王新国 黄 艳 林惠娇 吴福中 洪 菁 郑冠津 胡加谊 江志海

王新国 ^1,2 黄 艳 ^1,2 林惠娇 ³ 吴福中 ⁴ 洪 菁 ² 郑冠津 ² 胡加谊 ^1,2 江志海 ^1,2

摘 要 本研究比较了4对通用引物在白蚁COⅠ基因中的扩增效率，在此基础上对Folmer引物进行改造，设计出了一对新的简并引物，并成功从14种白蚁中扩增出13种COⅠ基因片段。另外，本研究进一步探讨了Folmer引物及此种设计方法在白蚁和其他昆虫DNA条形码技术中的应用前景，并分析了该方法在进境昆虫检疫鉴定工作中的实际意义，为快速、准确鉴定白蚁提供了技术参考。

关键词 通用引物；Folmer引物；简并引物；白蚁；DNA条形码技术

Design of “Folmer Primer” Based Degenerate Primers and Its Application in Termite DNA Barcoding

WANG Xin-Guo^1,2 HUANG Yan^1,2 LIN Hui-Jiao³ WU Fu-Zhong⁴

HONG Jing² ZHENG Guan-Jin² HU Jia-Yi^1,2 JIANG Zhi-Hai^1,2

Abstract After comparing the amplification efficacy of 4 universal primers for the COⅠgene in termites, a pair of new degenerate primers was designed by modifying the “Folmer primers”, and partial COⅠgene sequences were successfully amplified from 14 of 16 termite species. The application of “Folmer primers” and this design method in termites and broader insect DNA barcoding, as well as their significance for quarantine identification of imported pests, was further discussed.

Keywords universal primer; Folmer primers; degenerate primers; termite; DNA barcoding technology

DNA条形码技术在昆虫鉴定中具有重要作用^[1]。该技术的难点之一是通用引物的设计，即设计一对扩增序列长度适中、扩增效率高、在不同昆虫间广泛通用、用以扩增线粒体DNA中的细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因（Cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）片段的引物。根据文献进行分析，目前用于昆虫DNA条形码技术的引物来源主要有三类：第一类来源于Simon等^[2-3]提出的动物类通用引物汇总，第二类来源于其他文献中已报道的同种或近缘物种的引物，第三类来源于引物设计软件如Oligo、Primer Premier、Primer Designer等^[4-6]。其中，第二类引物中大多是对Simon等^[2-3]研究报道中引物的参考或利用引物设计软件获取的。

Simon等^[2]于1993年首次汇总了动物线粒体（Mitochondrial DNA，mtDNA）上各个基因扩增的通用引物，针对COⅠ基因片段（图1）列举了配对性较好的5对，即1718和2191、1751和2329、1751和3014、2441和3014、2659和3014，其中列举的昆虫仅有蝇、蜜蜂和蝗虫3类。此外，Simon等^[3]于2006年报道了动物COⅠ通用引物汇总的升级版，验证过的昆虫类别包括按蚊、蚕、叶甲、锯谷盗、蜜蜂、蛇蛉、沫蝉、猎蝽、蝗虫、石蝇、虱、弹尾虫等12类，且除普通引物外增加了简并引物，使这些通用引物的使用范围更广。

图1 COⅠ基因通用引物示意图^[2]

Fig.1 Diagram of universal primers for COⅠgene^[2]

Folmer等^[7]在1994年比较了15类动物的线粒体上COⅠ基因序列的高度保守区域后，设计出了引物“LCO1490，HCO2198”，随后用该对引物成功扩增了11门80种无脊椎动物的COⅠ基因片段。因为此对引物具有广泛作用，被称为“万能引物”或“Folmer引物”^[8]。Folmer引物的序列如下：上游引物LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，25 nt；下游引物HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGA CCAAAAAATCA，26 nt。

Folmer引物在动物研究中具有强大的扩增能力，并在动物的分子鉴定及系统发育研究中被广泛引用。仅从我国相关数据库中查到的中文文献就已表明，该对引物已应用于包括浮游动物^[9]、根结线虫^[10]、长角跳虫^[11]、瘿蜂^[12]、蝉^[13]、粉蚧^[14]、夜蛾^[15]、蓟马^[16]、天牛^[17]和甲虫^[18]等多门类的动物分子鉴定和系统发育研究。在白蚁方面，丁俊杰^[19]、喻敏^[20]和邓锋^[21]分别用该对引物扩增了乳白蚁、土白蚁和散白蚁，取得了较好效果。但其他一些进行白蚁分子鉴定的研究^[22-23]却并没有再次使用此对引物，经本文作者与相关研究人员通信交流，原因主要是认为该对引物对多种乳白蚁扩增效果不佳。

由于Folmer引物已被证明在11个门的动物中具有通用性，其扩增序列长度710 bp左右，扩增的位置位于mtDNA上的COⅠ基因之中，满足DNA条形码技术的要求；另外，其扩增出来的长度可使用传统测序技术一次反应即可测序通过，测序效率高且成本低，使其成为DNA条形码技术的较好选择。本研究在比较了4种通用引物对白蚁COⅠ基因片段的扩增效果后，基于Folmer引物设计出一对新的简并引物，以期解决白蚁DNA条形码技术中的COⅠ基因扩增难题。另外，研究进一步探讨了此种通用引物的改造方法在其他昆虫类群的DNA条形码技术中的应用前景。

1 材料和方法

1.1 样品

供试白蚁样品共14种，来源于国内采集和口岸截获。样品详细信息及部分扩增的COⅠ基因片段的NCBI数据库登录号见表1。

1.2 引物

在乳白蚁COⅠ扩增中共测试4对引物，引物对及相关参数见表2。其中，引物对P1来源于Folmer等^[7]，引物对P2参考钱路^[23]的研究，引物对P3与P4参考Simon等^[2]的研究。

1.3 Folmer引物设计的序列来源

在前期实验中，用Folmer引物扩增白蚁的mt DNA的COⅠ片段；对成功扩增出来的序列，保留两边的引物部分，经校正拼接，形成一条完整的序列；将此序列于NCBI中进行Blast比对，选择数据库中与比对序列Query Cover项数值大于99%的序列，下载比对对应的部分序列，每种白蚁下载1～2条。如果下载的序列太少，可尝试用测序得到的上下游序列在NCBI中比对，分别获取含有上下游引物对应部分的序列。

1.4 简并引物的设计

将1.3中获得的序列，于Lasergene MegAlign软件中进行聚类分析，找出引物对应部分的变异碱基，针对涉及较多序列的主要变异位点，找出可同时兼容2种碱基的简并碱基，然后应用此简并碱基替换Folmer引物中的原碱基，从而设计出改良的简并引物。

1.5 试剂

AG SteadyPure通用型基因DNA提取试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；AG 2×Pro Taq预混液，无RNA酶的水；琼脂糖，1×TAE电泳缓冲液，聚溴化乙锭染料。

1.6 核酸提取和PCR扩增

按照AG SteadyPure通用型基因DNA提取试剂盒使用说明书提取白蚁样品的DNA。PCR扩增反应体系（30 μL）：2×预混液15 μL，上下游引物各1 μL，蒸馏水13 μL，模板1 μL；反应程序：预变性94℃ 30 s；98℃ 10 s，X℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 5 min，然后4℃保持。扩增产物于-20℃保存，其中X为表2中引物的退火温度。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。产物测序委托生工生物（上海）股份有限公司进行。

2 结果与分析

2.1 4对引物对白蚁样品的扩增效果比较

引物对P1的扩增结果如图2所示。

1～14为样品; M为DNA Marker

图2 引物P1对14种白蚁样品的扩增结果

Fig.2 The PCR results of 14 species of termites by primers P1

引物对P1扩增效果并不理想，14个样品仅扩增出其中3个（图2）。考虑到引物P1在动物界DNA条形码技术中的广泛通用性，扩增序列长度710 bp对于DNA条形码技术的适宜性，扩增序列测序的便利性，以及在白蚁中扩增的实际报道，本次研究通过对已扩增的序列在NCBI中进行比对，获取到数据库中的相应长度的白蚁类同源序列28条，并进行了进一步分析。

1～14为样品; M为DNA Marker

图3 引物P2对12种白蚁样品的扩增结果

Fig.3 The PCR results of 12 species of termites by primers P2

引物对P2扩增效果较好，12个样品（有两个样品污染未扩增，下同）扩增成功9个，仅3、5、6号样品扩增失败（图3）。扩增出来的序列长度为1791 bp，完全满足DNA条形码技术的要求。但由于目前测序公司测序方法中一次反应即可测序通过的序列长度约为800 bp，大于800 bp后需要增加测序次数和费用；另外，从测序结果来看，较长的序列测序效果往往较差，常常仅有一半左右的样品能够获得峰形完好、上下游匹配度极高的原始数据。

1～14为样品; M为DNA Marker

图4 引物P3对12种白蚁样品的扩增结果

Fig.4 The PCR results of 12 species of termites by primers P3

从图4可以看出，引物对P3扩增效果较好，12种样品扩增出8种，仅1、4、9、10号样品未扩增出来，且测序易于得到完整的序列。引物P3扩增的有效序列长度仅为578 bp左右，勉强满足昆虫DNA条形码技术的需求。

1～14为样品; M为DNA Marker

图5 引物P4对12种白蚁样品的扩增结果

Fig.5 The PCR results of 12 species of termites by primers P4

从图5可以看出，引物对P4扩增效果最好，12个样品都扩增出来，测序也得到了完整的序列。但由于其所扩增的序列仅有473 bp，经校对后可进行Blast比对的有效序列仅420 bp左右，无法满足昆虫DNA条形码技术对序列长度的要求。

2.2 数据库中下载序列比对结果

从NCBI数据库中共下载对应的白蚁COⅠ序列28条，包括乳白蚁15种，即短刀乳白蚁、阿曼乳白蚁、红褐乳白蚁（Coptermes brunneus）、德氏乳白蚁（C. dreghorni）、端明乳白蚁（C. elisae）、大唇乳白蚁（C. frenchi）、格斯特乳白蚁、印巴乳白蚁（C. heimi）、卡肖乳白蚁（C. kalshoveni）、米氏乳白蚁（C. michaelseni）、塞庞乳白蚁（C. sepangensis）、南亚乳白蚁（C. travians）、短截乳白蚁（C. truncatus）、台湾乳白蚁、乳色乳白蚁（C. lacteus）；土白蚁6种，即黑翅土白蚁、海南土白蚁（Odontotermes hainanensis）、爪哇土白蚁（O. javanicus）、长颚土白蚁（O. longignathus）、马氏土白蚁（O. mathuri）、胖土白蚁（O. obesus）；散白蚁7种，即尖唇散白蚁（Reticulitermes aculilabialis）、黑胸散白蚁（R. chinensis）、北美散白蚁（R. flavips）、关门散白蚁（R. kanmonensis）、圆唇散白蚁（R. labralis）、尼氏散白蚁（R. nelsonae）、黄胸散白蚁。将28条序列用Lasergene MegAlign聚类分析，采用软件中的Clustal V Method处理，序列前后端比对结果如图6所示。

通过比对可以看出，上游引物对应的区域中（1—25碱基位点），28种白蚁出现了5个变异位点，其中有3个主要变异位点（蓝色方块），分别对应于上游引物的第8位、第11位和17位（图6中上游引物的前2个碱基GG没有出现）；下游引物有4个变异位点，其中有3个主要变异位点（绿色方块），分别对应于下游引物互补链5'端的第9位、第15位和第18位。基于引物3'端配合度更重要的设计原则，本研究分别在上游引物5'端的第11位和下游引物的第18位引入简并碱基Y（Y = T/C）和R（R = /G）。另外，对比发现，除了台湾乳白蚁和黑胸散白蚁的上游引物互补序列的第18位为T外，其余序列全部为C，因此这个位置改为C碱基的互补碱基G；设计出Folmer引物的简并引物如下：

上游引物1490 wxg1，5'-GGTCAACTAAYCAC AAGGACATTGG，25nt

下游引物2198 wxg1，5'-TAAACTTCAGGGTG TCCRAAGAATCA，26nt

2.3 扩增结果

重新设计的简并引物对白蚁COⅠ基因片段的扩增效率大大增强（图7），14个样品扩增出13个，仅11号样品未扩增出来。将扩增成功的13个白蚁样品进行PCR产物双向测序，序列处理后提交至NCBI，登录号见表1。

1～14为样品; M为DNA Marker

图7 新简并引物扩增14个白蚁样品的核酸电泳图谱

Fig.7 The PCR results of 14 species of termites by new degenerate primers

3 结论与讨论

3.1 昆虫分子鉴定中引物的设计

从PCR技术诞生之后，引物设计就成为扩增成功的关键一步。引物设计涉及的因素很多，比如引物长度、引物的Tm值、上下游引物Tm值之差、引物本身的二级结构、引物上的重复序列、GC夹、起始碱基与阅读框的关系等^[24-26]。按照引物扩增的范围来看，PCR引物可分为特异性引物和通用引物。特异性引物往往要求扩增的种类最好是唯一种类，多用于特定微生物的检测之中，在昆虫分子鉴定中仅有少量应用^[27-29]，特异性引物的设计比较容易，而通用引物的设计则相对困难。因为设计一对好的通用引物，不仅要满足上文中对一般引物的种种条件，还要进行海量的生物种类比对和验证，这也是目前昆虫COⅠ通用引物方面的研究文献较少的原因之一。从某种程度上讲，昆虫DNA条形码技术的最理想状态即为仅用一对通用引物来扩增数以百万计的昆虫，从而最终建立一个序列长度一致且同源的基因序列数据库。从这个角度讲，通用引物并不需要数量多，反而应少而精。然而，与普通引物及特异性引物相比，面对种类数量超过百万之多的昆虫，能满足其需求的通用引物比较罕见。

3.2 通用引物的局限性

昆虫的DNA条形码技术虽已提出多年，但实际应用中常会遇到一些困难，其中较常见的就是通用引物的选择。Simon等^[2-3]于1994年和2006年两次提供了一些可用于昆虫mtDNA上COⅠ基因片段的通用引物，在前期对昆虫的分子鉴定起到巨大的指导作用。但随着昆虫分子鉴定的普及，面对数以百万计的昆虫种类，这些通用引物要么对一些昆虫类群效果不佳，要么无法满足分子鉴定对序列长度的要求，已不能适应昆虫DNA条形码技术快速发展的需要。

3.3 Folmer引物的通用性和局限性

Folmer引物的出现，以其在动物界广泛的通用性、与动物DNA条形码技术的高度匹配性引起了多方面的研究兴趣。基于动物界COⅠ基因高度的变异性，Folmer引物的通用性也有一定局限。有学者专门研究了Folmer引物，从NCBI数据库中检索出与这对引物扩增出的基因片段对应的动物类线粒体上COⅠ片段共750条，然后通过对这些片段的比对共找到了130843个变异碱基^[8]。分析发现，上游引物（LCO1490）分别在目、科、属中的最大差异分别为5 bp、6 bp、1 bp；下游引物（HCO2198）在科和属之间最大差异分别为5 bp和2 bp。这些研究一方面表明Folmer引物对动物COⅠ具有广泛的适用性，另一方面也表明其在不同类群之间对应基因上存在明显差异。

3.4 通用引物改造的可能性

在DNA条形码技术应用于进境动植物检疫的昆虫分子鉴定中，扩增失败是最大的障碍。可能导致基因片段扩增失败的因素很多，比如核酸提纯质量和浓度、退火温度、延伸时间、试剂污染等，鉴定人员往往需要花费更多时间进行调试，而容易忽视对引物与模板匹配度的关注。事实上，通用引物与模板的匹配度的强弱，对扩增成功与否将起到更重要的作用。因此，如果能通过NCBI数据库中近似物种的COⅠ序列与所用引物的匹配度进行比较，并采用类似上述方法对已有引物进行改造，设计出兼容性、匹配性更好的普通引物或简并引物，那么未来对于昆虫的分子鉴定将会更加方便快捷，检验检疫周期也会大大缩短。

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基金项目：广东省口岸安全智能化检测重点实验室项目（2023B1212010011）；海关总署科研项目（2019HK37）

第一作者：王新国（1970—），男，汉族，陕西西安人，博士，高级农艺师，主要从事昆虫检疫鉴定相关工作，E-mail: wangxin- guo99@163.com

1. 黄埔海关/广东省口岸安全智能化检测重点实验室 广州 510700

2. 黄埔海关技术中心 广州 510700

3. 琼台师范学院理学院 海口 571199

4. 深圳城市职业学院 深圳 518116

1. Huangpu Customs District/Guangdong Provincial Key Laboratory of Intelligent Port Security Inspection, Guangzhou 510700

2. Huangpu Customs Technology Center, Guangzhou 510700

3. College of Science, Qiongtai Normal University, Haikou 571199

4. Shenzhen City Polytechnic, Shenzhen 518116

中国口岸科学技术

表1 白蚁样品及所扩增的COⅠ基因片段登录号

Table 1 Species of the termites and the NCBI accession number of the COⅠgene partials

表2 实验所用的4对引物及相关参数

Table 2 4 pairs of primers used in the experiment

图6 NCBI数据库中下载的28种白蚁的COⅠ序列聚类结果

Fig.6 Alignment of COⅠgene partials of 28 species of termites downloaded from NCBI database