口岸滩涂养殖用水中诺如病毒和甲型肝炎病毒富集新方法的建立-中国口岸科学技术-2026年03期

口岸滩涂养殖用水中诺如病毒和甲型肝炎病毒富集新方法的建立

作者：齐欣罗宝正王小玉刘莹麻丽丹

齐欣罗宝正王小玉刘莹麻丽丹

齐欣¹ 罗宝正² 王小玉² 刘莹¹ 麻丽丹^{2 *}

摘要 本研究利用混合纤维素膜—超滤法对口岸滩涂养殖用水中诺如病毒（Norovirus，NoV）和甲型肝炎病毒（Hepatitis A Virus，HAV）进行富集浓缩及检测，以评估本富集方法对常见病毒的富集效果。在人工污染NoV和HAV的滩涂养殖海水中加入过程控制病毒MS2，采用建立的富集方法对病毒进行富集浓缩，经逆转录定量聚合酶链式反应（Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）检测后计算过程控制病毒MS2的回收率及扩增抑制指数，并开展灵敏度和重复性试验分析。本研究平均回收率达（28.19±6.19）%，扩增抑制指数均满足试验要求。确定NoV GⅠ型、NoV GⅡ型和HAV的检测灵敏度分别为300拷贝/500 mL、22拷贝/500 mL和550拷贝/500 mL，并且检测结果稳定可靠，可为养殖用水的有效监测和风险预警提供技术支持。

关键词 诺如病毒；甲肝病毒；口岸滩涂养殖用水；纤维素膜—超滤法；逆转录定量聚合酶链式反应；富集检测

Establishment of a New Method for Enrichment of Norovirus and Hepatitis A Virus in Aquaculture Water from Port Tidal Flats

QI Xin¹ LUO Bao-Zheng² WANG Xiao-Yu² LIU Ying¹ MA Li-Dan^2*

Abstract In this study, a mixed cellulose membrane–ultrafiltration method was employed to enrich and concentrate Norovirus (NoV) and Hepatitis A virus (HAV) in aquaculture water from port tidal flats, and the enrichment efficiency of this method for common viruses was evaluated. Artificial contamination of tidal flat aquaculture water with NoV and HAV was performed, followed by addition of the process control virus MS2. Viruses were enriched and concentrated using the established method, and the recovery rate and amplification inhibition index of MS2 were calculated via reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Sensitivity and repeatability tests were also conducted. The average recovery rate reached (28.19 ± 6.19)%, and the amplification inhibition indices met the experimental requirements. The detection limits for NoV GⅠ, NoV GⅡ, and HAV were determined to be 300 copies/500 mL, 22 copies/500 mL, and 550 copies/500 mL, respectively. The results were stable and reliable, providing technical support for effective monitoring and risk early warning of aquaculture water.

Keywords norovirus; hepatitis A virus; aquaculture water from port tidal flats; mixed cellulose membrane-ultrafiltration method; RT-qPCR; enrichment and detection

基金项目：海关总署科研项目（2024HK014，2024HK140）

第一作者：齐欣（1984—），女，汉族，河北昌黎人，硕士，高级工程师，主要从事微生物检验工作，E-mail: 110697186@qq.com

通信作者：麻丽丹（1976—），女，汉族，浙江丽水人，硕士，正高级工程师，主要从事微生物检验工作，E-mail: 2212097@163.com

1. 大连海关技术中心大连 116001

2. 拱北海关技术中心珠海 519000

1. Technology Center of Dalian Customs District, Dalian 116001

2. Technology Center of Gongbei Customs District, Zhuhai 519000

诺如病毒（Norovirus，NoV）和甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）能够引发人类急性非细菌性胃肠炎或甲型肝炎的流行，可通过水源、食物源以及粪—口途径进行传播^[1-3]。水作为主要的病毒传播载体，可通过病毒的生物富集或介水传播污染产品质量，进而带来安全隐患^[4-6]，由此引发的食品安全事件对公众健康及社会经济发展造成严重的影响^[7-11]。同时，病毒在水环境有稳定性强、分布离散且含量低等特点，更是增加了其检测难度，实际检测中需通过浓缩富集步骤提高病毒的浓度含量，因此对其进行快捷、高效的富集是检测成功的关键^[12]。另外，再结合逆转录定量聚合酶链式反应（Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）^[13-15]、环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）^[16-17]、下一代测序（Next-generation Sequencing，NGS）^[18]等分子检测技术，以提高常见病毒精准检测鉴别的能力和速度。

近年来，加强水环境中NoV和HAV的监测和研究已成为疾病防控的重要手段^[19-20]。面对水体中常见病毒回收率低且回收效果不稳定的情况，本研究在采用混合纤维素膜的基础上结合超滤法建立了口岸滩涂养殖用水中病毒富集新方法，并基于常见病毒检测“金标准”方法RT-qPCR开展NoV和HAV检测，以期为常见病毒的口岸滩涂养殖用水污染监测和风险预警提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料来源

NoV GⅠ型质控品（原液浓度为3000拷贝/mL）、NoV GⅡ型质控品（原液浓度为220 拷贝/mL）、HAV质控品（原液浓度为110拷贝/mL）和过程控制病毒MS2（浓度1.57×10¹¹ PFU/mL）均由北京美正生物科技有限公司提供；选取经高压灭菌处理的口岸滩涂养殖用水作为研究样本。

1.2 试剂与设备

六水氯化镁（MgCl₂·6H₂O）、盐酸（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；TGBE缓冲液（pH值为9.5±0.2，货号LRNV001，北京美正生物科技有限公司）；无菌混合纤维素膜（货号HAWP04700，美国密理博公司）；超滤浓缩离心管（规格15 mL，截留分子量100 KD，美国默克密理博公司）；病毒提取试剂盒QIAamp viral RNA mini kit（货号52904，德国QIAGEN）；外加扩增控制RNA（货号LR73174/LR73264）、一步法RT-qPCR Mix（Taman）试剂盒（5 0）（货号LR78301）均购自北京美正生物科技有限公司；MS2、NoV GⅠ型、NoV GⅡ型和HAV的引物及探针参照文献^[21-22]中序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

全自动微生物过滤检验装置（Milliflex plus，美国默克密理博公司）；超低温冰箱（ULTS1490，美国赛默飞公司）；超速离心机（XE-100，美国Optima）；高压蒸汽灭菌锅（CL-40M，日本ALP）；实时荧光定量PCR系统（QS7，美国Life technologies）。

1.3 实验方法

1.3.1 病毒富集浓缩

目前，水体中NoV和HAV的检测主要依据国际标准ISO 15216–2: 2019 Microbiology of the food chain—Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus using real-time RT-PCR—Part2: Method for detection^[22]及我国行业标准SN/T 4784—2017《出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法实时RT-PCR方法》^[23]，方法均采用正电膜吸附结合超滤浓缩管进行病毒富集，适用范围仅包括瓶装水。但实际市场上销售的单纯的正电膜较少，不适用于水体中病毒过滤吸附的普及使用。同时，相关研究表明，超滤法、聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）和超速离心法等在病毒富集中均表现出较好的效果^[24-25]。在此基础上，本研究选取应用广泛且适用性强的混合纤维素膜对水体中病毒进行过滤吸附，同时考虑PEG沉淀操作繁琐、超速离心法使用设备昂贵等原因，继续选择易于操作的超滤浓缩管进行病毒浓缩。

病毒富集浓缩具体步骤：取样本500 mL，加入10 µL过程控制病毒MS2后振荡混匀。向其中加入MgCl₂·6H₂O使其终浓度为0.05 mol/L，并用6 mol/L盐酸调节pH值至3.0。将混合纤维素膜置于全自动微生物过滤检验装置后开始缓慢过滤样本，再将滤膜剪碎后放入50 mL离心管中，加入15 mL TGBE缓冲液，400 r/min室温振荡30 min以洗脱病毒。将离心管中的提取液全部转移至另一个无菌的50 mL离心管中，用6 mol/L盐酸调节提取液pH值至7.0，并将提取液全部转移到超滤浓缩离心管中，5000 g室温离心15 min。将浓缩管中的提取液转移到一个无RNase离心管中，测定并记录提取液体积，用于后续RNA提取。

1.3.2 病毒RNA提取

取1.3.1节获得的样本富集液140 μL，采用商业化QIAamp viral RNA mini kit试剂盒提取样本中的病毒RNA，具体操作步骤参照说明书。并将提取的样本病毒RNA于–80 超低温冰箱保存备用。

1.3.3 RT-qPCR反应体系及参数

RT-qPCR反应体系总体积为25 μL，包括2×RT-Buffer反应液12. 5 μL、酶混合液1.0 μL、上游引物0.8 μL ( 10 μmol/L) 、下游引物0.8 μL ( 10 μmol/L) 、探针0.5 μL(10 μLmol /L) 、RNA 模板5 μL、RNase Free H₂O 4.4 μL。

反应参数：45 30 min；9 5 5 m i n ；9 5 15 s；60 30 s，72 30 s，45个循环。于60 采集荧光信号。

1.3.4 过程控制病毒MS2回收率有效性评价

取10 μL过程控制病毒MS2加入到130 μL超纯水中，依照1.3.2节的方法提取RNA，将提取的MS2 RNA用超纯水进行10×梯度稀释，经RT-qPCR方法扩增后记录Ct值，构建MS2标准曲线；同时将140 μL超纯水依照1.3.2节提取RNA，作为阴性对照。

参照ISO 15216–2: 2019^[22]标准方法计算回收率，具体计算见公式（1）：

R(%)=10⁽^Ct^–^Cq^)/^a×100×B (1)式（1）中，Ct为样本中MS2的值，Cq为标准曲线上MS2 RNA提取原液的值，a为MS2标准曲线的斜率，B为样本稀释倍数。

同时，参照ISO 15216–2: 2019^[22]标准方法中的病毒回收率计算方法评价病毒提取效率，当病毒回收率≥1%时，表明核酸提取纯度和质量满足要求，检测有效^[22]。

1.3.5 扩增抑制指数计算方法及评价

参照ISO 15216–2: 2019^[22]标准方法，通过外加扩增控制RNA，计算扩增抑制指数。扩增抑制指数=（样品RNA+外加扩增控制RNA）Ct值－（无RNase超纯水+外加扩增控制RNA）Ct值。当扩增抑制指数＜2.00，扩增结果有效。

1.3.6 方法灵敏度试验

将制备的NoV质控品和HAV质控品分别用人工污染500 mL样本进行灵敏度试验分析。通过NoV质控品原液浓度，制备NoV GⅠ型浓度分别为600拷贝/500 mL、300拷贝/500 mL、150拷贝/500 mL；制备NoV GⅡ型浓度分别为220拷贝/500 mL、22拷贝/500 mL、2.2拷贝/500 mL。通过HAV质控品原液浓度，制备HAV浓度分别为1100拷贝/500 mL、550拷贝/500 mL、275拷贝/500 mL。同时，在所有人工污染样本中各添加10 μL过程控制病毒MS2，采用超纯水作为阴性对照，按照1.3.1节富集病毒和1.3.2节提取病毒RNA，再采用RT-qPCR方法进行检测，每个浓度样本进行3次平行试验，分别分析样本中NoV和HAV的检测灵敏度。

1.3.7 方法重复性试验

将人工污染不同浓度的样本按照1.3.1节和1.3.2节进行试验操作，采用RT-qPCR方法进行检测，每个浓度样本进行10次平行试验，根据检测Ct值分别计算Ct平均值和相对标准偏差，通过相对标准偏差验证样本中NoV和HAV检测方法的重复性。

2 结果与分析

2.1 过程控制病毒MS2 RT-qPCR标准曲线的制备

采用超纯水对提取的MS2 RNA原液进行10×梯度稀释，经RT-qPCR方法扩增后构建过程控制病毒MS2标准曲线，结果如图1所示，其中标准曲线方程Y=-3.3703X+22.393，R²=0.9994。满足ISO 15216–2: 2019^[22]标准中R²≥0.98、斜率在–3.10～–3.60范围之间的标准曲线创建要求。

2.2 过程控制病毒MS2检测回收率及抑制指数

将添加过程控制病毒MS2的20份样本按照本研究方法进行检测，根据过程控制病毒MS2检测Ct值、回收率以及本反应抑制指数来判断RT-qPCR的有效性，从而研究本方法的适用性。如表1所示，20份样本中过程控制病毒MS2均被检出，平均Ct值为30.906±0.331；平均回收率为（28.19±6.19）%，可知病毒检测回收率超过其良好水平的要求（＞10%）^[26]，并满足过程控制病毒MS2回收率有效性的评价标准，验证了本研究中采用的病毒富集效果较好。同时，从检测数据可知扩增抑制指数均＜2.00，试验结果有效。

2.3 灵敏度试验结果

2.3.1 NoV检测灵敏度试验结果

将已配制的不同浓度NoV质控品分别对样本进行人工污染，通过试验以确定NoV GⅠ型和GⅡ型的检测灵敏度，检测结果如图2所示。当NoV GⅠ型浓度为300拷贝/500 mL时，样本中NoV GⅠ型检测Ct值为38.240±0.44，而当NoV GⅠ型浓度为150拷贝/500 mL时，3次平行试验的检测结果均无典型性扩增曲线，确定NoV GⅠ型检测灵敏度为300拷贝/500 mL；当NoV GⅡ型浓度为22拷贝/500 mL时，样本中NoV GⅡ型检测Ct值为37.167±0.65，而当NoV GⅡ型浓度为2.2拷贝/500 mL时，3次平行试验的检测结果均无典型性扩增曲线，确定NoV GⅡ型检测灵敏度为22拷贝/500 mL。

2.3.2 HAV检测灵敏度

将浓度分别为1100拷贝/500 mL、550拷贝/500 mL和275拷贝/500 mL的HAV质控品对样本进行人工污染，以确定HAV的检测灵敏度。当HAV浓度为1100拷贝/500 mL时，样本中HAV检测Ct值为36.055±0.46；当HAV浓度为550拷贝/500 mL时，样本中HAV检测Ct值为37.927±0.98；而当HAV浓度为275拷贝/500 mL时，3次平行试验中有1次检测结果无典型性扩增曲线出现，其他检测结果Ct值为41.035±1.14，但该浓度Ct值较大，不符合标准中阳性结果的判定标准^[22]。最终确定HAV检测灵敏度为550拷贝/500 mL，如图3所示。

2.4 重复性试验结果

以NoV GⅠ型、NoV GⅡ型和HAV最低检测浓度为研究基础，将人工模拟污染NoV和HAV的样本分别提取RNA后，采用RT-qPCR方法进行检测，每种病毒选取2个浓度，每个浓度样本分别进行10次平行试验，具体添加病毒浓度、检测Ct值和相对标准偏差见表2。结果显示，NoV和HAV的检测Ct值均＜40，相对标准偏差均＜2.00%，验证方法具有较好的重复性，能够得到稳定且可靠的检测结果。

3 讨论与结论

目前，水体中病毒富集方法较多，主要包括膜吸附—洗脱法^[27]、絮凝沉淀法^[28]、超滤法^[29]、超速离心法^[30]、免疫磁珠分离法^[31]等，通过对病毒的筛分、吸附或沉淀达到富集的目的。然而，水体特征不同时各富集方法在病毒富集效果、回收率等方面表现出较大差异。本研究基于水体中NoV和HAV的国际及国内行业标准检测方法、文献报道病毒富集优化方法^[32-33]，采用混合纤维素膜过滤吸附结合超滤法建立了口岸滩涂养殖用水中NoV和HAV的病毒富集新方法。

本研究选取的混合纤维素膜为阴离子膜，膜表面带有负电荷，检测时需在样本中加入Mg²⁺阳离子后使病毒颗粒和其结合形成带正电荷的阳离子复合物，过滤后吸附在混合纤维素膜上，以达到病毒高效过滤吸附的目的，这与白靖宇^[34]筛选的高效富集水体中病毒的滤膜类型结果相一致。同时，GB 4789.42—2025《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》^[35]也推荐采用阴离子膜进行包装饮用水的NoV富集。针对病毒洗脱液，本研究充分考虑TGBE作为洗脱液的权威性和广泛性，继续沿用国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）/欧洲标准化委员会标准中推荐的TGBE洗脱液对病毒进行洗脱。超滤和PEG沉淀作为二次浓缩最常用的两种方法，被广泛地应用在病毒浓缩处理中^{[33, 36-37]}。倪云龙等^[32]将膜吸附—超滤法与膜吸附—PEG沉淀法进行了比较，纯净水中的病毒回收率分别为（19.80±12.19）%和（12.71±9.09）%，验证了膜吸附–超滤法的高效性，但无法体现其他水体中病毒富集效果。同时，也有研究表明PEG沉淀法会产生其他小分子物质，从而抑制PCR反应效果^[38]。因此，本研究建立混合纤维素膜—超滤法对口岸滩涂养殖用水中常见病毒进行富集浓缩，过程控制病毒MS2平均回收率为（28.19±6.19）%，回收效果良好，可达到高效富集NoV和HAV的效果。

白靖宇^[34]采用超滤法结合混合纤维素膜对自来水中HAV进行富集后，HAV的检测限为10²拷贝/ μL。本研究建立的病毒富集浓缩方法结合RT-qPCR方法检测口岸滩涂养殖用水中NOV和HAV时，确定NoV GⅠ型检测灵敏度为300拷贝/500 mL、NoV GⅡ型检测灵敏度为22拷贝/500 mL、HAV检测灵敏度为550拷贝/500 mL。因研究的水体基质不同，同时本病毒富集方法与白靖宇^[34]采用的病毒富集方法在富集浓缩顺序、试剂的使用上均存在差异，可能是造成灵敏度不同的主要原因。从研究结果可知本方法操作简便、效果良好、适用性强，无需大型仪器便可完成常见病毒的快速高效富集，解决了滩涂养殖用水中常见病毒因浓度过低而引起检测困难的问题，为风险预警评估和企业水环境自检自控，以及提高产品质量提供了有效手段，对人类健康、进出口企业和贸易的稳定发展具有积极作用。

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