马鹏飞 魏 峰 殷祥刚 姚 静 于 晞 王莎莎 王周平

马鹏飞 ¹ 魏 峰 ¹ 殷祥刚 ¹ 姚 静 ¹ 于 晞 ¹ 王莎莎 ¹ 王周平 ^{2 *}

摘 要 本研究建立了一种基于适配体识别和二氧化铈金（Au@CeO₂）纳米酶催化显色的比色方法，用于检测牛奶中的常见致敏原 β -乳 球蛋白。由于适配体对 β -乳 球蛋白良好的亲和力和特异性，适配体与 β -乳 球蛋白结合后和Au@CeO₂纳米酶一同游离在溶液中，Au@CeO₂纳米酶催化四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）产生颜色变化，通过测量吸光度实现对 β -乳球蛋白的定量分析。在优化条件下，该方法对 β -乳 球蛋白的线性检测范围为10～200 μg/mL，在牛奶和奶粉中的加标回收率为96.32%～105.63%。本方法操作简便、灵敏度高，能够准确应用于实际样品中 β -乳 球蛋白的检测，为食品过敏原检测提供了新的技术手段。

关键词 β -乳 球蛋白；适配体；比色；二氧化铈金纳米酶

Research on Detection Methods for the Allergen β-Lactoglobulin Based on Aptamer Recognition

MA Peng-Fei¹ WEI Feng¹ YIN Xiang-Gang¹ YAO Jing¹ YU Xi¹

WANG Sha-Sha¹ WANG Zhou-Ping^2*

Abstract A colorimetric method was developed for detecting β-lactoglobulin (β-LG), a common milk allergen, by integrating aptamer recognition with the peroxidase-like catalytic activity of an Au@CeO₂ nanozyme. Owing to the high affinity and specificity of the aptamer toward β-LG, the aptamer forms a complex with β-LG and remains dispersed in solution together with the Au@CeO₂ nanozyme. The nanozyme catalyzes the oxidation of 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), producing a measurable color change. Quantification of β-LG was achieved by monitoring the absorbance signal. Under optimized conditions, the method exhibited a linear response to β-LG over 10–200 μg/mL. Spiked recoveries in milk and milk powder ranged from 96.32% to 105.63%. The proposed assay is simple, sensitive, and applicable to real samples, providing an alternative approach for food allergen analysis.

Keywords β-lactoglobulin; aptamer; colorimetry; Au@CeO₂ nanozyme

基金项目：海关总署科研项目（2024HK006）

第一作者：马鹏飞（1994—），男，汉族，安徽阜阳人，博士，高级工程师，主要从事进出口商品检验及鉴定工作，E-mail: mapf2011@163.com

通信作者：王周平（1974—），男，汉族，陕西宝鸡人，博士，教授，主要从事食品安全及控制工作，E-mail: wangzp@jiangnan.edu.cn

1. 南京海关纺织工业产品检测中心 无锡 214101

2. 江南大学食品学院 无锡 214122

1. Textile Industrial Products Testing Center of Nanjing Customs District, Wuxi 214101

2. School of Food Science, Jiangnan University, Wuxi 214122

牛乳中含有多种人体必需的氨基酸和矿物元素，营养价值高，广受消费者青睐。然而，牛乳中也存在潜在的致敏风险。研究显示，超过八成的牛乳过敏病例由β-乳球蛋白触发，该蛋白因此被视作牛乳中最关键的过敏原，并可作为评估牛乳致敏性的标志物^[1]。对β-乳球蛋白进行精确检测，不仅能为对牛乳过敏的人群提供安全的饮食指导，还能为海关提供准确的过敏原成分筛查技术手段。

适配体是通过指数富集配体进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）从人工合成的随机核苷酸文库中筛选获得能特异性结合靶标的单链寡核苷酸^[2-3]。适配体可以通过空间结构的匹配、氢键、范德华力和静电相互作用等分子间相互作用力与靶标进行高亲和性结合^[4-5]，具有以下优点：（1）人工合成，批次之间的差异小；（2）稳定性好，可长期保存，耐热性强；（3）亲和力高，特异性强，适配体的解离常数可低至纳摩尔级别；（4）易于化学修饰。因此，适配体在食品安全分析和环境检测等领域有着广泛的应用^[6]。有研究人员前期通过SELEX技术筛选获得了β-乳球蛋白的适配体，这为基于适配体识别实现对β -乳球蛋白的快速和准确检测提供了优异探针^[7]。

比色法以底物反应前后颜色变化为参照，利用紫外分光光度计或人眼实现定性或定量检测目标物，具有简单、便携、低成本和可视化的优点^[8-9]。纳米酶是一类具有类酶催化特性的纳米材料，其具有高稳定性、活性可调节、多功能性、可回收和可大规模制备的特征，已成为人工酶领域的一个研究热点^[10-12]。与天然酶相比，纳米酶具有稳定性好、易于制备、成本低和活性可调节等优点^[13-14]。二氧化铈金（Au@CeO₂）纳米酶是一种具有核壳结构的纳米材料，由二氧化铈（CeO₂）作为壳，金纳米颗粒（AuNPs）作为核组成，Au@CeO₂纳米酶具有类过氧化物酶活性，能够催化过氧化氢（H₂O₂）分解，产生具有比色响应的产物^[15]。随着纳米技术的快速发展和便携式设备的智能化进步，根据颜色变化实现对靶标的实时监测是确保食品安全的重要手段。

本研究基于适配体对β-乳 球蛋白优异的识别能力，利用二氧化铈金（Au@CeO₂）纳米酶的催化显色能力，结合纳米磁珠的快速分离能力，构建了基于适配体识别的β-乳 球蛋白检测的比色新方法，以期为乳及乳制品中过敏原β-乳球蛋白的现场和快速检测提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

β-乳球蛋白特异性适配体序列碱基组成为5’-AGC CGT TCG GAA CGA ACG GCT AGC TAT GCG GCG TAC CTA TGC GTG CTA CCG-3’［生工生物工程（上海）股份有限公司］；氯金酸三水合物（HAuCl₄· 3H₂O）、聚丙烯酸钠（Polyacrylic Acid Sodium，PAAS）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）、1-乙 基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（Ethyldimethylaminopropyl Carbodiimide，EDC）、氨水（阿拉丁生化科技股份有限公司）；四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）、β -乳球蛋白（上海生工生物工程技术服务有限公司）；氯化铈七水合物（CeCl₃·7H₂O）、α-乳白蛋白、酪蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白G［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］；链霉亲和素化磁珠［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］，其他常见试剂均为分析纯。

UV-1800分光光度计（日本Shimadzu公司）；ARR224CN电子天平、Starter 3C实验室pH计（奥豪斯仪器上海有限公司）；JEM-2100透射电子显微镜（日本JEOL公司）。

EDC和NHS用去离子水配制，现配现用。三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl，20 mmol/L，pH 8.0）缓冲液用去离子水配制，用HCl调节pH值为8.0。结合缓冲液（20 mM Tris–HCl，100 mM NaCl，50 mM MgCl₂，1 mM CaCl₂，pH值为7.6），用去离子水配制，用HCl调节pH值为7.6，所有的DNA序列均用结合缓冲液配置成相应浓度。

1.2 试验方法

1.2.1 二氧化铈金（Au@CeO ₂ ）纳米酶的制备

对于Au@CeO ₂ 纳米酶的合成，将10 mL氨水溶液（0.3 wt/v%）和1000 mL 0.24 mmol/L的 HAuCl ₄ 在25℃下充分混合，并持续搅拌。搅拌5 min后，迅速加入12 mL 0.5 mol/L CeCl ₃ 水溶液，并在25℃下持续搅拌反应25 min。最后，通过离心纯化得到Au@CeO ₂ 纳米酶。

1.2.2 基于磁分离的适配体功能化Au@CeO ₂ 纳米酶的组装

将1 mL Au@CeO ₂ 纳米酶（1 mg/mL）与25 μ L的PAAS在室温下充分混合，并孵育120 min。通过离心纯化聚丙烯酸钠包覆的Au@CeO ₂ 纳米酶（Au@CeO ₂ @PAA）后，将Au@CeO ₂ @PAA溶 液与40 μ L EDC和NHS（25 mmol/L）充分混合40 min。之后， 加入200 μ L氨基化 β -乳球蛋白适配体（10 μ mol/ L），适配体通过标准的EDC-NHS反应与Au@CeO ₂ 纳米酶结合。通过离心清洗纯化后，在Tris–HCl（20 mmol/L，pH 8.0）缓冲液中存储备用 。

将0.5 mg/mL链霉亲和素化的磁珠与1 μ mol/L生物素化互补短链等体积混合后，在室温下振荡孵育结合10 min后，磁分离去除上清液，将磁珠用10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液清洗后，得到链霉亲和素化磁珠— 互补链复合体系。

1.2.3 比色检测体系的构建

取 200 μ L链霉亲和素化磁珠互补链溶液与200 μ L适配体功能化Au@CeO ₂ 纳米酶在结合缓冲液中混合，在室温下振荡孵育15 min后，磁分离去除上清液，收集组装好的纳米材料复合物，即互补链功能化磁珠适配体功能化Au@CeO ₂ 纳米酶。将组装好的纳米材料复合物溶解在结合缓冲液中，将不同浓度的 β -乳球蛋白加入到体系中，在室温下结合孵育30 min后，磁分离收集上清液。将含有0.1% H ₂ O ₂ 的TMB溶液加入到上清液中，随后进行20 min的孵育，最后利用紫外可见光分光光度计来测定溶液在652 nm处的吸光度信号。

1.2.4 实际样品前处理

称取超高温灭菌牛奶试样5 g或奶粉5 g，加水 定容至25 mL后，加入乙酸调节pH为4.6，混匀 静置1 h后， 通过离心去除沉淀，吸取上清液过0.45 μ m滤膜，用结合缓冲液将滤液中和。加标回收率测试为分别向牛奶或奶粉样品中加入 β -乳 球蛋白，使其终浓度为10 μ g/mL、50 μ g/mL和100 μ g/mL，扣除样品的背景信号后考察构建的比色适配体传感器在实际样本检测中的性能。

2 结果与讨论

2.1 检测原理

图1中展示了基于磁性纳米材料和适配体功能化的Au@CeO ₂ 纳米酶比色检测 β -乳 球蛋白的原理图。磁性纳米材料的表面连接了与适配体序列部分互补的短链，通过DNA碱基互补配对，组装得到了磁性纳米材料适配体功能化的Au@CeO ₂ 纳米酶复合纳米结构。当检测体系存在 β -乳 球蛋白时，适配体识别 β -乳 球蛋白从而与磁性纳米材料上的互补短链解离，适配体功能化的Au@CeO ₂ 纳米酶游离在溶液中。通过磁分离去除未参与结合的磁性纳米材料适配体功能化Au@CeO ₂ 纳米酶复合纳米结构后，溶液中仅存在因识别 β -乳 球蛋白而游离在溶液中的适配体功能化的Au@CeO ₂ 纳米酶，加入TMB和H ₂ O ₂ 后，Au@CeO ₂ 纳米酶催化TMB显色实现了对 β -乳 球蛋白的检测。

2.2 Au@CeO ₂ 纳米酶的表征

A u@CeO ₂ 纳米酶的形成过程为：当向 AuCl ₄ ^- 离子和氨水溶液的混合物中加入Ce ³⁺ 离子时，由于Ce ³⁺ 具有很强的还原性，它可以将Au ³⁺ 还原为Au ⁰ ，从而同时形成金纳米颗粒（Au NPs）和二氧化铈纳米簇（CeO ₂ nanoclusters）。图2的透射电镜图表明Au@CeO ₂ 纳米酶具有均匀的核壳结构和良好的分散性。Au@CeO ₂ 纳米颗粒的平均直径为19.5 nm（图3）。图4的元素分布分析表明，金（Au）元素主要分布在核中，而铈（Ce）和氧（O）元素则分布在周围，说明CeO ₂ 成功包被在金纳米粒子外面。上述分析表明Au@CeO ₂ 纳米酶的成功制备 。

图2 Au@CeO₂纳米酶的透射电镜图

Fig.2 TEM image of the Au@CeO₂nanozyme

2.3 试验条件优化

2.3.1 磁珠互补链最佳连接浓度

通过链霉亲和素生物素的高效特异性结合，将互补链（Complementary DNA，cDNA）与磁珠（Magnetic Bead，MB）连接。在保持互补链浓度为1 μmol/L的条件下，将不同浓度的磁珠溶液与互补链混合孵育10 min，随后进行磁分离，并测定上清液在260 nm处的吸光度。试验结果表明，随着磁珠浓度的升高，上清液中互补链cDNA的吸光度从0.14逐渐降低至0.02，并趋于稳定。因此，确定0.5 mg/mL的磁珠浓度为与1 μmol/L互补链相匹配的最佳浓度，如图5A所示。

2.3.2 互补链和适配体浓度之比

适配体（aptamer，apt）通过与cDNA之间碱基互补，从而实现MB-cDNA-apt的自组装。当apt浓度过低时，只有少量的Au@CeO₂ 纳米酶催化TMB显色，导致检测效率过低；然而当apt浓度达到一定程度后，经磁分离后的上清液中，会出现未能与cDNA互补的游离apt，这些游离的apt-Au@CeO₂纳米酶在没有靶标的情况下依然会催化TMB显色，导致严重的检测背景信号。因此，经过优化实验，本研究最终选择1∶1 .5作为最优的cDNA和适配体浓度之比（如图5B）。

2.3.3 互补链和适配体孵育时间

cDNA磁珠和适配体Au@CeO₂纳米酶间的杂交时间会影响检测结果的时效性。图5C表明随着时间推移，参与杂交的cDNA数量不断增加，进而被连接在磁珠表面。当杂交时长超过15 min，体系吸光度出现轻微下降趋势，这表明cDNA与适配体之间的杂交反应已接近动态平衡状态。因此，15 min是cDNA与适配体之间最优的杂交时间。

2.3.4 适配体与β- 乳 球蛋白反应时间

如图5D所示，当apt与β- 乳 球蛋白孵育反应时间达到30 min后，上清液中吸光度数值趋于稳定，故选择30 min作为适配体与靶标反应的时间。

2.4 牛乳中β- 乳球蛋白定量检测方法的建立

如图6所示，在最优条件下，随着β- 乳 球蛋白浓度的增加，检测体系在652 nm处的吸光度信号强度逐渐增大，表明本方法所建立的适配体传感器对β- 乳 球蛋白浓度响应良好。如图7所示，在10～200 μg/mL范围内，体系的吸光度数值与β- 乳 球蛋白浓度之间呈现良好的线性关系（Y=0.00233+0.24416X，R²=0.997），检测限（Limit of Detection，LOD）为5.2 μg /mL（LOD=3×σ/S，其中σ为空白样品信号的标准差，S为校准曲线的斜率）。

1～14为样品; M为DNA Marker

图6 适配体传感器对不同浓度的β-乳球蛋白的比色响应

Fig.6 Colorimetric response of the aptasensor to β-lactoglobulin at different concentrations

图7 10 ～200 μg/mL范围内相应的标准曲线

Fig.7 Calibration curve for β-lactoglobulin in the range of 10–200 μg/mL

另外，与其他已报道的检测方法相比，本方法在线性范围和检测限上具有优越性，见表1。

表1 本方法与文献方法的比较

Table 1 Comparison of the proposed method with previously reported methods

2.5 特异性和稳定性

为验证所构建比色适配体传感器对β- 乳 球蛋白的检测特异性，本研究考察了牛奶中共存物（包括α-乳白蛋白、酪蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白G、乳铁蛋白及乳糖）的干扰情况。如图8所示，β- 乳 球蛋白组的浓度为100 μg/mL，其他物质浓度为500 μg/mL，即使这些干扰物的浓度达到目标物β- 乳 球蛋白的5倍，其产生的比色信号仍可忽略。在此基础上，同时存在β- 乳 球蛋白与各干扰物的混合组中，传感器比色信号值与仅含β- 乳 球蛋白时的响应并无明显差别。以上结果表明，所构建的比色适配体传感器对β- 乳 球蛋白的检测具有良好的特异性。

为评估所构建比色适配体传感器的储存稳定性，将基于磁性纳米材料与适配体功能化的Au@CeO₂纳米酶置于4℃条件下贮存，并每间隔5 d取样，用于检测浓度为50 μg/mL的β- 乳 球蛋白。结果如图9显示，在储存初始15 d内，比色响应信号未见显著改变；贮存至30 d后，信号强度仅轻微下降约4.9%。该结果表明，所开发的比色适配体传感器具备良好的储存稳定性。

2.6 回收率试验结果

为评估构建的比色适配体传感器在实际样品中的适用性，如表2所示在牛奶和奶粉样品中进行了加标回收率测试，β- 乳 球蛋白的加标回收率在96.32～105.63%之间，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）小于5%，表明该检测方法在实际样品中对β- 乳 球蛋白的检测具有很高的准确性。

3 结论

本研究在温和条件下合成了具有类过氧化物酶活性的Au@CeO₂纳米酶，并将其作为比色信号探针应用于β- 乳 球蛋白的可视化分析。基于该纳米酶高效的类过氧化物酶模拟活性，在过氧化氢存在下可显著催化TMB氧化并放大比色响应，实现了对β- 乳球蛋白在10～200 μg/mL浓度范围内的线性检测。同时，进行了特异性、稳定性和回收率试验，证实了方法的可靠性和可行性，为β- 乳 球蛋白的检测提供了一种新方法。

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图1 基于磁分离和Au@CeO₂纳米酶比色检测β-乳球蛋白的原理图

Fig.1 Schematic illustration of β-lactoglobulin detection based on magnetic separation and Au@CeO₂nanozyme-catalyzed

colorimetry

图3 Au@CeO ₂纳米酶的粒径分布

Fig.3 Particle size distribution of the Au@CeO ₂ nanozyme

A: 叠加图; B: 金元素; C: 铈元素; D: 氧元素

图4 Au@CeO₂纳米酶的元素分布图

Fig.4 Elemental mapping of the Au@CeO₂ nanozyme

A: 磁珠浓度优化; B: 互补链和适配体浓度之比; C: 互补链与适配体杂交时间优化; D: 适配体与β-乳球蛋白孵育时间优化

图5 检测条件优化

Fig.5 Optimization of assay conditions

图8 比色适配体传感器的特异性

Fig.8 Specificity of the colorimetric aptasensor

图9 比色适配体传感器的存储稳定性

Fig.9 Storage stability of the colorimetric aptasensor

表2 牛奶和奶粉中β-乳球蛋白测定结果

Table 2 Determination of β-lactoglobulin in milk and milk powder samples