齐欣 王龙祥 徐文英 薛伟锋 杨爱馥 褚莹倩 曲世超

齐 欣 ¹ 王龙祥 ¹ 徐文英 ¹ 薛 伟锋 ¹ 杨爱馥 ¹ 褚莹倩 ¹ 曲世超 ^{1 *}

摘 要 沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌，因此构建能够快速、便捷检测沙门氏菌的技术对保障食品质量安全和公共卫生健康意义重大。等温核酸扩增技术的出现及逐步优化，为沙门氏菌的高效、精准、便携检测提供了多样化选择，其应用前景也愈发广阔。本文概述了近年来国内外常见的用于沙门氏菌检测的等温核酸扩增技术，并探讨其未来发展趋势，为食品微生物现场快速检测技术的进一步研究和应用提供参考借鉴。

关键词 等温核酸扩增；沙门氏菌；快速检测

Research Progress on Isothermal Nucleic Acid Amplification Technology in the Rapid Detection of Salmonella

QI Xin¹ WANG Long-Xiang¹ XU Wen-Ying¹ XUE Wei-Feng¹

YANG Ai-Fu¹ CHU Ying-Qian¹ QU Shi-Chao^1*

Abstract Salmonella is an important foodborne pathogen, making the development of rapid and convenient detection technologies crucial for the ensuring food quality safety and public health. With the continuous emergence and gradual optimization of isothermal nucleic acid amplification technology, diverse options have become available for the efficient, accurate and portable detection of Salmonella, broadening its application prospects. This article reviews commonly isothermal nucleic acid amplification technology employed in recent years for the detection of Salmonella at home and abroad, and discusses future development trends. The aim is to provide a reference for further research and wider application of on-site rapid detection technologies for foodborne microorganisms.

Keywords Isothermal Amplification of Nucleic Acids (IANA); Salmonella; rapid detection

沙门氏菌（Salmonella）作为四大致病菌之一，对人类健康和经济发展造成了一定影响^[1-2]。据报道，全球每年因感染沙门氏菌而死亡的人数达15.5万^[3]。沙门氏菌等致病菌通常被其他背景微生物群所掩盖，不易于识别^[4]。细菌培养法作为沙门氏菌鉴定的金标准，虽检测结果可靠准确，但耗时长且操作复杂^[5-6]。因此，基于前沿生物技术对沙门氏菌进行快速精准检测，已成为当下开展现场即时检测的主要途径。

等温核酸扩增（Isothermal Amplification of Nucleic Acids，IANA）技术近年来发展迅猛，是一类基于恒温条件的新型核酸快速扩增方法^[7]。因其具备操作简便、检测周期短、无需昂贵仪器等特点，已在致病菌快速检测中展现优势^[8]。目前沙门氏菌检测时常见的等温核酸扩增技术主要包括环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）、滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）、重组酶聚合酶等温扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）、重组酶介导等温扩增（Recombinase Aided Amplification，RAA）、杂交链反应（Hybridization Chain Reaction，HCR）、催化发夹自组装（Catalyzed Hairpin Assembly，CHA）等。本文概述了近年来国内外基于等温核酸扩增技术检测沙门氏菌的研究情况，以期为沙门氏菌快速检测技术的发展及提高沙门氏菌现场即时检测能力提供借鉴。

1 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增（LAMP）技术自2000年首次发布后备受世界卫生组织、相关国家政府部门及研究学者的关注^[9]。该技术针对靶基因6～8个区域设计4～6条特异性引物，再利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下（60～65℃）进行孵育，60 min内即可实现靶序列10⁹～10¹⁰的扩增。LAMP的扩增产物包括凝胶电泳、荧光染料法、浊度法、侧流层析试纸等多种检测方式。近年来，随着生物技术的迭代发展，LAMP与成簇规则间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）、生物芯片等技术相结合，更为LAMP方法的快速化、可视化及精准化分析提供了新思路。Hu等^[10]以鼠伤寒沙门氏菌的STM3845基因为靶点，建立了蛋制品中高特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的新型LAMP方法，65℃反应30 min即可完成检测，并通过200份人工污染的蛋及蛋制品样本验证了该方法与FDA、BMA培养法无显著性差异，同时在纯培养物测试中该方法灵敏度较实时荧光PCR方法高100倍，检测限达0.56 log CFU/mL，可有效区分其他常见沙门氏菌。Zhang等^[11]将LAMP和CRISPR-Cas12a相结合，建立了鼠伤寒沙门氏菌LAMP/CRISPR-Cas12a 冻干单管检测体系，并应用自主研发的便携式核酸提取装置和智能手机检测App，搭建了“核酸提取—扩增—检测”一体化平台，1 h内即可快速完成样本核酸提取到结果输出，采用人工污染鼠伤寒沙门氏菌的鸡肉和白菜样本进行检测时，方法检测灵敏度达10² CFU/mL，在现场快速检测中具有巨大的应用潜力。

2 滚环扩增技术

滚环扩增（RCA）技术是1995年研发的一种等温核酸扩增技术，该技术在恒温条件下，利用Bst DNA聚合酶的活性促使短寡核苷酸引物对环状DNA模板进行滚环式复制。刘健慧等^[12]将G-四链体互补序列嵌入RCA扩增所需的哑铃环状模板上以增强荧光信号，再联合PCR方法进行双重扩增反应，完成了沙门氏菌快速定量检测，检测灵敏度为17 fg/μL，在人工污染的牛奶样本中沙门氏菌检出限为4.28 CFU/mL。但笔者发现G-四链体荧光信号强度容易受到缓冲液中阳离子浓度的影响，导致方法在检测复杂样本和低浓度样本时存在一定局限性。RCA技术引物单一、操作简单，但也存在一定缺点，该技术在扩增反应中易因强烈背景信号的产生而影响检测结果。

孟兆祥等^[13]于2013年研发的跨越式滚环扩增（Saltatory Rolling Circle Amplification，SRCA）技术，基于具有多重活性和热稳定性的Bst DNA聚合酶及一对引物即可实现非闭合环形DNA模板的高效扩增。与RCA技术相比，SRCA技术无需模板环理和琐式探针，操作简化且成本降低^[14]。孙艳玉等^[15]利用比色法中常见的甲酚红和羟基萘酚两种染料开展其最佳浓度比例的研究，并针对沙门氏菌的invA基因设计SRCA引物组，建立了SRCA双染料比色法“一管式”检测食品中沙门氏菌，方法检测灵敏度达6.8 CFU/mL，比PCR方法灵敏度高100倍，在人工污染的牛奶样本中，方法检出限为9.5 CFU/mL，比PCR 方法低100 倍，SRCA双染料比色法不仅拓宽了样本颜色变化范围，还提高了样本间色相对比度。

3 重组酶聚合酶等温扩增技术

重组酶聚合酶等温扩增（RPA）技术于2006年首次发布^[16]。该技术是在恒温条件下，重组酶蛋白（来自T4噬菌体）与特异性引物相结合形成重组酶—引物复合物，复合物通过识别模板DNA的同源序列发生链置换反应后形成D—环形结构，被置换的单链DNA与单链结合蛋白相结合以稳定其结构，最后在DNA聚合酶的作用下实现快速扩增^[17-18]。该方法常与其他可视化即时检测手段相结合，能在更短时间（＜30 min）内、更低恒温（37～42℃）下将目的基因扩增到可检测水平，在病原菌的快速检测中发挥重要作用^[19-20]。但目前RPA技术所用试剂价格相对较高，虽只需设计两条引物，但缺乏设计专用软件^[21]。Zhan等^[22]以沙门氏菌属（Salmonella spp.）、肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的特异性基因invA、STM4495和Sen1504-1505为靶标，建立了多重RPA结合测流层析试纸条可视化方法同时检测食品中上述三种病原菌，38℃条件下25 min完成反应，检测灵敏度分别为2.8×10⁵ CFU/mL、5.9×10⁷ CFU/mL和7.6×10³ CFU/mL，同时对方法的反应体积进行优化，较常用RPA反应体系（50 μL）减少一半， 降低RPA反应成本的同时，更有助于扩展该技术的使用范围。

4 重组酶介导等温扩增技术

重组酶介导等温扩增（RAA）技术为2010年开发的一种拥有自主知识产权的国产等温核酸扩增技术，其原理与RPA相似，区别为两者重组酶来源不同，RAA反应体系中重组酶来源于细菌或真菌，比RPA所用重组酶活性高且更易获取^[23-24]。但RAA技术因所需引物和探针长度较长而增加设计难度，导致其在致病菌检测时通量较低。张雅薇等^[25]以沙门氏菌的fimY基因为靶标设计引物及探针，分别建立了RAA结合荧光检测方法和RAA结合侧向流试纸条检测方法，通过研究发现两种方法均能在39℃条件下30～40 min完成检测，侧向流试纸条法较荧光检测法灵敏度高十倍，可达1 pg/μL，但荧光检测法的检测时间较侧向流试纸条法短10 min，在实际应用中可根据需求进行方法的选择。Zhou等^[26]采用双链特异性DNA酶（dsDNase）替代CRISPR/Cas以简化检测所需的环境条件，通过设计筛选出RAA引物和dsDNase探针组合，研发了一管式RAA-dsDNase新型沙门氏菌检测技术，分别以紫外和侧向流试纸条的方式观察结果，沙门氏菌基因组DNA的检测灵敏度分别为10¹ CFU/μL（检测时间50 min）和10² CFU/μL（检测时间60 min），方法能够有效识别17种沙门氏菌血清型，可靠检测鸡肉和牛奶样本中的沙门氏菌，不仅简便灵敏、降低成本，同时还可弥补CRISPR技术中sgRNA 设计时PAM 位点限制的缺陷。

5 杂交链式反应技术

杂交链反应（HCR）技术于2004年由Dirks和Pierce ^[27]首次提出，利用两条具有稳定发夹结构的探针，在单链目标核酸片段的触发下不断进行杂交及链置换反应，最终实现目标信号的指数级扩大^[28-29]。Zhu等^[30]将HCR技术与LAMP技术相结合，首先以LAMP扩增产物设计特定序列后进行结合反应，结合产物经链霉亲和素磁珠捕获后在其表面启动 HCR 反应，再通过微孔板读取测量荧光信号，最终完成鼠伤寒沙门氏菌的快速检测，整个检测可在3 h之内完成，且无需预增菌富集步骤，在苹果汁中检测鼠伤寒沙门氏菌的检出限为10²～10³ CFU/mL，较单独使用LAMP技术时检测灵敏度提高了10～100倍。Gu等^[31]开发了一种基于CRISPR/Cas12a 系统与HCR相结合的磁弛豫开关生物传感器用于鼠伤寒沙门氏菌的活菌检测，检出限为 77 CFU/mL，在动物源性食品中检测鼠伤寒沙门氏菌的准确性与qPCR相当，同时建立的方法具有显著通用性，未来可通过修改目标序列检测识别各种目标致病菌。HCR技术最大的特点是反应无需酶的参与，接近室温的条件即可完成核酸的扩增反应，大大降低试验成本并简化操作流程，但因大量交替共聚物的存在极易产生假阳性结果。为提高精准度，Wang等^[32]将HCR与两种纳米材料相结合用于目标核酸的荧光检测，显著提高了HCR技术测试结果的准确性。

6 催化发夹自组装技术

催化发夹自组装（CHA）是2008年首次由Yin等人^[33]提出的一种无酶等温扩增技术。该技术根据茎环结构具有动力阻碍作用，设计两个序列互补的发夹结构探针，仅在目标序列存在的情况下才触发发夹结构打开并与其发生杂交，释放出的目标核酸可继续进行下一循环反应，从而产生电化学信号^[34-35]。该技术适合与其他技术结合以提高检测的灵敏度和便捷性。Xiao等^[36]利用耦合多价适配体竞争性分析和CHA技术，并结合研发的智能手机荧光/比色双模式适配体传感器，1～2 h即可完成沙门氏菌的现场快速检测，比色法检测限28 CFU/mL，荧光法检测限10 CFU/mL，这种双重放大方法不仅能增强检测信号，还可确保沙门氏菌定量检测结果的高准确性，应用该方法在鱼肉蛋奶样本中检测沙门氏菌时均表现出较高特异性和普遍适用性。此外，该方法单样本检测成本低，较qPCR方法具有显著的成本优势。由于CHA技术中发夹结构的稳定性和特异性直接影响检测结果灵敏度，因此为避免因大量交替聚合物存在产生假阳性结果，探针设计时对精准度的要求较高。

7 结语

伴随食品行业多元化的飞速发展及现代检测技术的迭代升级，沙门氏菌作为食源性致病菌重点监控对象，迫切需要研发快速、便捷、精准的检测方法，以便更好地强化产品安全监管工作和提升公共卫生应急能力。等温核酸扩增技术凭借操作简捷、成本低廉且适合现场即时检测等优势为沙门氏菌高效检测提供了新思路，被视为一种具有实用价值、可替代PCR技术的新型扩增方法。除本文中介绍的等温技术外，多酶恒温快速扩增（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification，MIRA）技术是在RPA技术基础上，我国自主研发的一种新兴等温核酸扩增技术，已在单核细胞增生李斯特氏菌、产气荚膜梭菌等致病菌即时检测中发挥作用^[37-38]。

目前，行业标准SN/T 5516.1—2023《出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增（RAA）检测方法 第1部分：沙门氏菌》和地方标准DB37/T 2794—2016《沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温扩增检测技术》中已经将较为成熟的等温技术标准化，因此其他等温技术的标准化进程将是实现我国食品中沙门氏菌快速检测应用需求的关键，通过检测方法的一致性以提升检测结果的权威性和公信力。此外，采用等温核酸扩增技术开展沙门氏菌检测时，复杂食品基质中可能存在对沙门氏菌检测造成影响的抑制物或干扰因素，样本前处理方法的便捷化和稳定性也亟待提升。Zendrini等^[39]开发了鸡肉中沙门氏菌LAMP快速检测方法，检测结果可低至10 CFU/g且无需增菌步骤，实现一日内出具禽肉中沙门氏菌检测结果。因此，其他基质的前处理方法优化研究也将是今后工作的重点。未来随着标准化的发展、前处理方法的便捷、等温扩增体系的优化、智能便携设备的研发以及与纳米材料、人工智能等前沿技术的深度融合，相信等温核酸扩增技术将实现更高效、更精准的沙门氏菌低成本现场即时检测。

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基金项目：海关总署科研项目（2025HK170）

第一作者：齐欣（1984—），女，汉族，河北昌黎人，硕士，高级工程师，主要从事微生物检测相关工作，E-mail: 110697186@qq.com

通信作者：曲世超（1985—），男，汉族，辽宁铁岭人，硕士，高级工程师，主要从事微生物检测相关工作，E-mail: qushichao09@163.com

1.大连海关技术中心 大连 116000

1.Technology Center of Dalian Customs District, Dalian 116000