王娟 戴福利 雷春妮 张宇霞 李定儒 赵淑娟 齐鹤鸣 王波

王 娟 ¹ 戴福利 ¹ 雷春妮 ¹ 张宇霞 ¹ 李定儒 ¹ 赵淑娟 ¹ 齐鹤鸣 ² 王 波 ^{1 *}

摘 要 本研究开发了一种基于液液萃取（Liquid-Liquid Extraction，LLE）前处理，结合超高效液相色谱—串联质谱（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）技术，用于快速同步测定牛奶中51种抗过敏类药物残留的一体化分析方法。样品用20 mL 0.1%甲酸溶液和甲醇+乙腈（5+5）（1∶1，v/v），15 min超声萃取，静置30 min，加入沉淀剂0.2 mL乙酸锌（10%）—亚铁氰化钾（20%）混合液，离心过膜后，用Kinetex F5色谱柱分离，试样中待测物在0.05 ～ 20 μg/L范围内线性关系良好，R²＞0.9900，方法检出限0.01 ～ 0.05 μg/kg，定量限0.05 ～ 1.0 μg/kg，方法在低、中、高3个浓度水平的添加回收率为68.8% ～ 104.5%，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）＜10%。该方法快速、灵敏度高、准确性好，实现了牛奶样品中51种抗过敏类药物多残留的高通量、快速同步筛查。

关键词 液液萃取（LLE）；抗过敏；糖皮质激素；牛奶；超高效液相色谱—串联质谱法（UPLC-MS/MS）

Research on Synchronous Screening Method for Multiple Residues of 51 Anti-Allergic Drugs in Milk Based on LLE-UPLC-MS/MS

WANG Juan¹ DAI Fu-Li¹ LEI Chun-Ni¹ ZHANG Yu-Xia¹

LI Ding-Ru¹ ZHAO Shu-Juan¹ QI He-Ming² WANG Bo^1*

Abstract This study developed an integrated analytical method based on liquid-liquid extraction (LLE) pretreatment combined with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) for the rapid and simultaneous determination of 51 anti-allergic drug residues in milk. The samples were ultrasonically extracted for 15 minutes using 20 mL of a mixture consisting of 0.1% formic acid solution and methanol + acetonitrile (5+5) (1:1, v/v), followed by standing for 30 minutes. A precipitating agent of 0.2 mL zinc acetate (10%)-potassium ferrocyanide (20%) mixture was added, and after centrifugation and filtration, the analytes were separated using a Kinetex F5 chromatographic column. The analyte in the samples had a good linear relationship within the range of 0.05-20 μg/L, with R²＞0.9900. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were 0.01-0.05 μg/kg and 0.05-1.0 μg/kg, respectively. The recoveries at low, medium, and high spiked concentration levels ranged from 68.8% to 104.5%, with relative standard deviations (RSD) below 10%. The method is rapid, highly sensitive, and accurate, enabling high-throughput and rapid simultaneous screening of multi-residues of 51 anti-allergic drugs in milk samples.

Keywords liquid-liquid extraction (LLE); anti-allergic; glucocorticoid; milk; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)

本论文由油橄榄产品功能性分析及品质鉴定1+X研究室资助

基金项目：海关总署科研项目（2024HK019）

第一作者：王娟（1990—），女，汉族，甘肃定西人，本科，兽医师，主要从事动物检疫及微生物检验工作，E-mail: wangjuan_0603@163.com

通信作者：王波（1982—），男，汉族，甘肃陇南人，博士，正高级工程师，主要从事色谱分析工作，E-mail: wyy080214@163.com

1. 兰州海关技术中心 兰州 730010

2. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

1. Lanzhou Customs Technology Center, Lanzhou 730010

2. Science and Technology Research Center Of China Customs, Beijing 100026

牛奶蛋白过敏（Cow’s Milk Protein Allergy，CMPA）是婴幼儿阶段最为普遍的食物过敏问题，在3岁以内的儿童中尤为常见^[1]。牛奶及乳制品在全球范围内被广泛消费，是婴幼儿成长、儿童营养强化及特定人群健康保障的关键膳食组成部分。据流行病学研究报道，不同地域的CMPA发病率存在较大差异，总体在0.54%～4.91%之间^[2]。近年来，我国一项大规模调查研究显示，中国婴幼儿CMPA的患病率为2.69%^[3]，处于国际报告中较高水平。

糖皮质激素（Glucocorticoids，GCs）属于甾体激素类物质，主要由肾上腺皮质分泌（常见包括氢化可的松、地塞米松等），在临床治疗中常作为抗炎、免疫抑制剂及抗休克药物使用^[4]。由于其能够促进动物生长发育并在养殖中带来经济效益，该类激素在畜牧业中存在违规使用现象，进而可能导致牛奶及其他动物源性产品中出现药物残留。尽管部分GCs（如氢化可的松）是内源性激素，但人工合成的外源性GCs（如地塞米松、倍他米松等）在乳制品中的残留属于非法添加，可能通过食物链进入人体。欧盟规定牛奶中地塞米松残留限量为0.3 μg/kg，泼尼松龙为6.0 μg/kg。因此，建立高效、灵敏、可靠且高通量的分析方法对牛奶中多种糖皮质激素及新型抗过敏药物残留进行有效监测至关重要，可为乳制品安全的全面保障提供重要技术支撑。

《动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测 液相色谱—串联质谱法》（农业部1031号公告-2-2008）^[5]仅规定了8种常见糖皮质激素的检测目标。此外，现有筛查技术在种类覆盖全面性、前处理简便性及方法推广性等方面仍有优化空间^[6-11]；同时，如比拉斯汀等部分抗过敏药物的使用及残留风险关注相对不足，新型抗过敏药物的检测研究较少，潜在安全隐患的监测及评估有待加强。鉴于此，本研究通过优化前处理与检测方法，建立目标覆盖范围更广的高通量多残留检测方法，即通过改进的液液萃取前处理策略（简化步骤并提升回收率），结合高灵敏度液相色谱—串联质谱（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）技术，构建可同时检测和定量分析牛奶中51种抗过敏药物的筛查体系，在此基础上，对牛奶中该类药物的残留现状进行评估，以期从技术方法完善与风险评估两方面，为牛奶的安全监管体系优化提供科学参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Triple Quad 5500+QTRAP（5500+，美国AB Sciex公司），配有ESI离子源；离心机（Z327K，德国HERMLE公司）；涡旋仪（MS1 Minishake，德国IKA公司）；分析天平（CPA224S，德国Sartorius公司）；超声仪（JP-040S，深圳洁盟公司）。

色谱纯甲醇、乙腈、异丙醇和甲酸均购自德国默克公司（Merck，Germany）；超纯水（广州屈臣氏公司）；标准目标物信息见表1。

1.2 试验样品来源

样品来源：（1）超市采购60批：全脂牛奶10批/脱脂牛奶10批/巴氏杀菌奶10批/UHT灭菌奶10批/有机牛奶10批/原料奶10批；（2）小型奶牛场现挤鲜牛奶10批，样品共计70批。

1.3 系列浓度工作溶液的配制

标准中间液的制备过程如下：取以上标准溶液，用甲醇作为溶剂进行稀释制备成100 μg/L的51种混标标准工作液。

标准工作液的配制：取以上标准中间液制备成40 μg/L混标标准工作液，溶剂为50%甲醇水，分别制备成0.05 μg/L、0.1 μg/L、0.2 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L混标标准工作液。

1.4 试样的处理

称取试样10.0 g（精确至0.1 g），加入20 mL 0.1%甲酸溶液和甲醇+乙腈（1∶1，v/v），涡旋10 min后，超声萃取15 min，静置30 min，加入沉淀剂0.2 mL乙酸锌（10%）—亚铁氰化钾（20%）混合液，充分混合1 min后，以10000 r离心10 min，过0.22 μm有机滤膜，上机液质联用仪测定。取相同基质的阴性样品按照上述处理步骤操作后，得到空白基质溶液。

1.5 仪器方法

1.5.1 色谱条件

色谱柱：Kinetex F5（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）；柱温：40℃；进样量：5 µL；流速：0.4 mL·min^-1；流动相A：0.1%甲酸水溶液，B相：乙腈+甲醇（5+5）；梯度洗脱程序：0～8 min，A为70%降低到5%；8～9.5 min，A相保持5%；9.5～9.6 min，A相从5%回到70%；9.6～11 min A相保持70%不变。

1.5.2 质谱条件

离子源：ESI源（包含ESI+和ESI-）；雾化气（Gas 1）：50 psi；辅助气（Gas 2）：50 psi；气帘气（CUR）：35 psi；碰撞气（CAD）：9；IS电压：5500 V；离子源温度：500℃；检测方式：动态多反应监测（Scheduled MRM）模式采集数据。

2 结果与分析

2.1 提取步骤优化

2.1.1 提取试剂选择

考察甲醇、乙腈、50%乙腈水、异丙醇、流动相（0.1%甲酸水：甲醇乙腈混合液= 5∶5，v/v）5种不同提取试剂对目标化合物回收率的影响，结果发现乙腈极性较强，该试剂对牛奶基质具有更强的溶解能力，并能有效抑制乳化，因此尤其适用于提取强极性化合物，如带有羟基、酮基等官能团的糖皮质激素^[12]。当提取试剂中加入水溶液时，因溶剂体系的极性增加，使得极性化合物的溶解能力增强，而加入0.1%甲酸后溶液pH降低，由于酸性环境增强了目标分析物的质子化程度，因此其向有机相的分配得以更有效地进行，萃取回收率显著提升，试验发现51种目标化合物的回收率为79.6%～102.5%，因此最终提取试剂选用流动相（0.1%甲酸水∶甲醇乙腈混合液）试剂。

2.1.2 提取时间选择

本研究系统考察了超声时间对提取效率的影响，分别评估了在5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min的不同超声萃取时间下进行目标化合物筛查的最优提取条件，发现当超声时间为15 min时，目标化合物的回收率最高达到73.5%～96.4%。分析其中原因为牛奶基质成分复杂，延长超声时间在提高目标物萃取效率的同时，也会加剧基质中干扰成分的溶出。此外，过强的机械作用可能导致某些目标化合物发生降解，例如糖苷键水解、侧链断裂等结构破坏，致其化学形态改变或转化为其他物质，从而影响后续分析的准确性，其回收率随超声时间延长反而下降，这正是上述降解作用所致。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

本研究选用Synergi^TM Fusion-RP 80 A（50 mm×2 mm，4 μm）、Kinetex F5（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）、Venusil MP C₁₈（2.1 mm×100 mm，3 µm） 3种不同规格的色谱柱进行51种目标化合物分离度和峰形的考察，发现选用Kinetex F5（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）时，51种化合物能快速出峰且峰型较好，并能实现较好的分离，化合物灵敏度高，全部出峰仅需10 min，如图1所示。

图1 51种抗过敏药物在Kinetex F5色谱柱上的分离色谱图

Fig.1 Separation chromatograms of 51 anti-allergic drugs on the Kinetex F5 chromatographic column

2.2.2 流动相条件的优化

流动相的组成直接影响目标化合物的保留行为、峰形、灵敏度及色谱柱寿命。通过考察5种流动相条件（A—E），可系统性优化分离效果，本研究选用不同条件流动相：条件A：水、甲醇，条件B：0.1%甲酸水、甲醇，条件C：水、乙腈，条件D：0.1%甲酸水、乙腈，条件E：0.1%甲酸水、甲醇+乙腈（50+50）5种不同的流动相条件进行目标化合物峰型和灵敏度的考察，发现选用条件E时，目标化合物峰型尖锐，且无拖尾和展宽，质谱灵敏度高，仅需10 min就能实现51种目标化合物的出峰，且峰型较为理想。

2.3 关键质谱条件的优化

40 μg·L^-1的标准溶液在ESI+模式下，确定51种目标化合物的质谱参数，具体见表2。

2.4 方法验证

2.4.1 线性范围、检出限与定量限的验证

以基质混合标准工作液浓度（μg/L）为横坐标，不同浓度进样后仪器峰面积响应值为纵坐标进行标准曲线的绘制，发现51种目标化合物在0.05～20 μg/L范围内线性关系良好，R²＞0.9900，检出限：3倍的信噪比（S/N = 3），范围为0.01～0.2 μg/kg；定量限：10倍的信噪比（S/N = 10），范围为0.05～1.0 μg/kg，具体见表3。

2.4.2 方法精密度与回收率（准确度）的验证

考察本方法的日内、日间精密度，通过在相同基质试样中添加低（0.1 μg/kg）、中（0.2 μg/kg）、高（1.0μg/kg）3个不同浓度水平的化合物混标标准溶液，计算得到回收率在68.8%～104.5%之间，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为1.6%～9.9%。

2.4.3 基质效应的评估

本研究采用空白基质匹配标准曲线法对51种目标化合物在牛奶基质中的基质效应按照公式ME = ×100%进行系统考察。式中，K₁为基质标准曲线的斜率，K₂为溶剂标准曲线的斜率。ME＜0时，为基质抑制效应，即基质成分抑制目标物的离子化效率；ME＞0时，为基质增强效应，表明基质成分对离子化过程有促进作用^[13]。结果显示，比拉斯汀ME = -55.92%，存在较强的基质抑制效应，地塞米松及其酯类物质、倍他米松及其酯类物质、氟氢缩松及其他多数目标分析物均呈现不同程度的基质抑制效应。因此，本研究选用以基质标准曲线定量样品中目标化合物，以消除基质效应的干扰。

3 实际样品的检测

通过对抽检的70批新鲜牛奶样品进行检测，发现氢化可的松检出率为100%，可的松检出率为60%，均为合格。主要原因为：氢化可的松是一种内源性糖皮质激素，由肾上腺皮质分泌，广泛参与机体应激反应、免疫抑制及糖代谢等关键生理过程的调控。可的松作为氢化可的松的无活性前体，需在11β-羟基类固醇脱氢酶（11β-HSD）的催化下还原为氢化可的松方可发挥生物学效应。符合GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》中以上两种激素均无需制定最大残留限量（Maximum Residue Limit，MRL）^[14]的要求。

4 结论

本研究建立了一种快速检测牛奶中51种抗过敏类药物残留的检测方法，通过液液萃取方式，有效减少固相萃取柱等高成本耗材的使用，51种待测物在0.05～20.0 μg/L范围内线性关系良好，R²≥0.9900，添加回收率为68.8%～104.5%，RSD为1.6%～9.6%，满足分析要求。本方法前处理步骤少、操作简便、耗材费用低，可为实验室提供一个经济、快速的药物筛查技术。

参考文献

[1]贺小宝, 杜春艳, 林燕, 等. 钙卫蛋白对儿童非IgE介导的牛奶蛋白过敏的诊断价值[J]. 中国妇幼健康研究, 2025, 36(7): 1-6.

[2] Dinleyici M, Harmanci K, Arslantas D, et, al. A web-based questionnaire to evaluate risk factors to develop cow milk allergy[J]. European Journal of Pediatrics, 2025, 184(4): 250.

[3] Yang M, Tan M, Wu J, et al. Prevalence, characteristics, and outcome of cow’s milk protein allergy in Chinese infants:a population-based survey[J]. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, 2019, 43(6): 803-808.

[4]吴肖肖, 蒋迪尧, 梅秀明, 等. 纳米纤维固相萃取/超高效液相色谱—串联质谱法检测牛奶中25种糖皮质激素[J]. 分析测试学报, 2022, 41(6): 812-819.

[5]农业部1031号公告-2-2008. 动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测 液相色谱—串联质谱法[S]. 北京: 中华人民共和国农业部, 2008.

[6]郭灿. 基于液相色谱—串联质谱技术的动物组织及牛羊奶中糖皮质激素检测方法研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2024.

[7]王秀云. 含二氧化钛的QuEChERS净化—超高效液相色谱—串联质谱法测定牛奶中15种糖皮质激素的残留量[J]. 理化检验—化学分册, 2022, 58(5): 581-587.

[8]闫永欢, 陈敏娜, 檀笑昕, 等. 整体柱在线净化—液相色谱—高分辨质谱法快速测定牛奶中15种糖皮质激素[J]. 分析试验室, 2021, 40(12): 1393-1398.

[9]余鹏飞, 倪娟桢, 赵月钧, 等. GO/HF-SPME-HPLC-MS/MS测定牛奶中7种糖皮质激素[J]. 食品工业, 2020, 41(1): 306-310.

[10]陈晓鹏. QuEChERS-UPLC-MS/MS同时测定乳制品中42种类固醇激素残留的研究[D]. 广州: 广州大学, 2017.

[11]田海伟, 冯浩彬, 李晋, 等. QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法快速测定牛奶中18种糖皮质激素类药物残留[J]. 食品科学, 2017, 38(12): 310-314.

[12]温家欣, 黄钰萍, 何嘉雯, 等. Captiva EMR 固相萃取—高效液相色谱—串联质谱法测定化妆品中41种糖皮质激素的含量[J]. 理化检验—化学分册, 2022, 58(2): 140-147.

[13]文英会, 张崇威, 刘占通, 等. SinCHERS-TC/超高效液相色谱—串联质谱法测定动物源性食品中51种药物残留[J]. 分析测试学报, 2025, 44(7): 1282-1289.

[14] GB 31650—2019 食品中兽药最大残留限量[S]. 北京: 中国农业出版社, 2019.

表1 标准物质参数表

Table 1 Reference material parameters table

表1（续）

表2 目标化合物的质谱分析参数

Table 2 Mass spectrometry analysis parameters of the target compound

注: “*”为定量离子对.

表2（续）

表2（续）

表2（续）

表3 51种目标化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

Table 3 Linear equation, correlation coefficients, detection limit and quantification limit of 51 target compounds

表3（续）