汪圣强 孙悦 郜云 费吟濠 杨国平 郭晔 朱军 潘晶迪

摘 要 重组酶介导等温核酸扩增（Recombinase Aided Amplification，RAA）是一项可在恒温条件（37～42℃）下指数级扩增目的基因的核酸检测技术，反应仅需5～20 min，操作简单便捷，在多种病原体的检测中展现出优异性能。本文系统梳理了RAA技术在口岸传染病监测中的应用实例，并探讨了RAA技术的未来发展方向，为相关领域研究提供参考。

关键词 等温扩增；重组酶介导等温核酸扩增；聚合酶链式反应；即时检验；传染病监测

A Brief Discussion on the Application of RAA Technology in Port Infectious Disease Surveillance

WANG Sheng-Qiang^1,2 SUN Yue^1,2 GAO Yun^1,2 FEI Yin-Hao^1,2

YANG Guo-Ping³ GUO Ye³ ZHU Jun³ PAN Jing-Di^1,2*

Abstract Recombinase aided amplification (RAA) is a nucleic acid detection technology that enables exponential amplification of target genes under isothermal conditions (37-42°C). The reaction requires only 5-20 minutes and is simple and convenient to operate, demonstrating excellent performance in the detection of various pathogens. This article systematically reviews application examples of RAA technology in port infectious disease surveillance and explores its future development directions, providing a reference for research in related fields.

Keywords isothermal amplification; recombinase aided amplification; polymerase chain reaction; point-of-care testing; surveillance of infectious diseases

近年来，等温扩增技术兴起，突破了传统的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术所需设备要求高、检测时间长、依赖专业试验室等局限性，为即时检验（Point-of-Care Testing， POCT）奠定了关键技术基础。作为等温扩增技术中的成熟分支，重组酶介导等温核酸扩增（Recombinase Aided Amplification，RAA）技术仅需一对扩增引物，即可在恒温条件（37～42℃）下短时间（5～20 min）内完成对目的基因的高效扩增，操作简便、价格低廉，使得在资源有限的现场环境下进行快速、准确的核酸检测成为可能，在口岸传染病监测领域中展现出极大的应用潜力^[1-2]。

1 RAA技术概述

1.1 基本原理

RAA技术基于重组酶、单链结合蛋白（Single-Stranded DNA-Binding Protein，SSB）和DNA聚合酶的协同作用实现核酸扩增。首先，在三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）辅助下，重组酶、SSB与引物DNA形成复合体，并扫描模板DNA，当识别到与引物完全互补的序列时，重组酶通过链置换活性将引物插入模板链；同时，SSB维持模板DNA处于稳定的单链状态，DNA聚合酶催化互补链合成^[3]。重复循环上述过程，5～20 min即可完成目标核酸的指数级扩增。

1.2 试验方法

RAA检测的操作流程围绕样本处理、反应体系配置、恒温扩增及结果判读展开。具体如下：

样本处理需根据检测对象选用合适的处理方式。如呼吸道样本，可置于含裂解液的采样管中，经涡旋振荡、静置后取上清；血液样本经抗凝处理后取部分加入裂解液，孵育一段时间即可。低载量或高杂质样本可通过磁珠法/柱式法提取核酸，部分场景可省略提取步骤。

反应体系的配置，即按照一定比例混合基础缓冲液、特异性引物、荧光探针、模板核酸，最后加入镁离子溶液启动反应。基础缓冲液中含有SSB、重组酶、DNA聚合酶、三羟甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris）等反应所必需的基础成分。若模板为RNA，基础缓冲液中还需加入逆转录酶等成分。

恒温扩增阶段是将上述反应体系放入便携式恒温装置中，如水浴锅，实现目标核酸指数级扩增的过程。

结果判读可结合多种方式，包括凝胶电泳、实时荧光检测仪、测流层析试纸条（Lateral Flow Dipstick，LFD）等。

1.3 特点与优势

RAA技术的准确性与“金标准”PCR相一致，其单拷贝级的检测灵敏度及通过长引物设计（≥30 bp）实现的高特异性，有助于在感染者出现明显症状前精准检出病原体，为传染病快速诊断、早期预警和精准防控提供了关键技术保障^[4-6]。

此外，RAA技术还具有以下独特优势：（1）突破了传统核酸扩增检测方法对热循环设备的依赖，仅需便携式恒温装置即可完成全流程检测。（2）可将新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome CoronaVirus-2，SARS-CoV-2）核酸检测时长缩短至15 min，显著提高口岸传染病筛查效率。（3）试剂组分简单，操作流程简化（仅需涡旋振荡与恒温孵育），技术人员经短期培训即可上岗开展检测，大幅提升POCT可及性^[7-8]。

2 口岸传染病监测中的应用实例

凭借快速、灵敏、特异的特性，RAA技术已广泛用于呼吸道病原体、消化道病原体等多种病原体的核酸检测技术开发，为口岸传染病监测工作提供了新思路。

2.1 呼吸道病原体

Li等^[9]构建了一种靶向SARS-CoV-2orf1ab基因的逆转录—重组酶介导等温核酸扩增（Reverse Transcription-Recombinase Aided Amplification，RT-RAA）检测体系，灵敏度提升至0.48 copies/μL，可覆盖98%以上变异毒株，临床样本检测结果与逆转录—聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）相一致。有研究人员将RAA技术与规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated proteins 12a，CRISPR-Cas12a）、LFD相结合，发展出多项检测SARS-CoV-2的新方法^[10-12]。

Fan等^[13]研发了一种组合RAA和qPCR的双阶段检测方法，通过正二十二烷（Docosane）作为物理隔离层，在单管内实现了人类腺病毒3型、7型和RSV的多重检测，灵敏度高，且与其他呼吸道病毒无交叉反应。Qi等^[14]通过在呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Viral，RSV）的RAA检测体系中引入内部对照，有效规避了假阴性结果。Cui等^[15]基于甲型流感病毒M基因保守序列建立了一种RT-RAA快速检测方法，经120份临床样本验证，与RT-qPCR的检测一致性达100%。Zhang等^[16]以NS基因为靶标，建立了一种基于RAA-CRISPR-Cas13a的乙型流感病毒检测方法，仅需5 min即可检出病毒核酸，与qPCR的符合率为98.83%。曹亚玲等^[17]将RAA和CRISPR-Cas13a相结合，开发了一种系统性检测肺炎克雷伯菌的新方法。该方法的灵敏度可达1 copies/μL，并与铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌等其他临床菌株不存在交叉反应。以细菌培养作为金标准时，RAA-CRISPR-Cas13a的符合率为100%。

2.2 消化道病原体

安柏霖等^[18]将RAA与CRISPR-Cas13a联合，开发了一种快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7的方法，检测限为1～10 copies/μL，与其他10种细菌无交叉反应。通过200份实际样本和40份人工污染样本验证，该方法与RT-qPCR具有一致性。林志伟等^[19]构建了一种诺如病毒GⅠ和GⅡ型的可视化快速检测方法，检测限分别为10^-2 ng/μL和1 ng/μL，与轮状病毒、甲型肝炎病毒等均无交叉反应。Li等^[20]开发了2种基于RAA技术的快速检测方法，用于肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的可视化检测。

2.3 其他病原体检测

张阳等^[21]将RAA与LFD相结合，用于登革病毒4种血清型的快速检测。结果表明，该方法检测限低至10 copies/反应，优于传统PCR（50 copies/反应），重复性良好（变异系数4.23%～8.20%）。刘昊泽等^[22]以水痘—带状疱疹病毒（Varicella-Zoster Virus，VZV）基因组中高度保守的orf28基因区域为检测靶标，建立了一种可在20 min内完成的RAA检测方法。Mao等^[23]针对猴痘病毒高度保守的G2R基因设计了特异性引物与探针，构建了一种基于RAA-LFD的可视化快速检测方法，检测限约10 copies/反应，与牛痘病毒、水痘—带状疱疹病毒等未存在交叉反应。莫胤康等^[24]将RAA与CRISPR-Cas13a相结合，用于乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）DNA检测。该方法具有特异性，灵敏度可达1 IU/mL，且与PCR的检测结果相一致。

3 结语与展望

随着国际间交流日益密切，传染病跨境传播风险也随之增加。传统的病原体检测方法时间长、操作复杂，对于在未来实现口岸现场传染病快速筛查工作的愿景依旧任重而道远。RAA技术具有灵敏度强、特异性好、操作简便、设备便携等优势，使其成为快速检测和现场检测的理想技术手段。

作为一种新兴技术，RAA技术将随着研究的深入得以继续优化：（1）创新引物设计：尝试简并引物和嵌套引物等策略，扩大对目标核酸的覆盖范围，提高引物与模板的结合效率。（2）研发新型重组酶：通过酶工程技术优化重组酶的结构、活性位点或催化域，或基于AI从头设计，获得催化活性更优异的重组酶，促使检测灵敏度提到进一步突破。（3）集成检测系统开发：将RAA技术与微流控芯片深度耦合，有望构建集进样、核酸提取、恒温扩增和结果输出于一体的全流程自动化便携式检测平台，推动RAA技术在口岸现场快速筛查中的应用。（4）多重检测体系构建：通过优化反应体系，排除引物之间的干扰，实现多种病原体同步检出，助力口岸“多病同防”能力建设。

未来，RAA技术的快速检测能力有助于实现传染病早期筛查，为公共卫生部门争取关键防控窗口期。同时，RAA技术的普及可推动建立广泛覆盖的疫情监测网络，及时捕捉传染病暴发的早期信号，将疫情防控关口前移，从而有效地筑牢国门安全屏障。

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基金项目：南京海关科研项目（2025KJ02）

第一作者：汪圣强（1973—），男，汉族，安徽无为人，本科，副主任技师，主要从事病原体检测新技术研发工作，E-mail: wsq0099@163.com

通信作者：潘晶迪（1994—），女，汉族，陕西汉中人，博士，主要从事卫生检疫和病原体高敏快速可视化检测方法的研发工作，E-mail: panjingdi94@163.com

1. 江苏国际旅行卫生保健中心无锡分中心（无锡海关口岸门诊部） 无锡 214000

2. 无锡海关 无锡 214000

3. 江苏国际旅行卫生保健中心（南京海关口岸门诊部） 南京 210019

1. Jiangsu International Travel Health Care Center (Wuxi Customs Port Outpatient Department), Wuxi 214000

2. Wuxi Customs, Wuxi 214000

3. Jiangsu International Travel Health Care Center (Nanjing Customs Port Outpatient Department), Nanjing 210019