戴小丽 唐梓伦 徐志伟 梁振纲 苏姗姗 孟 茹 王玉健

戴小丽 ¹ 唐梓伦 ¹ 徐志伟 ¹ 梁振纲 ^{1 *} 苏姗姗 ² 孟 茹 ³ 王玉健 ¹

摘 要 本研究采用QuEChERS结合超高效液相色谱—三重四极杆质谱仪（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometer，UPLC-MS/MS），建立了6种植物油中丙硫菌唑及其代谢物残留的快速检测方法，并对方法的色谱条件、样品净化方式进行了考察和优化。样品用乙腈提取后，经Agilent AQ-C₁₈（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）色谱柱分离，多反应监测模式扫描，外标法定量。结果表明，丙硫菌唑及其代谢物在2.5～100.0 ng/mL范围内线性关系良好，方法定量限为0.005 mg/kg，分别以菜籽油、枸杞籽油、花生油、大豆油、山柚油和棉籽油为基质，添加水平为0.005 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg时，分别进行6次平行测定，回收率范围为64.5%～113%，相对标准偏差为0.3%～17.3%。该方法操作简便、灵敏度高，回收率和准确性能够满足植物油中丙硫菌唑及其代谢物残留量测定要求，可为进出口植物油质量安全监管与技术执法提供稳定可靠的技术支持。

关键词 丙硫菌唑及其代谢物；QuEChERS；超高效液相色谱—三重四极杆质谱仪；植物油

Determination of Prothioconazole and Its Metabolites

in Vegetable Oils by QuEChERS Combined with

UPLC- MS/MS

DAI Xiao-Li¹ TANG Zi-Lun¹ XU Zhi-Wei¹ LIANG Zhen-Gang^1* SU Shan-Shan²

MENG Ru³ WANG Yu-Jian¹

Abstract An efficient method was developed for the determination of prothioconazole and its metabolites in six vegetable oils by using QuEChERS combined with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer (UPLC-MS/MS), and the chromatographic conditions and sample purification methods were investigated and optimized. Samples were extracted with acetonitrile and separated on an Agilent AQ-C₁₈ column (2.1 mm×100 mm, 2.7 μm). Detection was performed in multiple reaction monitoring (MRM) mode, and quantification was conducted using external standard calibration. The results showed that prothioconazole and its metabolites exhibited good linearity in the range of 2.5-100.0 ng/mL, with a method limit of quantification (LOQ) of 0.005 mg/kg. Recoveries were evaluated at three spiked levels (0.005, 0.05 and 0.1 mg/kg) with six replicates in six matrices, including rapeseed oil, wolfberry seed oil, peanut oil, soybean oil, Camellia oleifera oil and cottonseed oil. The recoveries ranged from 64.5%-113%, with relative standard deviations (RSDs) of 0.3%-17.3%. This method is simple, sensitive, and accurate with satisfactory recovery, meeting the requirements for the determination of prothioconazole and its metabolites in vegetable oils, and providing stable and reliable technical support for quality and safety supervision and technical enforcement of imported and exported vegetable oils.

Keywords prothioconazole and its metabolites; QuEChERS; ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer (UPLC-MS/MS); vegetable oils

基金项目：海关总署科研项目（2023HK025，2024HK128）

第一作者：戴小丽（1991—），女，汉族，海南海口人，本科，工程师，主要从事食品化妆品安全检测工作，E-mail: 378733095@qq.com

通信作者：梁振纲（1987—），男，汉族，海南万宁人，硕士， 高级工程师，主要从事食品化妆品安全检测工作，E-mail: 362056312@163.com

1. 海口海关技术中心 海口 570311

2. 西宁海关技术中心 西宁 810000

3. 伊宁海关技术中心 伊宁 835000

1. Technology Center of Haikou Customs, Haikou 570311

2. Technology Center of Xining Customs, Xining 810000

3. Technology Center of Yining Customs, Yining 835000

植物油作为人体膳食脂肪和脂溶性维生素的重要来源，其质量安全至关重要。在农业生产中，农药的施用是保障油料作物高产、稳产的关键措施之一。丙硫菌唑是一种新型三唑类广谱杀菌剂，对镰刀菌、锈菌等多种病原菌具有高效抑制活性，被广泛应用于小麦、油菜、大豆等食用油原料作物的病虫害防控^[1-2]。脱硫丙硫菌唑作为丙硫菌唑在生物体及环境中的主要代谢产物，不仅具有与母体化合物相当的稳定性，其急性毒性甚至显著高于母体^[3-4]，被欧盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）列为需重点监控的潜在毒性代谢物。随着丙硫菌唑在油料作物种植中的规模化应用，其残留风险经油料作物向植物油迁移的问题日益凸显^[5-6]，长期摄入可能对人体构成膳食安全隐患。

目前，EFSA对大豆、花生等油料作物中丙硫菌唑残留制定了0.02~0.1 mg/kg^[7]的限量要求，我国GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》^[8]对其在谷物及油料作物中的残留限量也进行了规定。现有检测方法主要有气相色谱—质谱法^[9]、高效液相色谱法^[10]等，前处理多采用液液萃取^[11]或固相萃取净化^[12]，该过程需消耗大量有机溶剂，不仅耗时长、成本高，还易因油脂基质干扰导致检测灵敏度不足，针对植物油这类高脂肪复杂基质的检测鲜有报道。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）技术作为复杂基质样品前处理中极具应用优势的方法，通过吸附剂与基质杂质的特异性作用实现高效净化，已在农药残留检测中被广泛使用^[13-14]。本研究针对植物油高脂肪基质，采用QuEChERS技术，结合超高效液相色谱—串联质谱/质谱，建立植物油中丙硫菌唑及其代谢物脱硫丙硫菌唑残留的快速检测方法，为植物油安全监管提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1290液相色谱仪（美国安捷伦公司）；API 4000Q质谱仪（美国AB公司），旋涡混匀器（广州IKA公司）；离心机（Eppendorf公司）；G-285电子天平（Mettler公司）。

资生堂MGⅢ（3.0 mm×100 mm，3 μm）色谱柱；Agilent AQ-C₁₈（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）色谱柱。

乙腈、甲酸均为色谱纯（德国默克公司）；丙硫菌唑标准物质100 μg/mL（天津阿尔塔公司）；脱硫丙硫菌唑标准物质100 μg/mL（天津阿尔塔公司）；C₁₈（十八烷基硅烷键合相）、PSA（N-丙基乙二胺）、GCB（石墨化碳黑）均采购自美国安捷伦公司。

混合标准溶液配制：分别吸取丙硫菌唑标准物质100 μg/mL、脱硫丙硫菌唑标准物质100 μg/mL各1 mL，于10 mL容量瓶中，添加乙腈稀释至刻度，配制成10 μg/mL混合标准储备液，置于0～4℃下避光保存。

1.2 样品处理

准确称取样品5 g（精确至0.01 g），于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入5 g无水硫酸镁、10 mL乙腈涡旋震荡提取10 min，10000 r/min离心5 min，备用。分别取上述备用液2 mL至另一干净玻璃试管中，加入100 mg的C₁₈吸附剂，涡旋混合1 min后5000 r/min离心3 min，取上清液1 mL过0.22 μm滤膜，待超高效液相色谱—三重四极杆质谱仪（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometer，UPLC-MS/MS）测定。

1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent AQ-C₁₈（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流速：0.55 mL/min；柱温：40；进样量：10 μL；流动相：5 mmol 乙酸铵–0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表1。

1.4 质谱条件

电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI），正、负离子扫描，多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式，离子源温度550，雾化气50 L/h，辅助气50 L/h。质谱条件见表2。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

丙硫菌唑与脱硫丙硫菌唑为中等极性化合物，采用反相色谱分离。对比MGⅢ（3.0 mm×100 mm，3 μm）与AQ-C₁₈（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）色谱柱，如图1所示，前者分离目标物时峰型拖尾，后者峰型尖锐对称，可能是因为AQ-C₁₈通过高密度双封端及极性基团嵌入，消除了丙硫菌唑分子中三唑环与硅胶残留硅羟基的次级相互作用，故选用AQ-C₁₈为后续测试色谱柱。两种色谱柱条件下的峰型比较如图1所示。

试验进一步考察了不同流动相体系（纯水、0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸–5 mmol/L乙酸铵水溶液）对目标物质谱响应及色谱保留行为的影响。丙硫菌唑用负离子模式、脱硫丙硫菌唑用正离子模式检测，纯水体系丙硫菌唑和脱硫丙硫菌唑质谱响应不高，0.1%甲酸–5 mmol/L乙酸铵体系中，丙硫菌唑质谱响应较0.1%甲酸时显著提升，这是因为乙酸铵的加入有助于丙硫菌唑在负离子模式下的离子化，脱硫丙硫菌唑响应则不受影响。因此，选择0.1%甲酸–5 mmol/L乙酸铵体系为水相流动相。

2.2 前处理条件优化

乙腈是QuEChERS常用提取溶剂，丙硫菌唑、脱硫丙硫菌唑均易溶于乙腈，故本研究选用乙腈作为提取溶剂，分别考察C₁₈、GCB、PSA的净化效果，结果显示GCB、PSA均对丙硫菌唑表现出不同程度的吸附能力。这是因为PSA的氨基起到氢键供体作用，与丙硫菌唑中的三唑环N原子和酰胺键氧原子形成氢键，同时丙硫菌唑的平面共轭结构在乙腈中容易和GCB结合，导致GCB净化时丙硫菌唑平均回收率仅25%，PSA处理后则无回收，与文献^[15]结论基本一致。针对脱硫丙硫菌唑，其在ESI⁺电离模式下表现出显著的基质增强效应。经优化验证，PSA与GCB均未能有效消减该效应。C₁₈对2种目标物均表现出良好的净化效果。在菜籽油基质检测中，C₁₈能有效去除乙腈共萃的色素，净化后提取液最为澄清，因此本试验选择C₁₈作为净化吸附剂。不同吸附剂的净化效果及回收率对比如图2所示。

2.3 基质效应、线性关系及检出限

本研究通过测定相同浓度梯度下空白基质标液与纯溶剂标液中离子信号强度，通过基质标准曲线与纯溶剂标准曲线的斜率比来评价基质效应。基质效应（ME）按公式（1）进行计算：

(1)

当｜ME｜≤20%时，存在弱基质效应，反之则为强基质效应。结果表明，丙硫菌唑、脱硫丙硫菌唑在2.5～100.0 μg/L范围内有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，线性方程及相关系数见表3。丙硫菌唑｜ME｜=11.8%，脱硫丙硫菌唑｜ME｜=52.2%，脱硫丙硫菌唑存在较强的基质干扰，因此采用基质匹配标准曲线进行定量校正，以消除离子化抑制效应的影响。以实际检测时的信噪比（S/N）为10作为定量限，本方法丙硫菌唑和脱硫丙硫菌唑的定量限为0.005 mg/kg。

2.4 回收率与精密度试验

对菜籽油、枸杞籽油、花生油、大豆油、山柚油和棉籽油分别进行低、中、高3个水平的加标回收试验，每个添加浓度做6次平行试验，考察回收率和精密度。平均回收率及相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）结果见表4、表5。丙硫菌唑平均回收率范围为64.5%～107%、RSD为2.1%～17.3%，脱硫丙硫菌唑平均回收率范围为69.3%～113%、RSD为0.3%～8.5%。

丙硫菌唑采用ESI⁺模式检测，其在大豆油与棉籽油基质的中、低加标水平下回收率偏低，可能因其自身的中等脂溶性在C₁₈净化过程中存在一定的非特异性吸附，该吸附损失在痕量水平下占比显著升高，同时2种基质中高含量的磷脂、棉酚等干扰物会引发较强的基质抑制效应，对中、低浓度目标物的响应影响更为突出。其特征代谢物脱硫丙硫菌唑在ESI⁺模式下呈现显著的基质增强效应，该效应在高加标水平下减弱，出现回收率降低的现象。

3 结论

本研究通过对前处理条件和仪器参数的系统优化，建立了一种可同时测定6种常见食用植物油中丙硫菌唑及其代谢物残留量的分析方法。经方法学验证，该方法能有效消除高油脂复杂基质带来的干扰，具有良好的灵敏度、精密度和回收率，适用于进出口食用植物油的检测，能够为相关产品的质量安全监管、风险预警及贸易合规提供可靠的技术支持。

参考文献

[1] 梅梁赤. 丙硫菌唑及代谢物对映体在小麦植株中的迁移转化[D]. 合肥: 安徽农业大学, 2024.

[2] 周飞, 李宏伟, 张扬, 等. 丙硫菌唑在6种病害上的应用研究[J]. 安徽农业科学, 2022, 50(14): 134-138.

[3] Zhang Z, Du G, Gao B, et al. Stereoselective endocrine-disrupting effects of the chiral triazole fungicide prothioconazole and its chiral metabolite[J]. Environmental Pollution, 2019, 251: 30-36.

[4] 郭亚歌, 徐军, 董丰收, 等. 关于JMPR植物源产品残留定义中含有代谢产物的农药在进行膳食风险评估时残留数据计算的介绍[J]. 植物保护, 2021, 47(2): 169-178+199.

[5] 石永红, 王凤忠, 范蓓, 等. 油脂加工过程中农药残留及加工风险评估的研究[J]. 中国粮油学报, 2025, 40(2): 220-226.

[6] 王岩. 食用油中有害物质的检测方法与风险评估[J]. 中外食品工业, 2024(4): 55-57.

[7] European Food Safety Authority. Reasoned opinion on the review of the existing maximum residue levels MRLs for prothioconazole according to Article 12 of Regulation EC No 3962005[J]. EFSA Journal, 2014, 12(5): 3689. DOI:10.2903/j.efsa.2014.3689.

[8] GB 2763—2021食品安全国家标准　食品中农药最大残留限量[S]. 北京: 中国标准出版社, 2021.

[9] 管阳凡, 杨惠琴, 郭德华. 农药残留检测用联苯三唑醇和丙硫菌唑标准物质的定值与不确定度评估[J]. 理化检验 (化学分册), 2019, 55(1): 91-96.

[10] 杨森, 杨金川, 王卉, 等. 高效液相色谱法测定水稻中丙硫多菌灵的残留检测方法及消解动态研究[J]. 农药科学与管理, 2012, 33(9): 29-36.

[11] 郭兴乐. 基于分散液液微萃取技术分析食品中甲基对硫磷和丙硫菌唑[D]. 太原: 山西农业大学, 2024.

[12] 孙明娜, 余璐, 王雯雯, 等. QuEChERS-液质联用法同时测定农产品中3种农药及其代谢物残留[J]. 安徽农业科学, 2019, 47(18): 211-214.

[13] 刘亚伟, 董一威, 孙宝利, 等. QuEChERS在食品中农药多残留检测的应用研究进展[J]. 食品科学, 2009, 30(9): 285-289.

[14] 欧帅, 马诚仁, 王婧媛, 等. 果蔬中农药残留检测前处理方法应用进展[J]. 中国农学通报, 2025, 41(2): 133-139.

[15] 史晓梅, 金芬, 杜欣蔚, 等. 液相色谱—串联质谱法测定花生中丙硫菌唑及其脱硫代谢物[J]. 分析化学, 2012, 40(8): 1284-1288.

表1 丙硫菌唑及脱硫丙硫菌唑梯度洗脱条件

Table 1 Gradient elution conditions for prothioconazole and prothioconazole-desthio

时间 (min)乙腈 (%)5 mmol乙酸铵–0.1%甲酸水溶液 (%)

0.00199

1.00199

1.50955

4.00955

4.10199

6.00199

表2 丙硫菌唑及脱硫丙硫菌唑的MRM模式扫描参数

Table 2 MRM scanning parameters for prothioconazole and prothioconazole-desthio

注: *表示定量离子

峰1、峰3为脱硫丙硫菌唑; 峰2、峰4为丙硫菌唑

图2 不同净化方法的回收率比较

Fig.2 Comparison of recoveries obtained with different purification methods

图1 不同色谱柱条件下的峰型比较

Fig.1 Comparison of peaks under different chromatographic column conditions

基质匹配标准曲线斜率

溶剂标准曲线斜率

ME (%)= ( –1) ×100

表3 丙硫菌唑及脱硫丙硫菌唑的线性方程及相关系数

Table 3 Linear equations and correlation coefficients of prothioconazole and prothioconazole-desthio

化合物名称线性方程相关系数

丙硫菌唑 Y =790 X R ² =0.9962

脱硫丙硫菌唑 Y =2.63e+003 X R ² =0.9982

表4 丙硫菌唑平均回收率和相对标准偏差（n=6）

Table 4 Average recoveries and RSDs of piked prothioconazole (n=6)

添加水平 (mg/kg)

化合物0.0050.050.1

平均回收率 (%)RSD (%)平均回收率 (%)RSD (%)平均回收率 (%)RSD (%)

菜籽油89.98.4101.03.793.34.6

枸杞籽油92.513.5101.03.3107.02.6

花生油93.06.195.93.4105.02.8

大豆油64.53.279.35.489.02.7

棉籽油67.48.387.22.999.92.1

山柚油82.517.389.42.7103.03.2

表5 脱硫丙硫菌唑平均回收率和相对标准偏差（n=6）

Table 5 Average recoveries and RSDs of prothioconazole-desthio (n=6)

添加水平 (mg/kg)

化合物0.0050.050.1

平均回收率 (%)RSD (%)平均回收率 (%)RSD (%)平均回收率 (%)RSD (%)

菜籽油69.38.589.76.173.01.2

枸杞籽油88.54.182.92.080.03.9

花生油89.15.575.91.573.10.3

大豆油95.15.4113.03.4106.02.1

棉籽油92.84.386.11.883.53.8

山柚油84.53.91012.71061.5