徐淼锋 张丽杰 黎财慧 王 准 蒋晓霞 刘若思 林 伟

徐淼锋 ¹ 张丽杰 ² 黎财慧 ¹ 王 准 ³ 蒋晓霞 ¹ 刘若思 ² 林 伟 ^{1 *}

摘 要 为防止外来有害生物传入，本研究对北京海关所属北京邮局海关从墨西哥进境快件中截获的“异宠”活体蚂蚁进行了检疫鉴定。通过体视显微镜详细观察其关键形态特征，确认其属于芭切叶蚁属（Atta spp.）物种。另外，本研究进一步采用DNA条形码技术，利用通用引物LCO1490/HCO2198对线粒体COⅠ基因进行扩增与测序。将所获序列在GenBank和BOLD数据库中进行比对分析，结果显示与墨西哥芭切叶蚁（Atta mexicana）的序列相似性均高达99%以上。综合形态学属级鉴定与分子生物学种级鉴定结果，最终确认该截获样本为拉丁美洲地区重要的农业害虫——墨西哥芭切叶蚁（A. mexicana）。本研究通过形态特征及DNA条形码鉴定技术，实现了对墨西哥芭切叶蚁的准确鉴定，为口岸外来有害生物的精准检疫鉴定提供了可靠的技术依据。

关键词 墨西哥芭切叶蚁；形态鉴定；DNA条形码；COⅠ基因；“异宠”

Identification of Atta mexicana Using Morphology and DNA Barcoding

XU Miao-Feng¹ ZHANG Li-Jie² LI Cai-Hui¹ WANG Zhun³

JIANG Xiao-Xia¹ LIU Ruo-Si² LIN Wei^1*

Abstract To prevent the introduction of invasive alien species, this study conducted a quarantine identification of live exotic pet ants intercepted by Beijing Post Office Customs House from an express shipment from Mexico. Key morphological characteristics were examined using a microscope, confirming that the specimens belong to the leaf-cutting ant genus Atta. DNA barcoding was further employed to amplify and sequence the mitochondrial COⅠgene using universal primers LCO1490/HCO2198. Sequence comparison and analysis in the GenBank and BOLD databases revealed a high similarity of over 99% with Atta mexicana. By integrating genus-level morphological identification and species-level molecular evidence, the intercepted samples were conclusively identified as A. mexicana, a significant agricultural pest in Latin America. The integrated application of morphological and molecular data in this study enabled the accurate identification of A. mexicana, providing a reliable technical basis for precise quarantine identification of alien pests at ports of entry.

Keywords Atta mexicana; morphological identification; DNA barcoding; COⅠgene; exotic pet

基金项目：海关总署科研项目（2023HK042，2023HK051，2024HK299，2024HK046）

第一作者：徐淼锋（1980—），男，汉族，广东梅州人，硕士，正高级农艺师，主要从事植物检疫相关工作，E-mail: xumiaopheng@sohu.com

通信作者：林伟（1985—），男，汉族，广西北海人，硕士，高级农艺师，主要从事植物检疫相关工作，E-mail: lw0525@163.com

1. 拱北海关技术中心 珠海 519001

2. 中国海关科学技术研究中心 北京 100026

3. 长春海关技术中心 长春 130062

1. Technical Center of Gongbei Customs District, Zhuhai 519001

2. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026

3. Technical Center of Changchun Customs District, Changchun 130062

墨西哥芭切叶蚁Atta mexicana （Smith，1858），隶属膜翅目（Hymenoptera）蚁科（Formicidae）切叶蚁亚科（Myrmicinae）芭切叶蚁属（Atta spp.），是拉丁美洲地区重要的农业害虫，也是近年来兴起饲养的一种“异宠”蚂蚁。该蚁是典型的社会性昆虫，巢群庞大，工蚁具有明显的多型现象。其最显著的生活习性为工蚁切割新鲜植物叶片用以培植真菌菌圃，作为蚁群的食物来源^[1-2]。该蚁为多食性昆虫，易对农林业生产造成严重危害，可导致作物减产、林木损毁，造成巨大的经济损失^[2]。该蚁原产于墨西哥及美国西南部干旱地区^[3]，近年来常被作为“异宠”进行非法跨境交易。本研究综合分析形态特征与COⅠ基因序列数据，对截获的活体蚂蚁进行鉴定，旨在为口岸检疫鉴定提供快速、准确的技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

样品为2025年8月北京海关所属北京邮局海关从墨西哥进境快件中所截获，该申报名称为“玩具模型”的快件中有活体蚂蚁10只，含蚁后2只和工蚁8只。

1.2 实验方法

1.2.1 实验试剂及仪器

体视显微镜（Stemi 508，蔡司科技（苏州）有限公司）；梯度PCR仪（Biometra TRIO 48，耶拿分析仪器（北京）有限公司）；电泳仪（Bio-rad PowerPac Universal伯乐生命医学产品（上海）有限公司）；多功能凝聚成像系统（ChemiDoc Go，伯乐生命医学产品（上海）有限公司）；血液及组织核酸提取试剂盒（DNeasy Blood & Tissue Kit 50, 凯杰 Qiagen）；DNA聚合预混液（ApexHF CL PCR Master Mix，湖南艾科瑞生物工程有限公司）。

1.2.2 形态鉴定

形态鉴定采用体视显微镜进行形态特征观察；样本采用佳能EOS R5 MarkⅡ搭配佳能MP-E 65 mm镜头拍摄多张图片；所得图片采用Helicon Focus 8.3.6进行叠加合成处理；测量指标包括体长、头宽、上颚齿数等关键鉴别特征；分类术语主要参考《中国蚂蚁》^[4]和蚂蚁维基（AntWiki）数据库^[5]。

1.2.3 分子鉴定

（1）DNA提取、PCR扩增及测序。用手术剪刀切取1头工蚁（编号为Qyy005-1）和1头蚁后（编号为Qyy005-2）的中、后足肌肉组织进行基因组DNA提取。提取方法参照核酸提取试剂盒说明书进行。PCR扩增引物采用线粒体COⅠ基因通用引物LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'和 HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'^[6]。反应体系（30 μL）：2×ApexHF CL PCR Master Mix 15 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各0.6 μL，模板DNA 2 μL，补足ddH₂O至30 μL。将配好的反应体系放置于梯度PCR仪中进行目的片段扩增，扩增程序如下：反应条件：94℃ 预变性3 min；98℃变性10 s，45℃ 退火30 s，68℃延伸30 s，5个循环； 98℃变性10 s，50℃退火30 s，68℃ 延伸30 s，35个循环；68℃延伸5 min^[7]。使用电泳仪将扩增产物置于1%的琼脂糖凝胶电泳检测分析，然后通过多功能凝胶成像系统观察是否有目标产物，将有目的片段的PCR产物送广州天一辉远基因科技有限公司进行纯化与双向测序。

（2）序列分析。使用MEGA 12软件^[8]对测序峰图进行检查、拼接，获得长度为658 bp的COⅠ基因序列。将最终序列在GenBank和BOLD Systems v5数据库中进行BLAST相似性比对分析。

（3）系统发育树构建。在GenBank和BOLD Systems v5数据库中下载墨西哥芭切叶蚁及该属内的近似种德州芭切叶蚁A.texana、六刺芭切叶蚁A.sexdens、哥伦比亚芭切叶蚁A.colombica和巨首芭切叶蚁A.cephalotes基因序列，另外以八刺顶切叶蚁Acromyrmex octospinosus为外群，使用MEGA 12 软件，采用邻接法（Neighbor-Joining Method，NJ）构建系统发育树，各分支置信度（Bootstrap）均进行1000次重复检验。

2 结果与分析

2.1 形态鉴定结果

本次截获的10只活体蚂蚁样本（2只蚁后、8只工蚁）中，所有工蚁经体视显微镜观察，其体型测量数据与形态特征均属于中小型工蚁，未发现可用于种级鉴定的大型工蚁。因此，形态学观察的重点在于确认其属级归属，并为后续分子鉴定提供佐证。截获蚂蚁的形态特征详细描述如下：

中型工蚁（图1A—图1C）：体长3.4 mm，头宽1.1 mm，体色呈黄褐色，覆盖稀疏黄色绒毛，体表密布网格纹。头部呈方形，不计上颚时宽约等于长，后头缘具浅凹；上颚长而扁平，具一尖锐的端齿和8个尖锐的基齿；唇基近平直；无单眼，复眼凸出，约位于头部前角至后角距离的三分之一处；头部具以下棘刺：复眼与唇基间的侧脊上一齿突，头部腹侧具小棘刺，后头缘两侧具2枚棘刺。胸部共具4对棘刺：前胸背板下角一对细小锐刺，侧上方一对粗大尖锐且直立的棘刺，中胸背板上一对更短细的棘刺，以及并胸腹节上一对长而尖锐、指向后方的棘刺。腹柄中部两侧具瘤突，端部背侧具短纵脊；后腹柄具2条模糊纵脊，两侧各有一凸起。足细长。

小型工蚁（图1D—图1F）：体长2.1 mm，头宽0.7 mm；形态与中型工蚁类似；额脊叶瓣无齿状突、侧脊及头部腹侧表面具小齿突；后头棘突均显著退化；前胸背板、中胸背板侧棘退化为齿突，并胸腹节棘刺小向后弯曲；体表绒毛较中型工蚁更为稀疏。

蚁后（图1G—图1I）：体长19.5 mm，头宽4.1 mm；体呈深栗棕色，足部偏红，上颚边缘黑色；体覆黄褐色茸毛；体表除上颚、唇基前缘等局部具光泽外，其余部分暗淡，呈颗粒皱褶状；头部宽大于长，复眼大，具单眼，头背部棘刺多退化；胸部粗壮，前胸背板仅存下侧小锐棘，并胸腹节具1对指向后方的小尖刺；腹柄宽短，两侧延伸出棘突；后腹柄具3～4对侧突；腹部长宽相近，足细弱。

综上所述，所截获工蚁的形态特征，如头后方具刺或齿，胸部具4对棘刺、腹柄结构等，均与芭切叶蚁属（Atta spp.）的鉴别特征相符。然而，仅凭中小型工蚁的形态特征无法直接鉴定到具体种类，凸显了蚂蚁鉴定在品级不全情况下传统形态鉴定的局限性，以及运用分子生物学技术进一步鉴定的必要性。


A—F: 工蚁; G—I: 蚁后; A, D, G: 头部; B, E, H: 侧面观: C, F, I: 背面观

图1 截获蚂蚁样本形态特征 （标尺为1 mm）

Fig.1  Morphological characteristics of the intercepted ant specimens (scale bar: 1 mm)

2.2 DNA条形码鉴定结果

PCR扩增获得长度约658 bp的清晰条带。测序后经拼接获得COⅠ基因序列。工蚁和蚁后样本所得序列完全一致，不存在碱基差异。在GenBank中进行BLAST比对，结果显示该序列（登录号：PX447785和PX447786）与墨西哥芭切叶蚁（Atta mexicana）参考序列（登录号：PP830089）同源性最高，相似性达98.05%。在BOLD数据库中进行鉴定，该序列与BOLD中多个墨西哥芭切叶蚁序列（样本号BIOUG64480-F03）聚为一支，相似性超过99.85%。应用MEGA 12软件计算芭切叶蚁属内遗传距离，种内遗传距离为0.0%～5.9%，种间遗传距离为10.2%～19.9%；以COⅠ基因序列构建的系统发育树上截获样本（Qyy005）与墨西哥芭切叶蚁聚在同一分支，置信度为100%（图2）。结合形态特征、序列比对结果以及构建的系统发育树，判断所截获的蚂蚁样本为墨西哥芭切叶蚁（Atta mexicana）。

Qyy005: 待鉴定样品; 节点处的数值为1000次Bootstrap检验的支持率

图2 基于COⅠ基因序列构建的系统发育树

Fig.2  Phylogenetic tree constructed based on COⅠgene sequences

3 讨论

研究显示，芭切叶蚁是拉丁美洲重要的农业害虫，主要为害双子叶植物和松树等针叶林，部分种类专食禾本科植物，且普遍表现出对引进作物的显著偏好^[9-10]，可直接造成橡胶、柑橘等经济作物幼苗死亡率超过70%^[11]，并通过持续取食导致林木生长受阻和严重减产^[12]。此外，芭切叶蚁与牲畜竞争牧草资源，可使牧场载畜量降低10%～30%，其庞大的地下巢穴系统还会引发土地退化与基础设施损毁^[10]。若该虫传入我国，其高度多食性、对栽培作物的显著偏好以及强大的种群扩张能力，将会对我国农业生产构成威胁。为防范该物种入侵，笔者建议加强以下检疫措施：（1）强化进境邮件检疫监管，尤其针对申报为“玩具”“模型”及“试管”等品名的邮件^[13]，应综合运用CT机与X光机等智能查验设备提升现场查验效能；（2）系统开展口岸检疫人员专业培训，重点提升对切叶蚁等蚁类形态特征的辨识能力；（3）对查获的活体蚂蚁立即实施检疫处理，同步开展溯源调查与风险评估。

芭切叶蚁种类鉴定的主要难点在于其高度依赖大型工蚁的形态特征，而其他品级（如中型工蚁、雌蚁和雄蚁）因缺乏可靠且稳定的鉴别特征，极难准确区分^[1]。此外，该属物种历史上分类混乱，加之近缘种分布区重叠，进一步增加了形态鉴定的复杂性。Borgmeier^[3]修订了美洲地区14种芭切叶蚁的鉴别特征，为方便我国口岸一线检疫鉴定人员的鉴定，本研究通过表格比较了3种常见芭切叶蚁的特征，具体见表1。

本研究在鉴定过程中由于截获样本缺乏可用于形态学种级鉴定的大型工蚁，为了更好地解决这个问题，仅凭样品形态特征难于鉴定到具体种类。因此，研究引入了DNA条形码技术用于种类鉴别，以弥补传统形态鉴定的局限。该技术能够有效克服不同品级、不同虫态（卵、幼虫、蛹等）的形态差异，为残损标本等疑难样本提供快速、准确的鉴定，从而显著提升外来物种鉴定的准确性^[14-16]。本研究基于COⅠ基因的DNA条形码技术成功扩增并与NCBI和BOLD数据库比对，取得98%以上的高匹配率，这种“形态+分子”相结合的鉴定策略，极大提高了口岸检疫的准确性与可靠性，尤其适用于蚂蚁多型工蚁及形态不完整样本的鉴定。综上所述，本研究整合形态学与分子生物学证据，报道了我国口岸所截获墨西哥芭切叶蚁的鉴定流程，建立了该种的检疫鉴定技术，为防范外来有害生物入侵提供了关键技术支撑。

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表1 3种芭切叶蚁大型工蚁主要鉴别特征

Table 1 Diagnostic features of major worker ants of three Atta species