啜微微 白子龙 耿庆华 贾赟 史喜菊

啜微微 ¹ 白子龙 ² 耿庆华 ^{1 *} 贾 赟 ³ 史喜菊 ^{2 *}

摘 要 本研究经过序列比对，选择羊口疮病毒的囊膜蛋白F1L基因和羊痘病毒P32基因作为靶基因设计引物，建立了可以同时检测羊口疮病毒和羊痘病毒的双重PCR检测方法。当样品中含有羊口疮病毒时，可以扩增出916 bp目的片段，当样品中含有羊痘病毒时，可以扩增出523 bp目的片段，如果样品中含有羊口疮病毒和羊痘病毒两种病毒时，则可以同时扩增出2条片段。研究结果表明，该方法特异性高，对于羊的常见传染病均不能扩增出目的条带。方法敏感性试验结果表明，该方法可以检测到最低浓度为4.05×10^-6 ng/μL病毒核酸。对46份来自养殖场的灭活病料，利用已有标准方法和该研究方法检测，结果符合率为100%，表明该方法可以用于羊口疮病毒和羊痘病毒的检测和鉴别诊断。

关键词 羊口疮病毒；羊痘病毒；双重PCR；鉴别诊断

Establishment and Application of Dual PCR Detection Method for Distinguishing Orf Virus and Capripox Virus

CHUO Wei -W ei ¹ B AI Zi -L ong ² GEN G Qing -H ua ^1* J IA Yun ³ SHI Xi -J u ^2*

Abstract Following sequence alignment, the envelope protein F1L gene of Orf virus and the P32 gene of capripox virus were selected as targets for primer design, and a duplex PCR assay that simultaneously detects Orf virus and capripox virus was developed. Amplification of a 916 bp fragment indicates the presence of Orf virus, whereas a 523 bp product is indicative of capripox virus; co-infection yields both amplicons. The assay showed high specificity: no target amplicons were obtained from any of the common ovine pathogens tested. Sensitivity evaluation revealed a detection limit of 4.05×10^-6 ng/μL of viral nucleic acid. Forty-six heat-inactivated field samples were examined in parallel with the duplex PCR and a validated reference method, giving 100% concordance. The established protocol is therefore suitable for detection and differential diagnosis of Orf virus and capripox virus.

Keywords orfr virus; capripox virus; duplex PCR; differential diagnosis

基金项目：“十四五”国家重点研发计划（2022YFD1800705）

第一作者：啜微微（1986—），汉族，辽宁沈阳人，本科，兽医师，主要从事动物检疫及外来物种鉴定研究工作，E-mail: 495636337@qq.com

通信作者：耿庆华（1977—），汉族，辽宁本溪人，博士，研究员，主要从事动物检疫及外来物种鉴定研究工作 ，E-mail: genghua77@163.com

共同通信作者：史喜菊（1975—），汉族，山西乡宁人，博士，研究员，主要从事动物检疫及境外动物卫生风险评估工作，E-mail: shixijubjciq@163.com

1. 沈阳海关技术中心 沈阳 110016

2. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

3. 大连海关技术中心 大连 116001

1. Shenyang Customs Technology Center, Shenyang 110016

2. China Customs Science and Technology Research Center, Beijing 100026

3. Dalian Customs Technology Center, Dalian 116001

羊痘又称羊天花，是由痘病毒科羊痘病毒属的羊痘病毒（Capripox Virus，CaPV）引起的一种急性、 热性、高度接触性人兽共患病。羊痘病毒包括山羊痘病毒（Goat Pox Virus，GTPV）和绵羊痘病毒（Sheep Pox Virus，SPPV）^[1]。羊口疮又称羊传染性脓疱，是由痘病毒科副痘病毒属的羊口疮病毒（Orf Virus，ORFV）引起的一种嗜上皮性人兽共患病^[2]。当绵羊和山羊共同饲养时，一个群体中可以同时感染2种以上的病毒。世界上许多地方的小反刍动物群体中均发生过绵羊痘、山羊痘和羊口疮的混合感染^[3-5]。由于羊痘具有高死亡率和高发病率，羊口疮不仅在成年人中发病率很高，而且在羔羊中死亡率甚至高达90%^[6]。由于山羊痘病毒表现出宿主特异性和发病机制的变化，可能对山羊和绵羊造成疾病威胁^[7]。同样，由于ORFV的持续性和宿主免疫逃避策略，越来越多的羊口疮暴发可能对小反刍动物构成严重威胁^[8]。CaPV可以混合方式同时发生在受ORFV感染的绵羊和山羊身上。CaPV和ORFV的流行情况、传播方式及临床症状极为相似，很难以临床症状表现判定感染何种病毒。因此，有必要建立一种可以同时鉴别诊断CaPV和ORFV的检测方法。

羊口疮病毒主要关键基因包括B2L基因、F1L基因、VEGF基因和VIR等基因家族，其中F1L基因为高度保守基因，在病毒流行过程中不易发生变异，适合用于建立诊断方法^[9]。羊痘病毒的基因组主要包含P32基因、RING finger基因和G 蛋白偶联趋化因子受体基因等。其中，P32基因是羊痘病毒中相对保守的基因，常被用于病毒检测和分类鉴定^[10]。本研究针对羊口疮病毒的囊膜蛋白F1L基因和羊痘病毒P32基因设计了一套引物组合，建立了可以同时检测CaPV和ORFV的双重PCR方法，该方法可以检测CaPV和ORFV单独感染或混合感染，可为临床工作提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

PCR Mix（2×Taq，大连宝生物公司）；DNA Marker（100 bp Lader，大连宝生物公司）；DNA Marker（DL2000，大连宝生物公司）；核酸提取试剂（MVN02，上海之江生物科技股份有限公司）。

1.1.2 毒株、病料及核酸

羊口疮细胞灭活毒、山羊痘细胞灭活毒、绵羊痘细胞灭活毒、接种羊口疮病毒和山羊痘病毒的细胞混合液（经灭活）、小反刍兽疫病毒核酸、蓝舌病毒核酸由中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病监测与研究中心馈赠。羊败血性链球菌病灭活疫苗和山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗购自哈药集团生物疫苗有限公司；口蹄疫O型/A型二价疫苗购自天康生物股份有限公司。布氏杆菌病活疫苗购自重庆澳龙生物制品有限公司。经鉴定含有羊口疮病毒、山羊痘病毒和绵羊痘病毒的绵羊和山羊的鼻拭子、羊毛和羊皮等经灭活的病料，共46份，分别来源于5家养殖场。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

从GenBank中分别获得ORFV和CaPV的全基因序列，经过比较分析，用Oligo 6设计ORFV和CaPV特异性引物，扩增ORFV引物O1和O2，可扩增片段916 bp，扩增CaPV引物C1和C2，可扩增523 bp。具体序列见表1。

1.2.2 病毒核酸的制备

本实验中所使用的核酸样本由利用全自动核酸提取仪（EX3600，上海之江生物科技股份有限公司），按照核酸提取试剂说明书提取。

1.2.3 ORFV 和CaPV的普通 PCR方法建立

（1）ORFV的普通PCR方法建立。采用25 μL的PCR反应体系，2×Taq PCR Mix 12.5 μL、引物O1、O2浓度分别选取5 μM/L、10 μM/L和20 μM/L的各1 μL进行条件筛选、去离子水补足到20 μL，混匀后瞬时离心，分装到各反应孔中；每个反应孔加入对应的核酸模板5 μL；PCR循环参数为：94℃ 预变性2 min， 95℃ 30 s，退火温度分别选取56℃、58℃和60℃，退火时间选取30 s、45s和60 s进行条件筛选，72℃ 20 s，40个循环后，72℃延伸5 min。PCR反应后，取5 μL PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳。

表1 用于多重PCR的引物信息

Table 1 Primer information for multiplex

（2）CaPV的普通 PCR方法建立。采用25 μL的PCR反应体系，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，引物C1、C2浓度分别选取5 μM/L、10 μM/L和20 μM/L的各1 μL进行条件筛选、去离子水补足到20 μL，混匀后瞬时离心，分装到各反应孔中；每个反应孔加入对应的核酸模板5 μL；PCR循环参数为：94℃ 预变性2 min，95℃ 30 s，退火温度分别选取56℃、 58℃和60℃，退火时间选取30 s、45 s和60 s进行条件筛选，72℃ 20 s，40个循环后，72℃延伸5 min。PCR反应后，取5 μL PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳。

（3）PCR扩增产物的鉴定。ORFV 和CaPV PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。

1.2.4 ORFV和CaPV双重PCR方法的建立及产物鉴定

取羊口疮细胞毒、山羊痘细胞毒、接种羊口疮病毒和山羊痘病毒的细胞混合液和接种羊口疮病毒和绵羊痘病毒的细胞混合液，按照1.2.2方法提取核酸后进行PCR反应，2×Taq PCR Mix 12.5 μL、5 μM/L的引物01、02、C1和C2各1 μL，去离子水补足到20 μL，混匀后瞬时离心，分装到各反应孔中；以提取的上述核酸为模板，每个反应孔加入对应的核酸模板5 μL进行双重PCR反应，并对反应条件进行摸索；反应后，取5 μL PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳。将扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。

1.2.5 特异性检测

提取羊口疮细胞毒、山羊痘细胞毒、绵羊痘细胞毒、羊败血性链球菌、山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗、羊败血性链球菌病灭活疫苗、接种口蹄疫O型/A型二价疫苗、布氏杆菌病活疫苗、接种羊口疮病毒和山羊痘病毒的细胞混合液以及小反刍兽疫核酸、蓝舌病病毒核酸，用建立的双重PCR方法进行扩增。

1.2.6 敏感性试验

提取ORFV病毒和CaPV细胞毒混合物的核酸和正常MDCK细胞的核酸，提取后用分光光度计测定核酸浓度，将ORFV病毒取5 μL核酸加入到45 μL蒸馏水中，再从中取出5 μL进行倍比稀释，依次为10^-1 ng/μL、10^-2 ng/μL、10^-3 ng/μL、10^-4 ng/μL、10^-5 ng/μL、10^-6 ng/μL、10^-7 ng/μL、10^-8 ng/μL。分别用建立的双重PCR方法进行扩增。

1.2.7 双重PCR的初步应用及比对试验

对46份临床疑似病料样品用NY/T 3235—2018《羊传染性脓疱诊断技术》和NY/T 576—2015《绵羊痘和山羊痘诊断技术》的标准方法以及本研究建立的ORFV和CaPV双重PCR扩增方法同时进行检测并进行比对。

2 结果

2.1 ORFV的普通PCR方法扩增结果

经对PCR反应过程中的引物浓度、退火温度和时间等条件的优化，从扩增的特异性和扩增效率方面考虑选择最佳反应条件，确定最终反应条件：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，上、下引物O1和O2浓度为5 μM/L 各1 μL，核酸模板5 μL，去离子水补足到25 μL； PCR循环参数为：94℃ 预变性2 min， 95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环后，72℃延伸5 min。反应产物扩增出特异性条带916 bp，与预期结果相符（图1）。

1: 水对照; 2: 健康羊毛对照; 3: 羊口疮病毒; 4: 感染羊口疮病毒的病料; M: DNA 标准 100 bp Lader

图1 ORFV的PCR扩增结果

Fig.1 ORFV PCR amplification results

2.2 CaPV的普通PCR方法扩增结果

经对PCR反应过程中的引物浓度、退火温度和时间等条件的优化，从扩增的特异性和扩增效率方面考虑选择最佳反应条件，确定最终反应条件：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，上、下引物C1和C2浓度为5 μM/L 各1 μL，核酸模板5 μL，去离子水补足至25 μL；PCR循环参数为：94℃ 预变性2 min，95℃ 30 s，56℃ 或58℃ 30s，72℃ 20 s，40个循环后，72℃延伸5 min。反应产物扩增出特异性条带523 bp，与预期结果相符（图2）。

2.3 PCR产物的鉴定

ORFV和CaPV的 PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。结果与GenBank发表的基因序列同源性均在99%以上。

2.4 ORFV和CaPV双重PCR扩增结果及产物鉴定

经对PCR反应过程中的退火温度、延伸时间、循环次数等条件的优化，确定最佳反应条件。反应体系为：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，5 μM/L ORFV 和CaPV 的上、下引物O1、O2、C1和C2各1 μL，核酸模板5 μL，去离子水补足到25 μL；PCR循环参数为：94℃ 预变性2 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环后，72℃延伸5 min。反应产物电泳结果如图3所示。双重PCR产物电泳后，扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，扩增的2个条带测序结果与GenBank上发表的 ORFV和CaPV的基因序列同源性均在99%以上。

1: 水对照; 2: 健康羊毛对照; 3: 羊口疮病毒; 4: 山羊痘病毒; 5: 羊口疮病毒和山羊痘病毒; 6: 羊口疮病毒和绵羊痘病毒; M: DNA 标准 100 bp Lader

图3 ORFV和CaPV双重PCR扩增结果

Fig.3 Duplex PCR amplification results of ORFV and CaPV

2.5 特异性试验结果

特异性试验结果如图4所示，接种羊口疮病毒和山羊痘病毒或绵羊痘病毒的细胞混合液可以扩增出916 bp和523 bp的两条目的条带，接种ORFV的MDCK细胞只能扩增916 bp的条带，接种GTPV的MDCK细胞和接种SPPV的MDCK细胞只能扩增出523 bp的CaPV条带，其余接种的MDCK细胞和正常MDCK细胞中未出现任何条带。

2.6 敏感性试验结果

提取ORFV病毒和CaPV细胞毒混合物的核酸和正常MDCK细胞的核酸，提取后用分光光度计测定核酸浓度（4.05 ng/μL），将ORFV病毒取5 μL核酸加入到45 μL蒸馏水中，再从中取出5 μL进行倍比稀释，依次为10^-1 ng/μL、10^-2 ng/μL、10^-3 ng/μL、10^-4 ng/μL、10^-5 ng/μL、10^-6 ng/μL、10^-7 ng/μL、10^-8 ng/μL。分别用建立的双重PCR方法进行扩增，结果4.05×10^-1～10^-6 ng/μL的ORFV病毒和CaPV细胞毒混合物能扩增916 bp的ORFV条带和523 bp的CaPV条带、4.05×10^-7～10^-8 ng/μL的ORFV病毒和CaPV细胞毒混合物未能扩增可见条带，正常MDCK细胞中未出现任何条带，如图5所示。

2.7 双重PCR的初步应用及比对试验

46份临床疑似病料样品已用NY/T 3235—2018和NY/T 576—2015方法以及本专利研发的PCR扩增方法同时进行检测，结果见表2。试验结果表明：本研究建立的ORFV和CaPV的PCR检测方法检测结果与已有标准方法检测ORFV和CaPV结果完全符合。且其中8份ORFV阳性样品中同时扩增出了ORFV和CaPV，经测序与发表的ORFV和CaPV基因序列同源性为99.2%，表明该样品为两种病毒混合感染。与已有的病毒分离鉴定方法（“金标准”方法）检测结果一致。然而，传统的病毒分离鉴定方法检测耗时较长，而且对设施环境以及检测人员的能力要求很高，而本研究中的PCR方法则适合基层实验室的检测工作，检测人员经过简单培训即可操作。

3 讨论

据研究，在不同地区山羊养殖场中，ORFV感染羊群的现象普遍存在，羔羊发病率高达80%^[11]。虽然羊群感染ORFV后死亡率较低，但感染该病的羊群食欲严重下降，病程的后期食欲废绝，进而影响其生长发育，免疫力降低。羊口疮和羊痘是目前国内外养殖中危害性较为严重的2种羊的传染病。由于这些疫病的发病表现近似，均以皮肤、黏膜产生疱疹、溃疡为相似临床症状，且常发生混合感染现象，临床上常难以进行快速、较准确而有效的鉴别诊断。两者虽然发病率都很高，但是羊痘的死亡率更高。因此，建立一种既快速，相对更准确、灵敏度高的病原联合共检方法，又可以同时鉴别这两种病的方法，对于疫病的快速诊检和采取有针对性的防控措施具有重要意义。

本研究选择羊口疮病毒的囊膜蛋白F1L基因是羊口疮病毒比较保守的基因，P32蛋白是羊痘病毒膜上的一个蛋白，由于该基因的高度保守性，因而常作为GTPV检测的理想基因^[12]。经对双重PCR反应过程中的引物浓度、退火温度和退火时间等条件进行筛选。结果显示引物浓度在5 μM/L、10 μM/L和20 μM/L时均有特异性产物扩增，而在10 μM/L和20 μM/L时会偶有非特异性条带扩增，故选择引物浓度5 μM/L为最佳反应条件。ORFV在退火温度为56℃时，扩增的特异性和扩增效率最佳；而GTPV在退火温度为56℃或58℃时，扩增的特异性和扩增效率最佳；因而双重PCR最佳反应条件选择退火温度为56℃；退火时间选取30 s、45 s和60 s时均有很好的扩增效果，从减少检测时间、缩短检测时限方面考虑，选择了30 s作为最佳退火时间。

对于羊常见的传染病病原核酸进行特异性研究，结果表明含有小反刍兽疫病毒核酸、蓝舌病毒核酸、O型/A型口蹄疫病毒核酸、山羊传染性胸膜肺炎病原核酸、羊败血性链球菌病原核酸、布氏杆菌核酸均不能扩增出目的条带。利用含有ORFV和GTPV的细胞病毒进行敏感性研究，结果本研究建立的方法对4.05×10^-6 ng/μL的核酸均有扩增结果，高于王玲玲等^[13]建立的双重RPA-LFD检测方法1.63×10^-5 ng/μL核酸的最低检出限。同时，在对养殖场实际采集的样品进行检测发现，与已有的标准方法相比较，检测结果符合率为100%。综上可以看出本研究建立的检测方法不仅操作简单，而且特异性强、敏感性较高，使用的检测设备廉价，适用于基层实验室以及大型养殖场对于羊口疮病毒和羊痘病毒的检测和鉴别诊断，为养殖场疫情的早期诊断和鉴别以及制定有针对性的防控措施提供技术保障。

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1: 水对照; 2: 健康羊毛对照; 3: 山羊痘细胞毒; 4: 绵羊痘细胞毒; 5: 接种绵羊痘病毒和山羊痘病毒的细胞混合液; m: DL2000

图2 CaPV的 PCR扩增结果

Fig.2 CaPV PCR amplification results

表2 双重PCR方法与已有标准方法检测结果比对

Table 2 Comparison of detection results between duplex PCR and validated reference method

1: 水对照; 2: 羊败血性链球菌病灭活疫苗; 3: 山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗; 4: 羊败血性链球菌病灭活疫苗; 5: 山羊痘病毒; 6: 口蹄疫O型/A型二价疫苗; 7: 绵羊痘病毒; 8: 羊口疮病毒; 9: 小反刍兽疫病毒核酸; 10:蓝舌病毒核酸; 11: 羊口疮病毒和山羊痘病毒细胞混合液; 12: 羊口疮病毒和绵羊痘病毒细胞混合液; M: DNA 标准 100 bp Lader

图4 特异性试验结果

Fig.4 Specific test results

1: 水对照; 2 ～9: 提取羊口疮病毒和山羊痘病毒核酸10^-1 ～10^-8倍稀释; M: DNA 标准 100 bp Lader

图5 敏感性试验结果

Fig.5 Sensitivity test results