刘 迪 冯茹荔 郑 雯 李明波 滕新栋

刘 迪 ¹ 冯茹荔 ¹ 郑 雯 ¹ 李明波 ² 滕新栋 ^1*

摘 要 本研究利用形态学和基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因的DNA条形码技术，对从黄岛口岸进境集装箱中截获的输入性鼠类进行鉴定。通过查阅文献资料，利用形态学初步鉴定鼠类种类。剪取鼠类样品的耳尖及内脏组织，提取鼠样品基因组DNA，利用DNA条形码技术进行分子鉴定。从比对结果中选取同一种属及不同种属的5种鼠类序列进行系统发育分析。参考文献资料显示，该鼠类的形态特征与以色列小沙鼠（Gerbillus pyramidum Geoffroy，1803）相符。PCR扩增产物测序后得到全长658 bp的序列，该序列与GenBank中以色列小沙鼠（登录号：MN326082.1）COⅠ基因相似性为98.58%。结合形态学和分子生物学鉴定结果，确认该输入性鼠类为以色列小沙鼠。

关键词 黄岛口岸；以色列小沙鼠；形态学鉴定；系统发育分析；DNA条形码鉴定

Morphological and DNA Barcoding Identification of Gerbillus pyramidum Intercepted at Huangdao Port

LIU Di ¹ FENG Ru-Li ¹ ZHENG Wen ¹ LI Ming-Bo ² TENG Xin-Dong ^1*

Abstract In this study, morphological identification and DNA barcoding based on the mitochondrial cytochrome C oxidase subunitⅠ (COⅠ) gene were employed to identify an imported rodent species intercepted in an inbound container at Huangdao Port. Preliminary species identification was conducted through morphological characterization with reference to published taxonomic literature. Ear tip and visceral tissue samples were collected from the rodent specimen for genomic DNA extraction, followed by molecular identification using DNA barcoding technology. For phylogenetic analysis, COⅠ sequences from five rodent species belonging to the same genus and different genera were selected based on sequence alignment results. According to relevant literature, the intercepted specimen was consistent with the diagnostic characteristics of Gerbillus pyramidum (Geoffroy, 1803). PCR amplification and sequencing yielded a 658 bp COⅠ fragment, which showed a sequence similarity of 98.58% with the COⅠ gene of G. pyramidum deposited in GenBank (accession no. MN326082.1). Integrating the morphological evidence with molecular and phylogenetic analyses, the intercepted rodent was conclusively identified as Gerbillus pyramidum.

Keywords Huangdao Port; Gerbillus pyramidum; morphological identification; phylogenetic analysis; DNA barcoding identification

基金项目：海关总署科研项目（2023HK020）；山东省重点研发计划（重大科技创新工程）（2021CXGC011306）

第一作者：刘迪（1995—），女，汉族，山东潍坊人，硕士，主管技师，主要从事病原体检测及病媒生物鉴定相关工作，E-mail: liudi7979@163.com

通信作者：滕新栋（1987—），男，汉族，山东青岛人，博士，副主任技师，主要从事病原体检测及病媒生物鉴定相关工作，E-mail: tengxindeng@163.com

1. 青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部） 青岛 266073

2. 青岛海关 青岛 266071

1. Qingdao International Travel Health Care Center (Qingdao Customs Port Out-Patient Department), Qingdao 266073

2. Qingdao Customs, Qingdao 266071

全球范围内约有 90%鼠类携带的病原微生物超过 200 种，其中包括31种病毒性疾病、14种细菌性疾病、7种寄生虫病和5种立克次体病 ，对生态环境系统和公共卫生安全造成了巨大的威胁。沙鼠同样是多种病原体的潜在携带者和传播媒介。研究表明，沙鼠可以携带人兽共患病病原体——弓形虫，这是一种分布广泛、严格细胞内寄生的原虫，可通过垂直传播引起先天性弓形虫病^[1]；沙鼠也是鼠疫杆菌的携带者^[2]，我国内蒙古、新疆等地均有长爪沙鼠、子午沙鼠及大沙鼠检出鼠疫杆菌^[3]。

沙鼠（Gerbillinae）亚科包含15属约110个物种，小沙鼠属（Gerbillus）隶属于沙鼠亚科，主要栖息于沙漠、半沙漠和干旱草原地区，以植物种子、根茎和昆虫为食。它们具有较强的耐旱能力，能够通过代谢水分的调节适应干旱环境，具有重要的生态学和生物学研究价值。小沙鼠属物种通常体型较小，体长为6～15 cm，尾长与体长相近或略长；后肢发达，适于跳跃，耳朵较大，眼睛突出，适应夜间活动；毛色多为沙黄色或灰褐色，与沙漠环境相适应。本研究利用形态学和分子生物学双重手段对青岛海关所属黄岛海关送检的输入性鼠类进行鉴定以确定其种类。

1 材料与方法

1.1 材料

2024年8月19日，黄岛口岸于进境集装箱内发现鼠类尸体一只，因死亡时间长，尸体已腐烂风干。

DNA提取试剂盒使用TaKaRa产品，PCR所用试剂、上下游引物及测序均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 形态学鉴定

将鼠类尸体转移至生物安全柜，对其形态及体长、尾长、足长、耳长进行观察测量并记录，参照Observations on gerbillus pyramidum（gerbillinae，rodentia）at khartoum，sudan^[4]进行鼠类形态学鉴定。

1.3 DNA条形码鉴定

因样品已腐烂风干，无法区分内脏器官。因此，取鼠类样品的耳尖及内脏组织，置于无菌的2 mL离心管中剪碎并研磨，按照核酸提取试剂盒内说明书的要求进行线粒体DNA提取。

PCR扩增使用鼠类通用引物BatL5310：5'-CCTACTCRGCCATTTTACCTATG-3'和R6036R：5'-ACTTCTGGGTGTCCAAAGAATCA-3'。扩增体系为：模版5 μL，上下游引物各1 μL，2X酶混合物12.5 μL，无菌双蒸水补足至25 μL。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35 个循环；72℃ 10 min。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序所得序列经DNAman软件分析处理后通过NCBI网站的Nucleotide BLAST功能进行比对。

1.4 NJ进化树构建与分析方法

从比对结果中选择与该鼠类样品同一种属及不同种属的5种鼠类参考序列（表1），采用Mega 11软件进行多序列比对，采用邻接法构建NJ系统进化树（Neighbor-Joining tree）。

2 结果

形态学鉴定结合分子鉴定结果显示，本次黄岛口岸截获的输入性鼠类为以色列小沙鼠（Gerbillus pyramidum Geoffroy，1803）。

2.1 形态学鉴定

头部、背部、身体两侧和尾部背面呈灰橙色；眼睛上方和脸部侧面各有一块白色斑块，前肢、腹侧面部、后肢内侧和尾部下表面呈白色；背毛根部为浅灰色，尖端为灰橙色；腹毛从根部到尖端为白色；尾部末端有一簇黑色毛，长 40～50 mm；体长80 mm，尾长115 mm，足长20 mm，耳长5 mm，如图1所示。该形态学特征符合文献资料^[4-5]中以色列小沙鼠的描述。

A: 背面图; B: 腹面图; C: 侧面图

图1 以色列小沙鼠的形态特征

Fig.1 Morphological characteristics of Gerbillus pyramidum

2.2 基因测序及序列比对

PCR扩增产物测序后得到全长658 bp的序列。将测序所得序列在GenBank中比对，结果显示样本序列与GenBank中的以色列小沙鼠（登录号：MN326082.1）CO Ⅰ基因相似性为98.58%。

2.3 NJ进化树构建与分析

根据比对结果，选择与该样本序列相似度较高的同一种属及不同种属的5种鼠类参考序列，包括以色列小沙鼠（Gerbillus pyramidum）、俾路支小沙鼠（Gerbillus nanus）、毛尾小沙鼠（Dipodillus dasyurus）、柽柳沙鼠（Meriones tamariscinus）、褐尾鼠（Niviventer cremoriventer），具体信息见表1。在获得有效序列后，采用MEGA 11软件进行序列分析处理，并运用邻接法构建NJ系统进化树以验证分子鉴定结果。系统发育分析显示，样品序列与以色列小沙鼠及俾路支小沙鼠参考序列形成一个显著的单系群，且与其他种属鼠类呈现出明显的遗传分化，如图2所示。

图2 基于CO Ⅰ基因序列构建的系统发育树

Fig.2 Neighbour-Joining phylogenetic tree constructed based on CO Ⅰ sequence

通过查阅文献资料，俾路支小沙鼠吻部背面有一条不明显的黑色条纹，每侧颊部耳根下方各有一块灰黑色斑块，眼后和耳后有白色斑点存在，与深色的背部毛皮形成鲜明对比^[6]。结合形态学及分子鉴定结果，进一步证实了本次鉴定的样本为以色列小沙鼠。

3 讨论

通过查阅文献资料，目前对于沙鼠的研究主要集中于利用沙鼠属动物作为实验动物模型进行疾病等研究，例如,建立糖尿病模型、寄生虫感染模型及行为学研究模型等^[7-10]，以及对沙鼠属动物的形态、遗传学及种群的探究^[11-13]，但对小沙鼠属研究较少。对小沙鼠的分类研究依赖传统形态学及有限的地理分布差异^[14-16]，仅有少数针对分子生物学的研究^[17]，尚待进一步深入探究。

我国境内仅有与小沙鼠属相近的沙鼠属及短耳沙鼠属分布，小沙鼠属未见分布，相关形态学及分子系统学研究较少，因此对小沙鼠的鉴定还有很大的提升空间。由于缺乏本土小沙鼠属标本，其形态学特征（如头骨结构、齿列特征等）描述较少，加之近缘属种间形态高度趋同，导致传统依赖解剖特征的鉴定方法易受主观经验限制，从而影响物种判别准确性。针对这一现状，此次对送检样本的鉴定采取了形态学与DNA条形码鉴定相结合的方式，有效提高了鉴定结果的准确性。在口岸病媒生物鉴定中，DNA条形码技术以其在残缺及入侵物种样本鉴定中的独特优势，已经成为形态学鉴定技术的有力补充，对防范生物入侵和传染病跨境传播具有重要意义。

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表1 5种鼠类参考序列比对结果

Table 1 Comparison of reference sequence alignment results among five rodent species