刘志玲 吴晓薇 梅明珠 梁佳琪 王科珂 丁宁 焦彦翔 鱼海琼

刘志玲 ¹ 吴晓薇 ^1# 梅明珠 ¹ 梁佳琪 ¹ 王科珂 ² 丁 宁 ¹ 焦彦翔 ¹ 鱼海琼 ^{1 *}

摘 要 为建立一种可同步准确、快速检测东部马脑脊髓炎病毒（Eastern Equine Encephalomyelitis Virus，EEEV）、西部马脑脊髓炎病毒（Western Equine Encephalomyelitis Virus，WEEV）和委内瑞拉马脑脊髓炎病毒（Venezuelan Equine Encephalomyelitis Virus，VEEV）的方法，本研究选择编码EEEV、WEEV的E2蛋白和VEEV的E1蛋白基因的保守序列，据此设计了特异性引物和TaqMan探针，建立了马脑脊髓炎病毒（EEEV、WEEV、VEEV）三重定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）的检测方法。为验证所建立方法的技术性能，本研究对其特异性、灵敏度及重复性开展研究，并初步应用于临床试样。结果显示，该方法特异性好，可精准检出EEEV、WEEV和VEEV，对其他马属动物相关疫病病原核酸呈阴性反应。对EEEV、WEEV和VEEV的最低检测限分别为10³ copies/μL、10² copies/μL、10² copies/μL。重复性试验的组内和组间变异系数均未超过3%。运用所建立的方法对6份模拟阳性样本、10份马全血和106份马血清实施检测，结果与世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，WOAH）推荐的定量逆转录聚合酶链反应方法检测结果吻合。本研究建立的检测方法特异性好、灵敏度较高，适用于马脑脊髓炎病毒的检出，为疫情防控提供了新的筛查方式。

关键词 马脑脊髓炎病毒；三重定量逆转录聚合酶链反应；检测方法

Establishment and Application of a Triple qRT-PCR

Assay for Simultaneous Detection of Equine Encephalomyelitis Virus

LIU Zhi-Ling¹ WU Xiao-Wei^1# MEI Ming-Zhu¹ LIANG Jia-Qi¹

WANG Ke-Ke² DING Ning¹ JIAO Yan-Xiang¹ YU Hai-Qiong^1*

Abstract To establish a method for the simultaneous, accurate and rapid detection of eastern equine encephalomyelitis virus (EEEV), western equine encephalomyelitis virus (WEEV) and venezuelan equine encephalomyelitis virus (VEEV), this study selected the conserved gene sequences encoding the E2 protein of EEEV and WEEV as well as the E1 protein of VEEV. Based on these sequences, specific primers and TaqMan probes were designed, and a triple quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) assay was developed for the detection of equine encephalomyelitis viruses (EEEV, WEEV and VEEV). To verify the technical performance of the established assay, this study evaluated its specificity, sensitivity and reproducibility, and conducted a preliminary application on clinical samples. The results indicated that this assay exhibited excellent specificity, enabling the accurate detection of EEEV, WEEV, and VEEV while yielding negative results for nucleic acids from other pathogens associated with equine diseases. The limits of detection (LOD) of this assay for EEEV, WEEV and VEEV were determined to be 10³ copies/μL, 10² copies/μL and 10² copies/μL, respectively. Both intra-assay and inter-assay coefficients of variation (CV) in repeatability tests were below 3%. The method was used to test 6 simulated positive samples, 10 equine whole blood samples, and 106 equine serum samples, with results consistent with those obtained using the qRT-PCR method recommended by the World Organisation for Animal Health (WOAH). The detection assay established in this study exhibits high specificity and relatively high sensitivity, which is suitable for the detection of equine encephalomyelitis viruses and provides a novel screening approach for epidemic prevention and control.

Keywords equine encephalomyelitis virus; triple quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR); detection methods

基金项目：海关总署科研项目（2023HK013）；广州市科学技术局重点研发计划项目（2023B04J0137）

第一作者：刘志玲（1984—），女，汉族，广东英德人，硕士，高级兽医师，主要从事进出境动物检疫工作，E-mail: zhilingyes@163.com

共同第一作者：吴晓薇（1975—），女，汉族，江苏南通人，硕士，正高级兽医师，主要从事进出境动物检疫工作，E-mail: wuxiaowei8@126.com

通信作者：鱼海琼（1972—），女，汉族，甘肃西和人，硕士，研究员，主要从事进出境动物检疫工作，E-mail: haiqiongyu@139.com

1. 广州海关技术中心 广州 510623

2. 乌鲁木齐海关技术中心 乌鲁木齐 830063

1. Guangzhou Customs Technology Center, Guangzhou 510623

2. Urumqi Customs Technology Center, Urumqi 830063

东部马脑脊髓炎病毒（Eastern Equine Encephalomyelitis Virus，EEEV）、西部马脑脊髓炎病毒（Western Equine Encephalomyelitis Virus，WEEV）、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒（Venezuelan Equine Encephalomyelitis Virus，VEEV）均属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphaviruses），是引起马、驴、骡等马属动物及人类马脑脊髓炎的病原。EEEV、WEEV和VEEV在临床中可导致易感动物出现严重神经系统疾病，且死亡率较高^[1-2]。因此，马脑脊髓炎在世界范围内引起了广泛关注，倘若发生疫病必须及时通报世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，WOAH）。马脑脊髓炎病毒在自然界中通过库蚊和蜱等虫媒传播^[1,3]，其被认为是一种强有力的潜在生物武器^[4-5]。马脑脊髓炎1983年首次被报道于美国^[2-3]，2023—2024年在乌拉圭和阿根廷等南美地区引起较大规模的疫情^[6-7]。我国存在马脑脊髓炎病毒传播媒介的蚊虫，1990—1991年曾从新疆地区的虫媒中分离出EEEV和WEEV ^[8]。，其中核酸检测方法主要有逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）^[9-10]、定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）^[11-14]、环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP） ^[15] 等。但未见有应用多重定量PCR技术对东部马脑脊髓炎病毒、西部马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒进行同步检测的报道。因此，建立以上3种马脑脊髓炎病毒的三重定量逆转录聚合酶链反应的快速检测方法显得尤为重要。

1 材料与方法

1.1 质粒和样品

携带编码东部马脑脊髓炎病毒E2蛋白、西部马脑脊髓炎病毒E2蛋白和委内瑞拉马脑脊髓炎病毒E1蛋白部分基因保守序列的片段委托生工生物工程（上海）股份有限公司定制，将目的片段分别克隆至p-BLUE载体构建重组质粒，命名为p-EEEV-E2、p-WEEV-E2和p-VEEV-E1。马属动物相关病原核酸，包括马动脉炎病毒（Equine Arteritis Virus，EAV）、马流感病毒（Equine Influenza Virus，EIV）、马疱疹病毒 1 型（Equid Herpesvirus-1，EHV-1）、马传染性贫血病毒（Equine Infectious Anemia Virus，EIAV）、日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）、马链球菌兽疫亚种（Streptococcus Equi Subsp. Zooepidemicus，SEZ）、西尼罗病毒（West Nile Virus，WNV）、10份马全血和106份马血清以及健康马血核酸均由本实验室保存。6份模拟阳性马血清（EEEV、WEEV与VEEV各2份）为分别将2 μL浓度为10⁵ copies/μL的p-EEEV-E2、p-WEEV-E2、p-VEEV-E1分别添加至100 μL马血清样本，各设置2个重复。

1.2 试剂与仪器

核酸提取试剂（Z-ME-0089-120A，上海之江生物科技股份有限公司）；定量RT-PCR试剂（RR064A，宝生物工程（大连）有限公司）；核酸提取及体系构建系统（Autra4800，上海之江生物科技股份有限公司）；荧光定量PCR仪（Quantstudio5，美国应用生物系统公司）；紫外可见光度计（ND-1000，赛默飞世尔科技(中国)有限公司）。

1.3 引物和探针的设计与合成

根据Genbank已发表的编码东部和西部马脑脊髓炎病毒的E2蛋白和委内瑞拉马脑脊髓炎病毒的E1蛋白基因的保守序列，设计特异性引物和探针，具体序列见表1。

表1 三重定量逆转录聚合酶链反应的引物与探针

Table 1 Primers and probes for triple qRT-PCR

1.4 核酸提取

采用上海之江生物科技股份有限公司的核酸提取及体系构建系统及配套的核酸提取试剂提取样品中的病毒的核酸。样品充分振荡混匀，按照试剂盒说明操作指引，每份样品分别吸取300 μL 悬液至核酸提取板的样品孔，在设备上放置配套的耗材并选择病毒核酸提取程序。待设备程序自动运行结束后，将所提取的核酸分别移至1.5 mL灭菌离心管中，并做好相应标记。

1.5 三重定量逆转录聚合酶链反应检测方法的建立

采用TAKARA Primescript onestep RT-PCR Kit试剂，在ABI Quantstudio5定量PCR上以p-EEEV-E2、p-WEEV-E2、p-VEEV-E1为模板，在3组引物探针单独优化的基础上将3组引物和探针组合后，在保障扩增效率的前提下，结合试剂成本等因素确定引物与探针浓度的最优配比组合。在此基础上进一步对退火温度（52～62℃）进行优化，最终建立东部马脑脊髓炎病毒、西部马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒的三重定量逆转录聚合酶链反应体系。

1.6 标准曲线建立

借助ND-1000紫外可见光度计完成重组质粒的浓度的测定后，再运用拷贝数计算公式：拷贝数（copies/μL）=（6.02×10²³）×（浓度ng/μL×10^-9）/（cDNA长度×660），转换为对应的基因拷贝数。对p-EEEV-E2、p-WEEV-E2、p-VEEV-E1分别进行10倍梯度稀释，采用1.4确定的反应条件对每个稀释度的质粒参照品实施三重定量逆转录聚合酶链反应扩增，以获得的临界循环数（Threshold Cycle，Ct）作为纵坐标、模板起始浓度拷贝数的对数值作为横坐标，制作标准曲线。

1.7 特异性试验

用建立的三重定量逆转录聚合酶链反应检测方法对p-EEEV-E2、p-WEEV-E2、p-VEEV-E1、7种其他马属动物疫病（EIAV、SEZ、EIV、EHV-1、EAV、JEV、WNV）病原核酸，以及健康马血的核酸进行扩增，观察扩增曲线，以验证该方法的特异性。

1.8 灵敏度试验

对p-EEEV-E2、p-WEEV-E2、p-VEEV-E1共3种重组质粒进行10倍梯度稀释后，选取浓度在10¹ copies/μL至10⁹ copies/μL 范围内的质粒作为模板同时用ddH₂O作为阴性对照，利用建立的三重定量逆转录聚合酶链反应检测方法进行扩增反应，分析扩增曲线，以评估该方法的检测灵敏度。

1.9 重复性试验

分别选取质粒拷贝数为 10⁴至10⁶ copies/μL的p-EEEV-E2、p-WEEV-E2、p-VEEV-E1 质粒作为模板，采用已建立的三重定量逆转录聚合酶链反应方法，对同一批次反应体系开展批内试验，同时对3个不同批次反应体系进行批间试验。记录各次检测的Ct值，计算标准偏差与变异系数，以此对该方法的重复性进行分析。

1.10 临床试样的初步应用

利用建立的三重定量逆转录聚合酶链反应方法对6份模拟阳性马血清（EEEV、WEEV与VEEV各2份）、10份马全血和106份马血清实施检测。同组样品采用WOAH推荐的定量RT-PCR方法^[16]检测，并对2种方法的检测结果进行对比分析，以评估该方法临床检测与WOAH推荐方法检测结果的一致性。

2 结果与分析

2.1 三重定量逆转录聚合酶链反应体系的建立与优化

采用TAKARA Primescript onestep RT-PCR Kit试剂。引物与浓度优化分别设定0.083 μmol/L（10 μM 0.25 μL）、0.167 μmol/L（20 μM 0.25 μL）、0.333 μmol/L（20 μM 0.5 μL）、0.667 μmol/L（20 μM 1 μL）4个梯度，筛选某一检测目标引物或探针浓度时其余组分体积不变，用ddH₂O补充总体积至30 μL，退火温度均设定为55℃。各浓度设2个重复计算Ct值的平均值，取数值小的为最佳浓度（图1）。在引物探针优化的基础上，退火温度优化分别设定为53℃、55℃、57℃、59℃，各退火温度设2个重复计算Ct值的平均值，取数值小的为最佳浓度。

反应条件优化后，确定的东部马脑脊髓炎病毒、西部马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒的三重定量逆转录聚合酶链反应反应体系（30 μL）为：2×一步法RT-PCR缓冲液15 μL，反转录酶1 μL，Ex Taq Hs酶1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，EEEV-P 0.5 μL，WEEV-P 0.25 μL，VEEV-P 0.5 μL，模板RNA 3 μL，补充ddH₂O至30 μL。引物与探针的浓度均为20 μmol/L。扩增反应条件为：50℃ 15 min，95℃ 5 min，（95℃ 10 s，55℃ 30 s），45个循环；在每次扩增循环55℃阶段设定动态采集FAM通道（EEEV）、ROX通道（WEEV）和CY5通道（VEEV）的荧光信号。当样品某一荧光通道出现典型的“S”型扩增曲线，且Ct值≤42时，则判定为相应检测目标阳性。

2.2 标准曲线的构建

使用 ND-1000紫外可见光度计测定3种质粒的浓度，根据拷贝数的计算公式：拷贝数（copies/μL）=（6.02×10²³）×（浓度ng/μL×10^-9）/（cDNA长度×660），计算得出p-EEEV-E2的拷贝数为1.21×10¹⁰ copies/μL，p-WEEV-E2的拷贝数为2.06×10¹⁰ copies/μL，p-VEEV-E1的拷贝数为1.74×10¹⁰ copies/μL。

对10倍梯度稀释的质粒分别实施三重定量逆转录聚合酶链反应扩增。以扩增反应的Ct值作为纵坐标，对应阳性质粒的拷贝数的对数值作为横坐标，制作标准曲线。线性回归方程拟合结果显示，EEEV在1.21×10³～1.21×10⁹ copies/μL的梯度浓度范围内，变量间的线性相关程度较高，标准曲线方程为y = -3.322x＋42.213，相关系数（R²）为0.993。WEEV在2.06×10²～2.06×10⁹ copies/μL的梯度浓度范围内，变量间的线性相关程度较高，标准曲线方程为y = -3.436x＋41.819，R² = 1。VEEV在1.74×10²～1.74×10⁹ copies/μL的梯度浓度范围内，变量间的线性相关程度较高，标准曲线方程为y = -3.474x＋45.269，R²为0.999，如图2所示。

2.3 三重定量逆转录聚合酶链反应方法特异性试验

以p-EEEV-E2、p-WEEV-E2、p-VEEV-E1、EIAV、SEZ、EIV、EHV-1、EAV、JEV、WNV和健康马血的核酸为模板，采用建立的三重定量逆转录聚合酶链反应方法进行扩增，仅有p-EEEV-E2、p-WEEV-E2、p-VEEV-E1质粒产生相应目标的阳性反应，即分别检测到FAM荧光信号、ROX荧光信号、CY5荧光信号。其余样品3个荧光通道均未检测到扩增信号（图3）。上述结果证实该方法特异性较好。

2.4 三重定量逆转录聚合酶链反应方法灵敏度试验

选取浓度为10¹～10⁹ copies/μL的质粒作为模板，运用建立的三重定量逆转录聚合酶链反应检测方法实施2次重复试验扩增，结果显示，所建方法2次重复试验对EEEV、WEEV、VEEV的最低检测限分别达10³ copies/μL、10² copies/μL、10² copies/μL，灵敏度试验结果如图4至图6所示。

2.5 三重定量逆转录聚合酶链反应方法重复性试验

运用所建立的方法开展重复性试验。经验证，三重定量逆转录聚合酶链反应方法重复性较为稳定。目标片段的扩增组内变异系数介于0.10%～1.26%之间，组间变异系数介于0.27%～2.56%之间；组内与组间的变异系数均低于3%（表 2）。

2.6 临床试样的初步应用

对实验室制备的模拟阳性样品与收集的临床样品应用建立的三重定量逆转录聚合酶链反应方法实施检测，并与WOAH推荐的定量逆转录聚合酶链反应方法检测结果进行比对。结果表明，利用本研究建立的三重定量逆转录聚合酶链反应方法和WOAH推荐的方法对10份马全血和106份马血清进行检测，结果均为阴性（部分马血清样品三重定量RT-PCR扩增图如图7所示）。对6份模拟阳性马血清（EEEV、WEEV与VEEV各2份）的检测相应目标均出现阳性扩增反应。本研究建立的三重定量逆转录聚合酶链反应方法与WOAH推荐方法的检测结果符合率为100%。

3 讨论

随着跨境动物贸易与世界马术赛事的举行，马属动物的进出境流动更加频繁，因此对进出境动物疫病检疫防控也提出了更高的要求。因此建立并应用精准、高效的检测技术，加强进境马匹与隔离场环境媒介生物的马脑脊髓炎病毒筛查，及时消除传播隐患，是开展动物疫情监测、加强对动物疫病管理的重要手段。

定量聚合酶链反应技术具备高效、精准、稳定及高通量等优点，近年来在动物病原体检测领域中得到广泛应用^[17-19]。多重定量聚合酶链反应可在同一反应体系中实现对不同靶基因的同步检测，因而展现出广阔的应用潜力。国内外研究人员建立了单一或多重检测EEEV、WEEV或VEEV核酸的方法^[20-24]，但目前未见可同时检测并区分EEEV、WEEV和VEEV的TaqMan多重定量RT-PCR检测方法的报道。因此，本研究以EEEV、WEEV和VEEV的保守基因E2、E2、E1为检测靶基因序列，在探针设计中，EEEV-P、WEEV-P和VEEV-P的5'端分别标记FAM、ROX和CY5荧光基团，这保证了荧光定量PCR仪能够在反应过程中同时监测不同检测目标的扩增信号。通过对温度和引物探针浓度等反应条件的筛选，最终建立了同步检测EEEV、WEEV和VEEV的三重定量逆转录聚合酶链反应方法。实验结果表明，该方法具有良好的特异性，不与EIAV、SEZ、EIV、EHV-1、EAV、JEV、WNV以及健康马血的核酸发生交叉反应，具有较好的灵敏度与重复性。对临床试样的检测结果与WOAH推荐方法的检测结果一致。三重定量逆转录聚合酶链反应可在单一次反应中同时鉴别并获得3种亚型马脑脊髓炎病毒（EEEV、WEEV与VEEV）的检测结果，可有效降低检测成本，同时极大地提高了检测效率，适用于马属动物和媒介生物的马脑脊髓炎疫病的监测与筛查，为强化我国口岸检疫工作提供了有力的技术支撑。

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A: EEEV; B: WEEV; C:VEEV

图1 引物优化试验扩增图

Fig.1 Amplification plot of primer optimization test

A: EEEV; B: WEEV; C:VEEV

图2 三重定量逆转录聚合酶链反应标准曲线

Fig.2 Standard curve of triple qRT-PCR

A: EEEV; B: WEEV; C: VEEV

图3 三重定量逆转录聚合酶链反应方法特异性试验

Fig.3 Specificity test of triple qRT-PCR

图4 EEEV的灵敏度试验

Fig.4 Sensitivity test of EEEV

图5 WEEV的灵敏度试验

Fig.5 Sensitivity test of WEEV

图6 VEEV的灵敏度试验

Fig.6 Sensitivity test of VEEV

图7 部分马血清样品的三重定量逆转录聚合酶链

反应扩增图

Fig.7 Triple qRT-PCR amplification plot of partial

equine serum sample

表2 重复性试验结果

Table 2 Results of repeatability test

第7卷 第12期