸提取试剂盒（K116KA2726，生工生物工程（上海）股份有限公司）；PCR反应液（K624KA4899，生工生物工程（上海）股份有限公司）。

仪器：荧光PCR仪（SLAN-96S，上海宏石医疗科技有限公司）；超微量分光光度计（NanoDrop 2000C，美国赛默飞世尔科技）。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针设计

根据美国国家生物技术信息中心DNA序列数据库（GenBank）中已经发表的小肠结肠炎耶尔森氏菌 16S rRNA基因序列（AM286415.1）设计实时荧光PCR引物和探针，见表1。

1.2.2 核酸提取

将待测菌株接种于血平板，于37℃培养18～24 h，挑取菌落用细菌核酸提取试剂盒提取基因组DNA，置于-20℃保存。

表1 引物和探针序列

Table 1 Sequences of Primers and Probe

1.2.3 反应体系及扩增条件

25 μL反应体系：5 μL 5×PCR mix，镁离子4.5 mM，上下游引物0.2 μM，探针0.1 μM，DNA模板2 μL。

PCR扩增程序：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 40 s（收集荧光），40个循环。

1.2.4 特异性试验

用建立的实时荧光PCR体系检测22株非小肠结肠炎耶尔森氏菌，评估方法的特异性。

1.2.5 灵敏性试验

使用超微量分光光度计测定小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组DNA的浓度，用无菌蒸馏水将基因组DNA按10倍梯度进行连续稀释。用建立的实时荧光PCR方法对每个浓度进行检测，以确定方法的灵敏性。

1.2.6 人工污染样品检测

将小肠结肠炎耶尔森氏菌（ATCC 23715）过夜培养，用生理盐水比浊，稀释至一定浓度。将不同浓度的菌液分别添加至经检测无小肠结肠炎耶尔森氏菌污染的25 g鸡肉样品中，添加浓度分别为10² CFU/25 g、10¹ CFU/25 g、10⁰ CFU/25 g、10^-1 CFU/25 g。人工污染的25 g鸡肉样品中加入改良磷酸盐缓冲液225 mL均质，置于37℃培养48 h，用建立的方法和GB 4789.8—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》对其进行检测，重复检测3次。

2 结果

2.1 特异性试验结果

用所建立的实时荧光PCR方法检测浓度为500 ng/mL的22种非小肠结肠炎耶尔森氏菌DNA。结果表明，该方法与大肠埃希氏菌O157: H7（CMCC 44828）、双相亚利桑那菌（ATCC 29934）、沙门氏菌（ATCC 35640）、弗氏柠檬酸杆菌（ATCC 43864）、阴沟肠杆菌（ATCC 49141）、阴沟肠杆菌（ATCC 35030）、霍氏肠杆菌（ATCC 700323）、大肠埃希氏菌（ATCC 11775）、大肠埃希氏菌（ATCC 8739）、大肠埃希氏菌（ATCC 35218）、大肠埃希氏菌（ATCC 25922）、普通变形杆菌（ATCC 33420）、奇异变形杆菌（ATCC 25933）、金黄色葡萄球菌（ATCC 33592）、粪肠球菌（ATCC19433）、单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC 19111）、副溶血性弧菌（ATCC 17802）、蜡样芽孢杆菌（ATCC 10876）、肺炎链球菌（ATCC 6303）、阪崎克罗诺杆菌（ATCC 25944）、克氏柠檬酸杆菌（ATCC27156）、宋内氏志贺氏菌（ATCC 9290）均无反应（表2）。

表2 特异性试验结果

Table 2 Results of specificity experiment

注: “+”表示阳性反应; “-”表示阴性反应.

2.2 灵敏性试验结果

将小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组10倍梯度稀释，用本研究所建立方法进行检测。检测结果表明，该方法的检测灵敏度为10 fg/mL，如图1所示。

1—6: DNA浓度分别为1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 fg/mL、10 fg/mL

图1 灵敏性试验结果

Fig.1 Results of sensitivity experiment

2.3 检测人工污染样本检测结果

用GB 4789.8—2016中方法和本研究建立的实时荧光PCR方法对人工污染的鸡肉样品进行检测，重复检测3次。根据表3结果显示，两种方法均能检测出10⁰ CFU/25 g以上人工污染的小肠结肠炎耶尔森氏菌鸡肉样品。

表3 国标法与本方法比对实验

Table 3 Comparison between the national standard method and the developed PCR method

注: “+”表示阳性反应; “-”表示阴性反应.

3 讨论

本研究基于小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA基因建立的实时荧光PCR检测方法，具有良好的检测灵敏度（10 fg/mL），与国标方法一致，但检测时间大幅度缩短。同时，特异性验证覆盖了肠杆菌（如大肠杆菌O157: H7、沙门氏菌）、非发酵菌（如铜绿假单胞菌）及革兰氏阳性菌（如单核细胞增生李斯特氏菌），证实了所建立的实时荧光PCR方法的特异性，为食品复杂基质中目标菌的特异性筛查提供了技术支撑。

16S rRNA作为细菌分类的“金标准”基因，其高拷贝数特性是实现超高灵敏度的基础，同时保证了检测方法的特异性。但研究仍需进一步改进：（1）本检测方法不能检测毒力基因，无法区分菌株的致病性，可能导致过度预警的发生。因此，未来可开发多靶标联检体系（如同时检测毒力基因和16S rRNA），形成“初筛+确证”的联合方案，兼顾检出率与风险评估。（2）尽管PCR方法检测快速，但仍需增菌以满足检测灵敏性的要求。未来可结合免疫磁珠富集^[21]、过滤浓缩^[22]等技术缩短增菌时间，将总检测时长压缩至8 h内。（3）本研究实际样品基质（如高脂鸡肉、加工肉制品）、样品数量还相对较少，未来需要就此做更多的研究。

综上所述，本研究根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的保守序列16S rRNA设计引物和探针，通过试验与参数优化，建立了一套高效检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光 PCR 方法。该方法灵敏度高、特异性强、操作简单，可有效地满足进出口食品对于小肠结肠炎耶尔森氏菌检测时长的需求。

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表2（续）

第7卷 第8期

2025年8月

生物技术 / Biotechnology

应用二代测序技术检测西藏吉隆口岸

鼠形动物携带的病原体

董 鑫 ¹ 索朗卓玛 ¹ 冯 进 ² 刘德星 ³ 陈 健 ³ 冯 娟 ^{1 *}

摘 要 本研究利用二代测序技术检测鼠形动物携带的病原体，筛选合适的基因片段，一次性检出多种病原体。选取16S rDNA V3V4扩增子，选择合适的基因片段，对已知阳性样本进行检测，应用符合预期基因片段进一步扩增2023年在西藏吉隆口岸捕获的鼠形动物的脏器样本。 针对捕获的41只鼠形动物采集肝脏、小肠样本，共送检样本75份，其中，肝脏样本41份，小肠样本34份，有22份样本目标片段扩增阳性。应用二代测序技术16S rDNA V3V4扩增子，选取特定的扩增片段，对已知巴尔通体阳性检出率为100%，同时也检出了其他病原体。

关键词 西藏吉隆口岸；二代测序技术；16S rDNA；鼠形动物

Application of Next-Generation Sequencing for Pathogen Detection in Murine Animals

at Gyirong Port of Xizang

DONG Xin ¹ SONAM Dolma ¹ FENG Jin ² LIU De-Xing ³ CHEN Jian ³ FENG Juan ^1*

Abstract This study utilized next-generation sequencing technology to detect pathogens carried by murine animals, screened suitable gene fragments, and detected multiple pathogens in a single assay. The 16S rDNA V3V4 amplicon was selected, appropriate gene fragments were chosen, known positive samples were tested, and the gene fragments meeting expectations were applied to further amplify organ samples from murine animals captured at the Gyirong Port of Xizang in 2023. Liver and small-intestine samples were collected from the 41 captured murine animals, totaling 75 submitted samples, of which 41 were liver samples and 34 were small-intestine samples, with 22 samples positive for target-fragment amplification. Using next-generation sequencing technology targeting the 16S rDNA V3V4 amplicon, specific amplification fragments were selected, achieving 100% detection rate for known Bartonella-positive samples and also detecting other pathogens.

Keywords Gyirong Port of Xizang; next-generation sequencing; 16S rDNA; murine animals

基金项目：海关总署科研项目（2022HK100）

第一作者：董鑫（1989—），男，汉族，浙江宁波人，本科，中级经济师，主要从事进出境传染病检测工作，E-mail: 342492678@qq.com

通信作者：冯娟（1988—），女，汉族，湖北汉川人，本科，副主任医师，主要从事病媒生物检测工作，E-mail: crystal8805@163.com

1. 拉萨海关 拉萨 850000

2. 张家港海关 苏州 215000

3. 拱北海关 中山 528400

1. Lhasa Customs, Lhasa 850000

2. Zhangjiagang Customs, Suzhou 215000

3. Gongbei Customs, Zhongshan 528400

西藏吉隆口岸作为中国与尼泊尔之间的重要通商口岸，人员和货物流动频繁，鼠形动物是多种病原体的主要宿主^[1]，能够传播多种人兽共患病。传统病原体检测方法存在灵敏度低、检测范围有限等问题，而二代测序技术，特别是宏基因组测序技术（Metagenomic Next Generation Sequencing，mNGS）可以对样本进行高通量、全基因组的分析，具有快速、准确、全面的优势^[2]。本研究应用mNGS技术，选择特定的基因片段，对吉隆口岸鼠形动物携带的病原体进行全面的基因组分析。

1 材料与方法

1.1 样本来源

于2023年6—10月，在西藏吉隆口岸捕获的鼠形动物。每只鼠形动物在无菌操作的基础上采集肝脏、小肠等组织样本，将样本充分研磨后（各管中提前放入6～8颗提前灭菌的3 mm氧化锆珠和600 μL灭菌生理盐水，振动频率50次/s，研磨90 s，使组织充分匀浆），取上清液作为核酸提取的样本。

1.2 仪器和设备

研磨使用组织匀浆机（MagNA lyser），核酸提取使用西安天隆科技公司生产的配套病毒DNA/RNA提取试剂盒和全自动核酸提取仪（Gene Rotex96）。提取的核酸样本置于1.5 mL EP管中置于-80℃冷冻保存。本次送检样本为41只鼠的肝脏样本41份，小肠样本34份，其中22份样本出现目标条带。

1.3 样本的PCR扩增与质检

扩增靶标为16S rDNA V3V4区的一段序列，扩增序列为：前端引物F前（5'-CTAYGGGCASCAG-3'）；后端引物R后（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）。

扩增体系：Taq酶25 μL，H₂O补足50 μL体系，F前（10 μM）1 μL，R后（10 μM）1 μL，DNA约50 ng，BSA 1 μL。

普通PCR扩增条件：变性95℃ 2 min；退火95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，31个循环；延伸72℃ 5 min。

电泳条件：1.5%琼脂糖凝胶，100 V，30 min。PCR产物上样量为3 μL。扩增过程设置阴性对照。

1.4 二代测序

二代基因测序过程委托广东美格基因科技有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 病原体构成

2.1.1 判定标准

返回的数据为OTU表分析模式：分析结果包含OTU表（带有注释信息）及OTU代表序列。病原体阳性判定标准：序列数≥50条^[3]。

2.1.2 鼠肠检测结果

从16份鼠肠的组织样本中检出志贺氏菌、幽门螺杆菌、梅毒螺旋体、巴尔通体、立克次小体属、肠球菌、葡萄球菌、链球菌、弧菌、不动杆菌等病原体，检出率分别为100%、100%、6.25%、25%、0、68.75%、43.75%、75%、31.25%、12.5%，见表1。

2.1.3 鼠肝检测结果

从6份鼠肝的组织样本中检出志贺氏菌、幽门螺杆菌、梅毒螺旋体、巴尔通体、立克次小体属、肠球菌、葡萄球菌、弧菌、不动杆菌等病原体，检出率分别为100%、100%、0、33.33%、16.67%、50.00%、33.33%、50.00%、0，见表2。

2.1.4 mNGS与传统检测方法对比

在编号为S2023018鼠的鼠肠（C018）和鼠肝（G018）中同时检出志贺氏菌、幽门螺杆菌。应用二代测序技术，巴尔通体在编号为C10、C36、C37、C38（鼠肠），G18、G29、G35（鼠肝）检出阳性，除C18样本外，其他样本与荧光定量PCR的检出结果一致（表3）。

荧光定量PCR检测方法使用巴尔通体核酸测定试剂盒（上海之江生物有限公司）进行检测，有明显扩增曲线且Ct值≤38即判定为阳性反应。

表3 不同检测方法检出巴尔通体情况

Table 3 Detection of Bartonella by different detection methods

注: “-”代表阴性, “+”代表阳性.

3 讨论

本研究采集了鼠的肝脏、小肠样本进行mNGS分析，除检出已知病原体外，还检出了其他病原体。通过传统的检测方法^[4-6]，使用鼠肝检测巴尔通体、钩端螺旋体、鼠疫杆菌、伯氏疏螺旋体、立克次体、土拉热弗朗西氏菌等病原体，仅检出巴尔通体4例，检出率为9.76%（4/41）。应用二代测序技术，巴尔通体检出率为17.07%（7/41），大大提高了检出效率。有研究表明，相较于传统检测方法，mNGS在病原体的检出方面具有更高的灵敏度^[7]，这与本研究结果一致。无论是传统的检测方法还是应用mNGS的方法，检出最多的病原体是巴尔通体。还有研究表明巴尔通体在啮齿动物中的感染很普遍，感染动物包括猫、狗、牛、羊、鼠和蝙蝠等，感染趋势由家鼠向野鼠转变^[8]。巴尔通体通过虱、蚤、蜱等吸血节肢动物从动物传播给人类，或者被受感染的动物抓伤等途径感染人类^[9]。在农牧地区，巴尔通体感染应纳入不明原因引起的发热和淋巴结肿大的病因考虑因素。

同时，在获得目标片段的16份鼠肠样本和6份鼠肝样本中，志贺氏菌、幽门螺杆菌检出率为100%。志贺氏菌是引起细菌性痢疾的重要病原体^[10]，幽门螺杆菌寄生在胃黏膜组织中，常引起慢性胃炎和消化性溃疡等疾病^[11]。这两种细菌都能通过粪口途径传播，导致疾病在人与动物之间、人与人之间的传播和流行。在鼠肠道中检出志贺氏菌和幽门螺杆菌，提示鼠形动物通过污染水源、土壤等介质传播疾病存在可能。

部分样本还检出梅毒螺旋体、立克次体、肠球菌、葡萄球菌、链球菌、弧菌、不动杆菌等病原体。应用传统检测方法，未检出立克次体。立克次体是引起斑疹伤寒的主要病原体，跟巴尔通体一样可以通过节肢动物吸血在人和动物之间传播疾病。肠球菌、葡萄球菌、弧菌、不动杆菌等都是与人类感染性疾病相关的细菌，鼠形动物可能通过粪便污染环境导致人类感染相关疾病。

本研究中，mNGS技术展现了其快速、准确、全面的优势，能够同时检测多种病原体，避免了传统方法的局限性。目前mNGS技术多用于临床上未知病原体的检测，没有统一的规范和质量控制标准，临床上为避免过度诊断和治疗，会根据标本类型、临床表现和传统病原学特征进行综合判断^[12-15]，既使报告序列数极低，也不能完全排除相应病原体感染的可能性^[13]。本研究将mNGS技术应用于鼠形动物携带的病原体检测，对报告结果的解读，除考虑样本类型的定值菌、条件致病菌外，重点关注可致病病原体，如鼠疫、钩端螺旋体、汉坦病毒、立克次体、巴尔通体、伯氏疏螺旋体等。参考夏宇等^[3]的研究，以OTU序列数≥50作为阳性判断标准。

根据监测结果，编号为S2023038的鼠是一只自毙鼠，检测结果中巴尔通体序列数达63542条，提示被捕获鼠形动物本身的生命状态可能与其是否携带病原体有关。在日常的病媒监测工作中，应重点关注出现动物尸体的区域，并做好人员防护。

通过应用mNGS技术，本研究对西藏吉隆口岸鼠形动物携带的病原体进行了全面的基因组分析，揭示了该地区鼠形动物携带多种病原体的存在，而mNGS技术在病原体检测中的应用具有广阔前景，对病原体的监控和防控、保障公共卫生安全具有积极作用。

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表1 鼠肠组织中检出病原体情况

Table 1 Detection of pathogens in intestinal tissues of murine animals

注: “+”代表检出相应病原体, “-”代表未检出相应病原体.

表2 鼠肝组织中检出病原体情况

Table 2 Detection of pathogens in liver tissues of murine animals

注: “+”代表检出相应病原体, “-”代表未检出相应病原体.

第7卷 第8期

2025年8月

Economic and Trade Research / 经贸研究

税则变化对进口燃料油市场影响的分析预测

张继东 ¹ 史晓峰 ¹ 沈 莉 ¹ 麦晓霞 ² 谭智毅 ²

摘 要 《中华人民共和国进出口税则（2025）》对品目27.10进行了重要调整，删除燃料油税则号列2710.1922、2710.1929，新增燃料油税则号列2710.1924，并对燃料油与其他重油的税率作出调整。本文从税则号列及税率调整对能源市场的影响角度出发，深入分析了燃料油的产品标准，并研究了税则号列调整对进口油品的影响，为能源市场相关参与者与监管者提供参考。

关键词 燃料油；重油；税则；税率

Analysis and Forecast of the Impact of Tariff Changes on the Imported Fuel Oil Market

ZHANG Ji-Dong ¹ SHI Xiao-Feng ¹ SHEN Li ¹ MAI Xiao-Xia ² TAN Zhi-Yi ²

Abstract In 2025, Import and Export Tariff of the People’s Republic of China has made important adjustments to the heading 27.10. The fuel oil subheadings 2710.1922 and 2710.1929 have been deleted, and a new fuel oil subheading 2710.1924 has been introduced. Moreover, the tax rates for fuel oil and heavy oil have been adjusted. Starting from the impact of the adjustment of subheadings and tax rates on the energy market, this article conducts an in-depth analysis of the product standards of fuel oil and studies the impact of the adjustment of subheadings on the import of oil products, aiming to provide references for relevant participants and regulators in the energy market.

Keywords fuel oil; heavy oil; tariff; tax rate

税则调整是国家宏观税收政策调控的重要手段，对于国内相关领域的稳定和健康发展具有深远影响。《中华人民共和国进出口税则（2025）》对品目27.10进行了调整，特别是对燃料油的税则号列和进口关税作出重大调整。这一调整不仅反映了国家对能源市场管理的优化，也将对能源市场的各个环节产生直接或间接影响。因此，深入研究燃料油税则的变化对能源市场的影响具有重要的现实意义。

1 燃料油产品标准分析

1.1 调整前的产品标准

在税则调整前，燃料油依据不同税则号列的条文内容（如税则号列2710.1922项下的5—7号燃料油和2710.1929项下的其他燃料油）对应各自相对明确的标准。5—7号燃料油通常具有特定的粘度、密度、硫含量等物理和化学性质，以满足不同的使用需求，如船用燃料、工业锅炉燃料等。其他燃料油则涵盖了除5—7号燃料油之外的多种燃料油产品，例如1—4号燃料油、炉用燃料油，其标准相对更为宽泛。这种分散的标准体系虽然在一定程度上适应了当时多样化的市场需求，但也带来了产品质量参差不齐、监管难度大等问题。

税则号列2710.1922项下的5—7号燃料油的技术要求来源于SH/T 0356—1996《燃料油》。在此标准中燃料油被分为1号、2号、4号轻、4号、5号轻、5号重、6号、7号共8个牌号。燃料油应符合标准中规定的指标才能归入相应的牌号，详见表1。其中，1号和2号是馏分燃料油，适用于家用或工业小型燃烧器；4号轻和4号是重质馏分燃料油，或者是馏分燃料油与残渣燃料油混合而成的燃料油，适用于要求该粘度范围的工业燃烧器；税则号列2710.1922项下的5—7号燃料油包括5号轻、5号重、6号、7号4个牌号的燃料油，这4个牌号的燃料油是粘度和馏程范围递增的残渣燃料油，适用于工业燃烧器^[1]。

表1 SH/T 0356—1996标准中燃料油的闪点和运动粘度指标

Table 1 The flash point and kinematic viscosity specifications of fuel oil in SH/T 0356—1996

1.2 调整后的产品标准变化

税则调整后，税则号列2710.1922和2710.1929。调整前不同税号下的燃料油分类略显繁杂，在实际贸易和监管中容易引发混淆。此次整合将相关燃料油统一归入税则号列2710.1924，使分类更加简洁明了，便于管理和统计。

依据本国子目注释，税则号列2710.1924项下的“燃料油”，不包括煤油馏分及柴油，具体技术指标参考GB 25989—2010《炉用燃料油》、GB 17411—2015《船用燃料油》、GB/T 29114—2012《燃气轮机液体燃料》中的运动粘度和闪点，见表2。运动粘度的试验方法采用GB/T 265《石油产品运动粘度测定法和动力粘度计算法》或GB/T 11137《深色石油产品运动粘度测定法（逆流法）和动力粘度计算法》；闪点（闭口）的试验方法采用GB/T 261《闪点的测定 宾斯基—马丁闭口杯法》，闪点（开口）的试验方法采用GB/T 267《石油产品闪点与燃点测定法（开口杯法）》。

运动粘度与闪点是燃料油归类中两个最基本的技术指标，同时也是燃料油使用安全中非常重要的技术指标。在运动粘度方面，根据不同的应用场景，如炉用、船用或燃气轮机用，规定了明确的数值范围。对于炉用燃料油，运动粘度要保证在加热炉中能够良好雾化和燃烧，以保障良好的热效率；船用燃料油的运动粘度则需适应船舶发动机的工作条件，确保在不同的航行环境下都能稳定供应。闪点是燃料油在储存、运输和使用过程中非常重要的安全性指标。高闪点的燃料油能够有效降低火灾风险，保障人员和设施安全。

但是仅满足表2中的技术指标并不能被认定为燃料油，特别是对于组分较轻的馏分燃料油，仍需结合馏程等技术指标以区分燃料油与柴油或煤油馏分。例如，某一油品既满足表2中燃料油的技术指标，也满足税则号列2710.1923项下的柴油的技术指标，应归入柴油的税则号列2710.1923。税则号列2710.1923项下的柴油的技术指标参见本国子目注释：柴油是指一种碳原子数约10～22的烃类混合物，倾点或凝点为 -50℃～30℃；50%回收温度≤300℃，90%回收温度≤355℃，95%回收温度≤365℃。

2 税则调整对进口燃料油的影响

2.1 燃料油进口成本变化

税则号列2710.1924项下的燃料油进口关税税率为6%，实施进口暂定税率3%，这意味着5—7号燃料油进口关税税率由2024年实施的暂定1%提升至3%，其他燃料油进口关税税率由6%调整为实施3%进口暂定税率，与此同时税则号列2710.1999项下的其他重油关税税率维持不变为6%。在国际市场上5—7号燃料油的价格低于粘度较低的其他燃料油，因而5—7号燃料油国内进口比重较大，本次调整将直接增加燃料油的整体进口成本。与此同时，我国燃料油的消费税为 1.2 元/升，此前作为地炼加工原料可实现近100%的进项消费税抵扣，而根据最新政策抵扣比例将下降 50%～60%^[2-3]。在关税调整和消费税抵税缩减的双重影响下，预计2025年我国燃料油进口量会出现一定幅度的下降，也将促使企业寻找更具性价比的进口来源以及调整进口策略，或者寻求国内替代资源或调整生产工艺，减少对进口油品的依赖^[4]。

2.2 燃料油进口结构调整

税则调整必然会促使进口企业调整进口油品的结构。例如，5—7号燃料油进口关税税率升高，其他燃料油进口关税税率降低，会影响两者的进口比例。与此同时，燃料油进口量的缺口，特别是用于炼化的燃料油可能部分由原油或其他重油替代。根据商务部2024年10月发布的第45号公告，2025年原油非国营进口允许量为25700万吨。2024年底和2025年1月商务部已将19868吨配额分配给符合条件的企业。由于2025年上半年原油配额充足，炼化企业的原料缺口不会明显，下半年随着配额的消耗减少，炼化企业需要寻找新的解决方案以保证原料充足，这也可能会引起国内能源市场的变化。

2.3 燃料油市场竞争格局变化

进口成本的增加和进口结构的调整将会影响市场竞争格局。燃料油除了作为船用或者炉用燃烧以外^[5]，还是独立炼厂原料的重要补充，通常用来与轻质原油混合进入常减压或作为二次装置原料。此次燃料油关税的调整，预计使得炼厂进口燃料油成本增加80～90元/吨，将降低独立炼厂对于燃料油进口的加工需求，这使得独立炼厂在行业中的竞争力进一步降低^[6]。部分进口企业可能会因成本上升而退出市场，而大型企业可能会凭借其政策优势、规模优势和资源整合能力，在市场竞争中占据更有利的地位，有利于国内产业的整合优化以及产业升级，例如从成品油的生产转向更高附加值和环保的石化产品^[7-8]。

3 结语

《中华人民共和国进出口税则（2025）》对品目27.10的调整，对燃料油市场产生了多方面的影响。在燃料油产品标准方面，调整后更加明确、统一；在燃料油的界定上，需要更加科学和细化的标准；在进出口油品方面，进口成本、进口结构、市场竞争格局等都将受到不同程度的影响。相关部门应加强对能源市场的监管和引导，确保税则调整政策的顺利实施，促进能源市场的健康、稳定发展。

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基金项目：海关总署科研项目（2023HK113）

第一作者：张继东（1978—），男，汉族，山东临沂人，硕士，研究员，主要从事涉税化验工作，E-mail: 13918256560@163.com

1. 上海海关工业品与原材料检测技术中心 上海 200135

2. 广州海关技术中心 广州 510623

1. Technical Center for Industrial Product and Raw Material Inspection and Testing of Shanghai Customs, Shanghai 200135

1. Guangzhou Customs Technical Center, Guangzhou 510623

表2 税则调整后燃料油的闪点和粘度的指标要求

Table 2 The flash point and viscosity requirements for fuel oil after tariff adjustments