张春曦 田绿波 徐蕾蕊 孟菁 张琴 陈萍 但小苹 胡江涛

张春曦 ^1,2 田绿波 ^1,2 徐蕾蕊 ³ 孟 菁 ^1,2 张 琴 ^1,2 陈 萍 ^1,2 但小苹 ^{1 ,2} 胡江涛 ^1,2*

摘 要 潜伏性结核感染（Latent Tuberculosis Infection，LTBI）作为一种亚临床结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染，是造成结核病（Tuberculosis，TB）流行的重要传染源，其精准检测对TB防控至关重要。传统检测结核菌素皮肤试验（Tuberculin Skin Test，TST）因特异性低，在卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）覆盖接种地区应用受限；γ-干扰素释放试验（Interferon-γ Release Assay，IGRA）虽特异性有所提升，但对免疫功能低下人群敏感性不足且成本较高；两者均无法区分感染状态。分子生物学技术中的核酸扩增技术（Nucleic Acid Amplification Techniques ，NAATs）能快速精准检出MTB核酸，新兴技术如基于宿主生物标志物的检测通过分析宿主免疫反应相关分子也为检测提供了新思路，影像学技术的功能成像也为诊断LTBI提供了支撑。本文系统综述了LTBI检测技术的发展脉络，探讨创新应用面临挑战与发展前景，助力制定更优检测策略，提升结核病防控水平。

关键词 潜伏；结核；分枝杆菌；检测技术

Development and Innovative Application of Detection Techniques for Latent Tuberculosis

ZHANG Chun-Xi^1,2 TIAN Lv-Bo^1,2 XU Lei-Rui³ MENG Jing^1,2

ZHANG Qin^1,2 CHEN Ping^1,2 DAN Xiao-Ping^1,2 HU Jiang-Tao^1,2*

Abstract Latent tuberculosis infection (LTBI), as a subclinical Mycobacterium tuberculosis (MTB) infection, is an important source of infection that contributes to the tuberculosis (TB) epidemic, making its accurate detection essential for TB prevention and control. Traditional detection such as tuberculin skin test (TST) has limited applicability in Bacille Calmette-Guérin (BCG) vaccination coverage area because of its low specificity caused by immuno-cross reaction. Although the specificity of interferon-γ release test (IGRA) has been improved, it is less sensitive for people with low immune function along with high cost. Besides, neither of the above methods can distinguish the state of infection. The nucleic acid amplification techniques (NAATs) in molecular biology technique can detect MTB nucleic acid with acceleration and accurateness. Emerging techniques, e.g. detection based on host biomarkers, also has provided innovative directions for exploration of detection by analyzing the molecules related to host immune response, and functional imaging techniques also provide support for the diagnosis of LTBI. This review summarizes the development of LTBI detection techniques systematically, discusses the challenges and prospects of innovative application, and aims to equip healthcare professionals with sharper detection strategies for the battle against this ancient foe.

Keywords latent; tuberculosis; mycobacterium; detection technique

本论文由1+X合作单位资助

基金项目：海关总署科研项目（2024HK034）

第一作者：张春曦（1987—），女，汉族，四川成都人，硕士，主管技师，主要从事卫生检疫工作，E-mail: orchil@163.com

通信作者：胡江涛（1974—），男，汉族，四川成都人，硕士，研究员，主要从事检验检测工作，E-mail: hjt9171@163.com

1. 四川国际旅行卫生保健中心（成都海关口岸门诊部） 成都 610042

2. 口岸疫病疫情监测四川省重点实验室 成都 610042

3. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

1. Sichuan International Travel Health Care Center (Outpatient Department of Chengdu Customs Port), Chengdu 610042

2. Port Epidemic Disease Monitoring, Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu 610042

3. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

结核病（Tuberculosis，TB）作为传播历史最久、范围最广的传染病之一，由胞内寄生菌结核分枝杆菌（Mycobacteria Tuberculosis，MTB）感染引起。感染状态可分为潜伏性和活动性，潜伏性结核感染（Latent Tuberculosis Infection，LTBI）指免疫系统可抑制细菌增殖，表现为无明显临床症状，胸部影像学检查亦无活动性结核病灶，但体内存在持续的免疫反应。LTBI是结核病的重要“储藏库”，目前全球感染MTB人口约占1/4，2019—2023年每年至少125万人死于TB^[1]。2015—2023年，相关数据显示，我国是全球30个TB高负担国家之一，活动性病例年发病数达到78万例，排名全球第三^[1-2]。同时我国也是LTBI负担最重的国家之一，感染MTB的人数近3.5亿^[1]。

LTBI个体进展衍变为活动性TB的累积风险为5%～10%，在初次感染2年内尤易发病，人获得性免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染及其他免疫抑制、密切接触等高危人群2年内发病率可升至19%^[3-4]。若能精确筛查LTBI人群并给予预防性治疗，可有效降低TB发病率，对全球TB疫情防控、实现世界卫生组织（WHO）“终结结核病流行”的目标至关重要。本文聚焦LTBI检测技术发展，梳理传统与新兴技术，并对创新应用的优势和面临的挑战进行综合分析。

1 结核菌素皮肤试验

结核菌素皮肤试验又称芒图试验（Mantoux Test），将结核菌素纯蛋白衍化物（Purified Protein Derivative Tuberculin，PPD）注入前臂皮内之后，若受试者曾感染MTB，基于迟发型超敏反应原理，致敏T淋巴细胞会识别PPD中的抗原，在注射部位聚集、活化、释放细胞因子，引发以单核细胞系统性聚集为特征的炎性浸润^[5]。48～72 h后观察注射部位硬结大小，一般以硬结直径≥5 mm为阳性，提示既往感染MTB。然而，其阳性结果无法区分LTBI、既往卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）接种和非MTB分枝杆菌感染导致的假阳性^[6]。

结核菌素皮肤试验（Tuberculin Skin Test，TST）是最早用于检测MTB感染的方法，因操作简便、成本低而在全球得到广泛应用，尤其在资源有限地区仍是现今的重要筛查手段。然而，TST存在诸多局限性，尤其是特异性较差，BCG接种和非MTB分枝杆菌感染会导致假阳性，在BCG广泛接种地区TST阳性预测值较低。例如，在一些BCG接种率高的亚洲国家，TST阳性人群中仅10%～20%为真正的LTBI^[7]。此外，TST检测结果受多种因素影响，如受试者免疫状态（免疫功能低下者可能出现假阴性）、PPD质量和注射技术等，而且TST无法区分LTBI和活动性TB，无法判断感染、发病阶段^[8]。

2 基于γ-干扰素释放试验的检测技术

2.1 酶联免疫斑点法

酶联免疫斑点法（Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISpot）是采集受试者外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）加入MTB毒力因子如早期分泌性抗原6（6-kDa Early Secreted Antigenic Target，ESAT-6）、分泌蛋白10（10-kDa Culture Filtrate Protein，CFP-10）共同孵育。基于细胞免疫反应原理，针对这些抗原的致敏T淋巴细胞会分泌γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ），其与包被在微孔板上的抗IFN-γ抗体结合后再与加入酶标记的二抗结合，在显微镜下计数显色的分泌IFN-γ的细胞斑点数，以此反映机体对MTB抗原的细胞免疫应答强度，并判断感染情况^[9]。

相比TST，ELISpot特异性显著提高，不仅不受BCG接种影响，对非MTB分枝杆菌交叉反应也较低。研究表明在BCG接种人群，ELISpot针对LTBI的特异性逾95%^[10-11]；在临床应用中，ELISpot对HIV合并MTB感染的诊断价值突出，能有效检出这类免疫功能受损人群的LTBI，避免TST假阴性结果^[12]。在LTBI高风险人群如与TB患者密切接触和免疫抑制者的筛查中，ELISpot可精准识别LTBI并为预防发病提供依据。

2.2 全血干扰素测定法

全血干扰素测定法（如QuantiFERON-TB Gold In-Tube，QFT-GIT）同样基于免疫细胞对MTB抗原的细胞反应。采集受试者全血加入MTB特异性抗原（ESAT-6、CFP-10和TB 7.7），于37℃孵育16～24 h。因致敏T细胞识别抗原后会分泌IFN-γ，故可通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测全血血浆中IFN-γ的含量以判断结果^[13-14]。该方法操作相对简便，无需分离PBMCs，样本处理步骤较少，降低了污染风险。其敏感性（约70%～90%）和特异性（约95%）与ELISpot相当^[14]，已广泛应用于医院和学校、监狱等集体场所的大规模筛查。

3 分子生物学检测技术

3.1 核酸扩增技术

核酸扩增技术（Nucleic Acid Amplification Techniques，NAATs）通过扩增MTB特异性核酸片段实现病原体的快速检测。常见的有聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）及其衍生技术，如实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）等。以实时荧光定量PCR为例，针对MTB的靶标基因（如IS6110、16S rRNA、gyrB和rpoB基因等）设计特异性引物和荧光探针。PCR扩增时Taq酶延伸引物会切割荧光探针释放荧光信号，通过实时监测荧光强度实现对MTB核酸的定量检测。LAMP技术则利用6～8条特异性引物，由Bst DNA聚合酶在恒温条件（60～65℃）下催化扩增核酸，扩增模板极限仅为几个拷贝，在 45～60 min 的时间内扩增效率可达到10⁹～10¹⁰个数量级，反应产物直接可视化判读，白色沉淀或特定荧光为阳性反应^[15-16]。

在LTBI检测中，NAATs具有耗时短和敏感性高的优势。传统MTB培养需数周才能出结果，而NAATs数小时内即可完成，且低载量MTB核酸亦能检出。已有研究对LTBI的痰液等样本进行检测，发现实时荧光定量PCR能检测到每毫升样本中低至10～100拷贝的MTB核酸^[15-17]。其中，LAMP技术因操作简便、对仪器要求低，已在资源有限地区和基层医疗机构推广^[16-19]。此外，NAATs还可用于检测耐药基因（如rpoB、katG和inhA基因），对制定精准防控策略具有重要意义^[16-19]。

3.2 新一代测序技术

新一代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）可对样本中所有生物的DNA或RNA开展高通量测序，无需预先知晓目标序列。在MTB检测中，先将样本预处理，提取核酸后将其打断成短片段并构建文库，通过桥式PCR在测序仪上边合成边测序。随后，对海量测序数据结合生物信息学进行分析，将测序序列与MTB参考基因组比对，识别MTB核酸序列并分析其基因特征，包括耐药基因及其突变、菌株分型等信息。

在LTBI检测方面，NGS有望发现传统方法难以检测的微量MTB感染。通过对宿主样本（如血液、痰液、组织等）中游离核酸测序，可全面分析宿主与病原体相互作用相关信息。已有研究对潜伏感染者血液游离DNA测序，不仅检测到MTB核酸，还结合生物信息学分析宿主免疫相关基因表达变化^[20-21]。然而，NGS技术用于LTBI检测面临成本高、数据分析复杂、检测灵敏度受样本中MTB核酸含量影响等挑战，目前主要用于科研及疑难病例诊断，未来随着科学技术发展、成本降低，有望在临床广泛应用。

4 基于宿主生物标志物的检测技术

4.1 免疫相关生物标志物检测

MTB感染后机体会相应产生级联免疫反应，释放多种免疫相关生物标志物。检测这些生物标志物可辅助诊断LTBI。例如，机体感染MTB后，B淋巴细胞可产生针对MTB抗原的抗体，通过ELISA等方法检测血清中MTB特异性抗体水平可判断是否感染。此外，细胞因子如肿瘤坏死因子-α（Tumour Necrosis Factor-α，TNF-α）、白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、白细胞介素-12（Interleukin-12，IL-12）等在MTB感染后的免疫调节中起重要作用，检测外周血中相关细胞因子水平变化，也可反映机体对感染的免疫应答情况。

近年来，免疫诊断领域在生物标志物检测方面取得一系列创新成果。比如，联合检测多种细胞因子（TNF-α、IL-2、IL-10、IL-12等）可提高LTBI诊断准确性（敏感性达79%～100%、特异性达74%～100%）^[22]。检测血清中MTB特异性IgG、IgA抗体，在LTBI诊断中尤其对痰涂片阴性TB患者有一定价值^[23]。未来，随着对MTB感染免疫机制研究深入，有望筛选出更具特异性、高敏感的免疫生物标志物，开发出高效的LTBI诊断试剂盒用于大规模筛查和临床诊断。

4.2 代谢组学、蛋白质组学技术

代谢组学通过系统分析体液（包括外周血、尿液等）中代谢物谱的动态变化，筛选与疾病发生发展密切相关的特征性代谢标志物。在MTB感染中，宿主代谢途径会发生改变，导致代谢物水平变化。采用气相色谱—质谱技术、液相色谱—质谱技术对样本中的代谢物进行系统分离与定量分析。研究发现，与健康人群相比，LTBI人群血液中一些代谢物（如某些氨基酸、脂肪酸、糖类等）水平存在差异^[24]。

蛋白质组学研究细胞、组织或生物体内全部蛋白质表达谱及功能，通过2-DE、MS等技术分析MTB感染前后宿主蛋白质表达差异，筛选潜在生物标志物。已有研究发现LTBI患者血清蛋白质组存在显著异常表达谱，包括纤维蛋白原（Fibrinogen）、载脂蛋白A1（Apolipoprotein A1）等关键蛋白的表达水平发生特异性改变^[25]。

目前，代谢组学和蛋白质组学技术在LTBI筛查中尚处于探索阶段，还需大规模临床验证。若成功应用，将为LTBI检测提供全新、无创的检测手段，有助于早期发现潜在感染者。

5 影像学检测技术在LTBI检查中的创新应用

5.1 功能成像技术

5.1.1 正电子发射断层扫描（PET）/计算机断层扫描（CT）技术原理及应用

正电子发射断层扫描（Positron Emission Computed Tomography，PET）利用放射性核素标记的示踪剂，如18F-FDG，这种示踪剂在MTB感染后因局部组织代谢活跃、摄取增加，通过PET成像可显示代谢增高区域计算机断层扫描（Computed Tomography，CT）提供亚毫米级空间分辨率的精细解剖结构图像，其高对比度分辨率（通常可达0.5%密度差异识别）可清晰显示肺部微小病灶的形态学特征；两者融合图像可更精准定位和定性病变。在LTBI诊断中，PET/CT通过整合功能代谢信息（18F-FDG摄取）与高分辨率解剖图像（空间分辨率达0.5 mm），显著提高了亚临床病例的检出率^[26]。在一项针对HIV合并LTBI患者的研究中，PET/CT检测出部分患者隐匿性肺外结核（Extra Pulmonary Tuberculosis，EPTB）病灶，表明这一技术有助于早诊断、早干预，从而防止患者进展为活动性TB^[27]。

5.1.2 磁共振成像功能成像技术进展

磁共振成像功能成像技术如弥散加权成像、磁共振波谱成像等，在LTBI检测中也有应用潜力。在MTB感染早期，病灶局部组织水分子扩散受限，DWI通过检测水分子扩散运动观测组织微观结构变化，图像上病灶表现为高信号^[28]。MRS可定量分析病灶区域的代谢物浓度变化，如检测N-乙酰基门冬氨（NAA）、胆碱（Cho）、肌酸（Cr）等特征性代谢物的化学位移峰值及相对比值（如NAA/Cr、Cho/Cr）以判断感染情况^[29]。

目前，这些技术在LTBI检测中的研究多处于初期阶段，但有望为早期发现LTBI提供新影像学方法。

6 结语与展望

LTBI检测技术从传统TST发展到如今多种技术并存，各技术在原理、应用及性能上各有特点。TST作为经典方法，虽有局限但仍能在部分场景发挥作用；IGRA的特异性相应升高，已成为主流检测手段之一；分子生物学技术以其快速、精准的优势已在LTBI检测中得到广泛应用；基于宿主生物标志物检测技术和影像学功能成像技术也已为检测提供了新思路。

对于LTBI检测技术未来的发展方向，本文作者认为：一是可深入研究MTB与宿主相互作用机制，挖掘新的特异性生物标志物，结合微流控芯片、纳米技术等开发快速、便携、高通量检测设备和更精准、简便、低成本的检测方法。二是加强多技术联合应用研究，整合不同检测技术优势建立综合诊断模型，提高诊断准确性。例如，将分子生物学、免疫检测和影像学技术有机结合，通过大数据分析和人工智能决策模型对检测结果进行综合分析，为临床诊断提供更可靠依据。三是针对特殊人群（如免疫功能低下者、儿童等）研发更适用的检测技术。例如，开发适合儿童的无创、高敏检测方法，提高儿童LTBI诊断率。通过技术创新、多技术融合及针对特殊人群的研发，有望突破现有瓶颈开发出更优检测技术，实现对LTBI的高效筛查和精准诊断。

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