田绿波 石莹 李梦秋 王璇 刘杨 张青

摘 要 本研究针对口岸猴痘病毒快速检测及感染者自检需求，采用红色乳胶微球包被抗猴痘病毒A29L抗原的单克隆抗体，研制了猴痘病毒抗原的快速检测试剂盒。应用猴痘A29L蛋白标准品进行灵敏度测试，结果表明该试纸条检测线为20 pg/mL。同时，应用50例猴痘临床阳性样本及98例阴性样本进行性能验证，阳性符合率为76%，阴性符合率为100%，总符合率为91.89%。其中，阳性符合较率阴性符合率偏低的主要原因是测试样本病毒含量较低以及未使用试剂盒配套采样液，从而影响了检测效果。但综合来看，该试剂盒特异性强，检测时长≤15 min，具有快速、灵敏度高、便于操作的特点，满足口岸旅检现场和试验室快速检测的需求，适用于出入境人员及重点人群开展猴痘病毒监测。

关键词 猴痘；免疫层析法；红乳胶；即时检测

Development of a Rapid Red Latex Immunochromatographic Assay Kit for the Detection of Monkeypox Virus Antigens

TIAN Lyu-Bo ¹ SHI Ying ¹ LI Meng-Qiu ¹ WANG Xuan ¹ LIU Yang ¹ ZHANG Qing ^1*

Abstract To address the demand for rapid detection of monkeypox virus (MPXV) at customs ports and self-testing by individuals with suspected infection, this study developed a rapid detection kit for monkeypox virus antigens. The kit employed red latex microspheres coated with monoclonal antibodies targeting the A29L antigen of MPXV. Sensitivity testing was performed using monkeypox A29L protein standards, and the results demonstrated that the detection limit of the test strip was 20 pg/mL. Meanwhile, performance validation was conducted with 50 clinically confirmed monkeypox samples and 98 negative samples. The positive concordance rate was 76%, the negative concordance rate was 100%, and the total concordance rate was 91.89%. The primary factors contributing to the relatively low positive concordance rate include low viral load in samples and the failure to use the sampling solution provided with the kit, which compromised the detection results. Overall, the kit exhibits high specificity, with a detection time of ≤15 minutes, and offers advantages such as rapidity, high sensitivity, and ease of operation. Its sensitivity meets the requirements of on-site travel inspection at customs ports and rapid laboratory detection, making it suitable for MPXV monitoring among entry-exit personnel and key populations.

Keywords monkeypox; immunochromatography; red latex; point-of-care testing (POCT)

基金项目：海关总署科研项目（2023HK062，2024HK034）；四川省科技计划项目（2024YFFK0056）

第一作者：田绿波（1975—），女，汉族，重庆人，硕士，主任技师，主要从事传染病检测、卫生检验、医学检验及试验室生物安全等工作，E-mail: 775779563@qq.com

通信作者：张青（1991—），女，汉族，四川自贡人，硕士，中级农艺师，主要从事卫生检疫工作，E-mail: 1213356627@qq.com

1. 四川国际旅行卫生保健中心（成都海关口岸门诊部） 成都 610041

1. Sichuan International Travel Health Care Center (Chengdu Customs District Port Outpatient Clinics), Chengdu 610041

猴痘是一种人畜共患病，其病原体为猴痘病毒（Monkeypox Virus，MPXV）。该病毒最早于1958年在出现痘疹症状的食蟹猴体内被发现，因此得名。20世纪，猴痘病毒主要集中在中非和西非的热带雨林地带。随着21世纪全球贸易发展和人口流动加剧，猴痘逐渐突破地域限制，在全球范围内传播，这不仅严重威胁到人类健康，也给全球公共卫生防控体系带来巨大压力^[1-3]。我国周边的不少国家与地区已先后出现猴痘疫情，并且暴发的猴痘疫情展现出诸多有别于以往的非典型特点，而且这些特点还在持续发生变化，给当前口岸监测工作带来了诸多挑战^[4-7]。

流行病学调查显示猴痘感染者中明确为男男性行为人群的超过96%^[8]，这些感染者有自愿自我检测需求，因此，亟需能满足基层及居家精准检测、操作方便的快速检测试剂。此外，医护人员开展猴痘检测主要依赖于实时荧光聚合酶链式反应（Real-Time Fluorescence Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测病毒核酸^[3,9]，但该方法只能在专业试验室中开展，且检测时间较长，成本也较高。因此，如何快速、准确地实施现场监测成为科学研究的热点。本研究结合免疫法和层析技术，研制了一款猴痘病毒抗原红乳胶免疫层析快速检测试剂盒。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猴痘—包被抗体、猴痘—标记抗体（江苏东抗生物医药科技有限公司）；红乳胶（成都微瑞生物科技有限公司）。阳性标准品1，猴痘病毒A29L重组蛋白标准品（江苏东抗生物医药科技有限公司）。

10例猴痘临床阳性疱疹液样本来源于四川省疾病预防控制中心P3试验室，4例猴痘临床阳性咽拭子样本分别来自重庆国际旅行卫生保健中心、深圳国际旅行卫生保健中心、珠海国际旅行卫生保健中心试验室，均保存于灭活型病毒保存液中，36份猴痘病毒培养液来源于宁波国际旅行卫生保健中心P3试验室。

98例猴痘阴性样本中包含30例新冠阳性咽拭子样本、30例流感阳性咽拭子样本、5例呼吸道合胞病毒阳性咽拭子样本、5例鼻病毒阳性咽拭子样本、5例偏肺病毒阳性咽拭子样本、8例登革热阳性血清样本、2例基孔肯雅热阳性血清样本及13例呼吸道病原体筛查全阴性样本，均来源于四川国际旅行卫生保健中心试验室。

上述所使用样本均通过单位的伦理审查委员会审查（批准号：SCITHC-ERB2025-004）。

其他原辅材料参考已发表文献^[10]。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机（CHT210R，湖南湘仪试验室仪器开发有限公司）；纳米粒度仪（Nanotrac™ 150，MicrotracBEL公司）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝JY92-IIN，上海习仁科学仪器有限公司）；恒温鼓风干燥箱（101-2，杭州金丰仪器设备进出口有限公司）；点膜仪（GA-RFDS-001，杭州格伦坤科技有限公司）；切割机（GA-HSG-001，杭州格伦坤科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂卡的配制与组装

在聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）底板表面粘贴硝酸纤维素膜，取0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液（Phosphate-Buffered Saline，PBS）（pH = 7.4）作为稀释液，将猴痘病毒A29L单克隆抗体与兔抗鼠抗体分别稀释至工作浓度。调试点膜喷金仪，设定T线、C线的划膜量为1 μL/cm，随后将上述2种生物原料以0.5 cm的间距喷布在硝酸纤维素膜（NC膜）上。将处理后的硝酸纤维素膜置于37℃烘箱中烘干4 h，取出后用封闭液（0.5%牛血清蛋白，0.1% Proclin 300）封闭30 min，再次放入37℃烘箱中烘干2 h，最后装入铝箔袋密封保存，以备后续试验使用。

取上述已制备完成的猴痘病毒A29L单克隆抗体红色乳胶微球，使用特定稀释液（0.05 mol/L PBS，pH = 7.2；1% BSA；1% Tween-20）将其稀释至工作浓度。随后借助点膜喷金仪，按照 2 μL/cm 的用量均匀喷涂在标记物垫上，经避光干燥4 h后，装入铝箔袋进行包装，留待后续使用。

1.3.2 试剂卡条件优化

（1）抗体和微球偶联质量比优化。依照前述的抗体微球标记操作方法，将猴痘病毒A29L抗体与微球的质量比例分别设定为1∶5、1∶10、1∶20、1∶40。在此条件下，对猴痘病毒A29L蛋白阳性标准品1（160 pg/mL）以及采样液进行检测，进而观察T线、C线的显色情况。

（2）抗体最佳包被浓度优化。将包被用的猴痘病毒A29L单克隆抗体分别稀释至0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL共5种梯度浓度，然后将其包被在硝酸纤维素膜（NC膜）的T线位置；同时，在C线位置包被兔抗鼠Ig G，设定其浓度为0.8 mg/mL。依照前文所述的操作流程，制备出T线浓度各异的NC膜，再将这些NC膜分别与 1.3.1节中制备的红乳胶微球标记物垫进行组装，制作成检测卡。使用该检测卡对猴痘病毒A29L蛋白阳性标准品1（160 pg/mL）和采样液展开检测，并观察T线、C线的显色状况。

（3）样本加样量优化。设定样本的加样体积分别为60 µL、80 µL、100 µL与120 µL，对猴痘病毒A29L蛋白阳性标准品1（160 pg/mL）及采样液展开检测，以此观察层析过程中的具体状况和最终得到的层析结果。

（4）层析时间优化。采用已制备完成的试剂卡，对猴痘病毒抗原 A29L 蛋白阳性标准品1（浓度160 pg/mL）及采样液实施分别检测，进而观察 T线、C 线在5 min、10 min、15 min、20 min、25 min时的显色情况。​

1.3.3 性能验证

（1）最低检出限。以采样液为稀释介质，将阳性标准品分别稀释至10 pg/mL、20 pg/mL、40 pg/mL、80 pg/mL、160 pg/mL、320 pg/mL，每个浓度梯度均重复检测20次，最终把阳性检出率超过95%时对应的最低浓度值确定为最低检出限。

（2）特异性。选择羊痘病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛痘、痘苗病毒、带状疱疹、湿疹、单纯疱疹、疥疮、立克次体痘、细菌性皮肤感染、药物相关性皮疹等病原体阳性样本，用稀释液1∶10稀释用于特异性检测。选择30例新冠阳性咽拭子样本、30例流感阳性咽拭子样本、5例呼吸道合胞病毒阳性咽拭子样本、5例鼻病毒阳性咽拭子样本、5例偏肺病毒阳性咽拭子样本、8例登革热阳性血清样本、2例基孔肯雅热阳性血清样本，共计85份样本用于特异性检测。

（3）符合率。应用10例猴痘临床阳性疱疹液样本、4例猴痘临床阳性咽拭子样本、36份猴痘病毒培养液，共计50份样本用作本试验的阳性比对样本。50份样本均经过猴痘病毒实时荧光PCR检测确定。采用98例阴性咽拭子作为阴性比对。在98例猴痘阴性样本中包含13例呼吸道病原体筛查全阴性样本。所有阴性样本均经过猴痘病毒实时荧光PCR检测确认。

（4）精密度。从同一批次的试剂卡中随机抽取样本，对3种不同浓度（20 pg/mL、80 pg/mL、320 pg/mL）的A29L蛋白阳性标准品1以及1份阴性对照分别进行检测，每一份样本在同批次内检测10次，观察其一致性。随机选取4个批次的试剂卡，对3种浓度（20 pg/mL、80 pg/mL、320 pg/mL）的A29L蛋白阳性标准品1及1份阴性对照展开分别检测，每个样本按不同批次各检测4次，待检测工作完成后，观察其一致性。

2 结果与讨论

2.1 抗体和红色乳胶微球偶联质量比优化

设定 A29L 抗体与红乳胶微球的质量比例为1∶5、1∶10、1∶20、1∶40，对猴痘病毒A29L 蛋白阳性标准品1（即阳性标准品）和采样液（即阴性标准品）进行检测。检测结果显示，在微球使用浓度相同的条件下，随着抗体与微球质量比的增大，阳性标准品检测中T线的显色强度按从深到浅的顺序排列为1∶5、1∶10、1∶20、1∶40。对阴性标准品的检测结果则表明，当抗体与微球质量比为1∶5时，T线显色相较于其他微球标记量略为明显，而质量比为1∶10时T线未出现显色（图1）。综合上述结果，确定抗体与微球的最佳偶联质量比为1∶10。

C线: 质控线; T线: 检测线

图1 抗体与红乳胶微球偶联质量比对检测结果的影响

Fig.1 Effect of coupling quality between antibodies and red latex microspheres on detection results

2.2 抗体最佳包被浓度优化

将NC膜T线包被猴痘病毒A29L抗体的浓度分别设为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL，检测阳性标准品和阴性标准品。试验结果表明，检测阳性标准品，检测T线显色深度随抗体浓度增加而增加，当浓度达到1.6 mg/mL时，显色不再增强，但是阴性标准品出现假阳显色现象（图2）。考虑到抗体使用成本和最优结果，选择0.8 mg/mL的包被浓度作为猴痘病毒A29L抗体最佳包被浓度。

C线: 质控线; T线: 检测线

图2 猴痘病毒A29L抗体包被浓度对检测结果的影响

Fig.2 Effect of coating concentration of MPXV A29L antibody on detection results

2.3 样本加样量优化

将样本加样量的试验量分别设为60 µL、80 µL、100 µL、120 µL，检测阳性标准品和阴性标准品。结果发现，滴加量为100 µL、120 µL时，偶有部分卡条出现样本泄漏或层析不及时现象。滴加60 µL的卡条中，T线和C线可能存在层析不均一现象，同时考虑加样中病毒含量减少的因素，80 µL在层析状态和检测阴阳结果最佳，因此后续试验选择80 µL加样量，如图3所示。

图3 样本加样量优化结果

Fig.3 Optimization results of sample loading volume

2.4 层析时间优化

依据上述优化后的条件制备检测卡，分别对阳性标准品和阴性标准品进行检测，观察二者在层析5 min、10 min、15 min、20 min、25 min时显色信号的变化。结果显示，检测阴性对照品时，在这几个时间点均无显色现象；检测阳性标准品时，T线的显色亮度呈现出 20 min≈15 min＞10 min＞5 min的趋势，且15～20 min期间T线亮度变化较小（图4）。考虑到市售的大部分产品将判读时间设定在10～20 min，这一时间段也更易被使用者接受，结合本研究得出的最佳层析时间结果，最终将层析时间确定为15 min。​

2.5 性能验证

2.5.1 最低检出限

用采样液将阳性标准品1稀释至10 pg/mL、20 pg/mL、40 pg/mL、80 pg/mL、160 pg/mL，每个浓度重复检测20次。结果显示，将阳性标准品稀释到20 pg/mL时仍能100%检出（表1），但浓度稀释至10 pg/mL时，阳性检出率为20%。因此，本检测试剂的最低检出限为20 pg/mL。

表1 最低检出限检测结果

Table 1 Detection results of minimum detection limit

注: “+”代表阳性; “-”代表阴性.

2.5.2 特异性试验

（1）用猴痘病毒抗原胶体金检测卡检测羊痘病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛痘、痘苗病毒、带状疱疹、湿疹、单纯疱疹、疥疮、立克次体痘、细菌性皮肤感染、药物相关性皮疹等病原体阳性样本，结果均为阴性（图5），无交叉反应。

（2）30例新冠阳性咽拭子样本、30例流感阳性咽拭子样本、5例呼吸道合胞病毒阳性咽拭子样本、5例鼻病毒阳性咽拭子样本、5例偏肺病毒阳性咽拭子样本、8例登革热阳性血清样本、2例基孔肯雅热阳性血清样本，以上咽拭子样本均为非灭活型病毒保存液中保存，共计85份样本，用本试验研制的试剂卡检测结果均为阴性（表2），无交叉反应。

2.5.3 符合率测试

（1）阳性符合率。应用10例猴痘临床阳性疱疹液样本、4例猴痘临床阳性咽拭子样本、36份猴痘病毒培养液进行检测，共检出7例猴痘临床阳性疱疹液样本及31份猴痘病毒培养液。其中，有3例猴痘临床阳性疱疹液样本、4例猴痘临床阳性咽拭子样本以及5份猴痘病毒培养液未检出（图6），总体阳性符合率为76%。

（2）阴性符合率。应用98例猴痘病毒阴性样本进行检测，包含30例新冠阳性咽拭子样本、30例流感阳性咽拭子样本、5例呼吸道合胞病毒阳性咽拭子样本、5例鼻病毒阳性咽拭子样本、5例偏肺病毒阳性咽拭子样本、8例登革热阳性血清样本、2例基孔肯雅热阳性血清样本和13例呼吸道病原体筛查全阴性样本。检测结果均为阴性，总体阴性符合率为100%（表3）。

根据以上结果计算总符合率为91.89%。其中，阳性符合率为76.00%，阴性符合率为100.00%。

2.5.4 精密度试验

（1）批内精密度测试。从同一批次的试剂卡中随机抽取样本，对3种不同浓度（20 pg/mL、80 pg/mL、320 pg/mL）的A29L蛋白阳性标准品1以及1份阴性对照分别进行检测，每一份样本在同批次内检测10次，观察其一致性。结果显示，10次检测结果均一致，一致性高（表4）。

表4 猴痘病毒抗原检测试剂盒批内重复性试验结果

Table 4 Results of intra-batch reproducibility test for MPXV antigen detection kit

注: “ + ” 代表阳性; “ - ” 代表阴性.

（2）批间精密度测试。随机选取4个批次的试剂卡，对3种浓度（20 pg/mL、80 pg/mL、320 pg/mL）的A29L蛋白阳性标准品1及1份阴性对照展开分别检测，每个样本按不同批次各检测4次，观察其一致性。结果显示，4次检测结果均一致，一致性高（表5）。

3 结论

本研究选用包被猴痘病毒A29L单抗，研制了一款猴痘病毒抗原红乳胶免疫层析快速检测试剂盒。该试剂盒灵敏度试验表明可检测20 pg/mL的重组表达A29L蛋白，方法操作简便、快捷，15 min肉眼判断结果，可实现现场快速检测，对阳性样本再送试验室核查确诊，为猴痘疫情防控提供及时诊断（Point-of-Care Testing，POCT）。

表5 猴痘病毒抗原检测试剂盒批间重复性试验结果

Table 5 Results of inter-batch reproducibility test for MPXV antigen detection kit

注: “ + ” 代表阳性; “ - ” 代表阴性.

猴痘阳性样本验证中，有12例未检出，其中一部分是因为样本Ct值较高，主要考虑是因为病毒含量相对较少，且未采用试剂盒自带的稀释液稀释，而是直接滴加的80 µL病毒保存液，稀释倍数较大（病毒保存液为3 mL，试剂盒自带稀释液500 µL），病毒抗原检测浓度低造成的。另外一部分原因为留存的猴痘阳性病毒均保存于灭活型病毒保存液中，未使用试剂盒配套的采样液检测。灭活型病毒保存液中具有蛋白变性剂，例如高浓度胍盐、盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种组合以及非离子型表面活性剂^[11]，可裂解病毒蛋白，影响或干扰了病毒抗原蛋白检测，而本试剂盒提供的稀释液经反复验证适合层析法。未来可考虑进一步研制可适用于灭活病毒检测的试剂盒，拓宽试剂盒的适用面。

目前，猴痘病毒诊断的主要方法是实时荧光PCR核酸检测，该技术对试验室条件和专业人员要求较高，且检测周期较长，在适应大规模筛查和快速自检需求方面还有一定提升空间。因此，开发一种高效、便捷的检测方法显得尤为重要。本试剂盒基于抗原—抗体反应的快速检测技术采用双抗体夹心原理，显著提高了检测的特异性，有效减少了误判的可能性。这种检测方法具有明显优势：一是检测时间大幅缩短，仅需15 min即可获得结果，适合现场即时检测；二是操作流程简单，无需复杂仪器和专业培训；三是与核酸检测相比，其对样本质量的要求更为宽松。相较于同类试剂盒胶体金微球包被，乳胶法使用的乳胶颗粒直径通常在100～300 nm之间，比胶体金颗粒（20～40 nm）更大，其表面可以共价偶联更多的抗体，从而提高检测的灵敏度。乳胶法的灵敏度可达pg/mL级，而胶体金法通常为ng/mL级，乳胶法的灵敏度比胶体金法约高10倍。该技术适用于口岸旅检现场快速筛查、重点人群居家自检，可作为实时荧光PCR检测的补充手段，为猴痘疫情防控提供即时诊断支持。

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C线: 质控线; T线: 检测线

图4 层析时间对检测结果的影响

Fig.4 Effect of chromatography time on detection results

表1（续）

图5 特异性试验结果

Fig.5 Results of specificity experiment

表2 特异性试验结果统计表

Table 2 Statistical table of specificity test results

图6 猴痘临床阳性疱疹液的测试结果

Fig.6 Test results of clinically positive MPXV herpes fluid

表3 猴痘病毒红乳胶抗原检测卡符合率统计结果

Table 3 Statistical table of concordance rate for red latex antigen detection card of MPXV