邱佳琦 翟 敏 吴 薇 李家明 郑小燕 刘永磊

邱佳琦 ¹ 翟 敏 ¹ 吴 薇 ¹ 李家明 ¹ 郑小燕 ¹ 刘永磊 ^{1 *}

摘 要 在贸易全球化与气候变化背景下，病媒生物跨境传播风险加剧，对监测技术的时效性和精准性提出了更高要求。本文围绕纳米孔测序技术，系统综述了其在病媒生物研究中的应用进展，重点探讨其在病原体检测、分型、现场监测以及病媒生物学基础研究中的具体实践，进而评估其在病媒生物及相关病原体检测中的技术潜力与应用价值，为口岸病媒生物防控和公共卫生实践提供技术支撑。

关键词 纳米孔测序；病媒生物；病原体检测；监测与溯源

Application of Nanopore Sequencing Technology

in Vector Biology Research

QIU Jia-Qi ¹ ZHAI Min ¹ WU Wei ¹ LI Jia-Ming ¹ ZHENG Xiao-Yan ¹ LIU Yong-Lei ^1*

Abstract In the context of trade globalization and climate change, the cross-border transmission risks of vector organisms are intensifying, placing higher demands on the timeliness and precision of surveillance technologies. This paper focuses on nanopore sequencing technology and provides a systematic review of its recent applications in vector biology research, with particular emphasis on its practical use in pathogen detection, genotyping, field-based surveillance, and fundamental studies of vector biology. Furthermore, the technical potential and application value of nanopore sequencing for the detection of vector-borne organisms and their associated pathogens are evaluated, aiming to provide critical technical support for port vector control and public health practices.

Keywords nanopore sequencing; vector species; pathogen detection; surveillance and traceability

病媒生物能存储或携带病原体，并向人类传播，主要包括蚊、蝇、蜚蠊、蚤、白蛉、虱、蠓、蚋、蜱、螨等节肢动物和啮齿动物鼠类等。世界卫生组织统计数据显示，全球约五分之四人口处于病媒生物传染病的感染风险中，此类疾病占全球传染病的17%，每年导致逾70万人死亡，对全球公共卫生构成持续威胁^[1]。主要原因一方面由于经济全球化带动了人员跨国流动、货物跨境贸易及交通运输网络的全球化扩张，使得病媒生物得以跨境传播；另一方面，由于气候变暖改变了生态系统的结构和功能，为病媒生物入侵提供了适宜环境，增加了病媒生物跨境传播风险^[2]。这对于病媒生物防控工作提出了更高的要求，需要对病媒生物种类、密度、分布、对杀虫剂的抗药性以及携带的病原体等进行监测，从而进行科学的决策和控制。

传统的病媒生物研究方法，如形态学鉴定、病原分离培养、血清学及免疫学检测和常规分子检测，虽在种类判定与病原检测中发挥了基础作用，但在复杂的实际应用场景中存在一定局限，例如检测周期长、对低丰度或未知病原的灵敏度不足、难以实现现场实时监测等^[3-6]。

纳米孔测序（Nanopore Sequencing）作为第三代测序技术的代表，其原理是通过检测单分子核酸穿过纳米孔道时产生的电流变化来解码序列^[7]。与传统短读长测序相比，该技术能够获得超长读长数据，支持实时测序，并可直接解析DNA或RNA分子上的甲基化等修饰^[8]。以牛津纳米孔测序平台（Oxford Nanopore Technologies，ONT）为代表的便携式测序设备进一步拓展了其应用场景^[9]。本文就纳米孔测序在病媒生物研究中的应用做系统综述，重点关注其在病原体检测、分型、现场监测以及病媒生物学基础研究中的应用。

1 纳米孔测序在病媒生物携带病原体检测中的应用

1.1 靶向纳米孔测序在病原体检测中的应用

病原体检测是病媒生物防控的首要环节，纳米孔测序技术通过靶向与宏基因组两种策略，显著提升了检测的灵敏度与覆盖面。近年来，基于纳米孔平台的扩增子测序，在病媒生物携带病原检测技术研究中展现出重要价值。研究者通过针对特定基因标记（如16S rRNA或18S rDNA）定向扩增与高通量测序，显著提高了病原体筛查的灵敏度和覆盖范围。Kimemia等^[10]在肯尼亚的蜱虫样本中利用16S rRNA扩增子测序，发现立克次氏体和贝氏柯克斯体为优势病原，提示此类地区需在临床鉴别诊断中加强对立克次体病和Q热的鉴别诊断，为口岸蜱类携带病原的监测与风险评估提供了技术参考。类似地，在哥伦比亚采集的血红扇头蜱和猫栉首蚤中也通过纳米孔16S rRNA扩增分析，检出嗜吞噬细胞无形体、康氏立克次体及多种沃尔巴克氏体内共生菌，显示该方法适用于多类病媒节肢动物的联合病原筛查场景。在寄生虫检测方面，扩增子测序技术的高分辨能力尤为突出。研究者开发了基于18S rDNA的扩增子测序方法，借助纳米孔长读长实现对11种锥虫及6个克氏锥虫遗传分型单元（TcⅠ、TcⅡ、TcⅢ、TcⅣ、TcⅥ和TcBat）的精准鉴别，揭示出不同宿主感染亚型的分布差异^[11]。值得关注的是，该技术已逐步应用于临床样本的直接检测。Sharda等^[12]采用纳米孔技术对患者血液中的全长16S rRNA基因进行扩增子测序，成功实现了对恙虫病东方体的直接诊断。上述研究表明，基于纳米孔平台的扩增子测序在病媒寄生虫及相关病原的精准鉴别和混合感染识别方面具有明显优势，为口岸及现场条件下开展寄生虫病原的快速检测与风险评估提供了可行的技术支撑。

1.2 基于纳米孔的宏基因组测序在病原体检测中的应用

随着第三代测序技术的发展，基于纳米孔的宏基因组测序逐渐成为探索病媒生物及其携带病原体的重要工具。在蜱传病原体的研究中，纳米孔测序的应用价值已得到充分展现。Ergunay等^[13]通过该技术对蒙古国不同地点采集的蜱虫进行宏基因组筛查，成功检测到细菌、病毒和寄生虫等多种病原体，并获得了两种较为完整的病毒基因组序列。一项针对野外蜱虫的宏基因组纳米孔测序研究，首次在欧洲记录到亚洲立克次体，还同时检出嗜吞噬细胞无形体、贝氏柯克斯体等多种PCR方法漏检的病原体，并揭示了16.4%的样本池存在共感染模式^[14]。同样，在对埃塞俄比亚22种蜱虫的宏基因组分析中，研究人员也鉴定出多个细菌属、寄生虫属和病毒属，并有效区分了致病性与非致病性微生物^[15]。此外，Páez-Triana等^[16]将病毒富集技术与纳米孔测序相结合，对来自哥伦比亚的血红扇头蜱特定病原体组成进行了深入分析，揭示了该地区该蜱种所携带的主要RNA病毒类型，并发现其病毒多样性受蜱虫性别的显著影响。与传统的靶向扩增或分离培养方法不同，基于纳米孔的宏基因组测序不依赖先验信息，能够对样本中的所有核酸进行无差别的、非靶向的测序，从而实现对已知、新发及罕见病原体的全面筛查。上述研究主要基于国外不同地区的蜱虫样本，所揭示的病原体谱系复杂性和共感染特征，对我国口岸输入性蜱传病原的风险识别与技术路径选择具有重要参考价值。

1.3 纳米孔测序在物种鉴定与病原体分型中的应用

病媒生物的准确鉴定与其携带病原体的可靠分型是理解和应对相关疾病传播风险的基础。传统方法依赖形态学或有限的分子标记，但在形态特征不典型或感染样本复杂的情况下往往存在不足。在蚊虫鉴定中，基于线粒体基因（CO Ⅰ和CO Ⅲ）的纳米孔扩增子测序，能够准确区分形态上难以分辨的库蚊复合群物种，其鉴定效果显著优于传统形态学方法^[17]。通过DNA条形码结合纳米孔测序，能够成功对不同保存条件和不同发育阶段的蚊虫样本进行物种鉴定，结果与桑格测序高度一致^[18]。该技术同样适用于寄生虫的精准鉴定，针对利什曼原虫，研究者开发了基于Hsp 70长片段的纳米孔测序方案，不仅能有效实现原虫种类区分，还能识别样本中的合并感染，尽管长片段标记的敏感性略低于较短标记片段，但其所提供的更丰富的序列信息，展现了优异的物种识别特异性^[19]。与传统的聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性分析（Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP）方法相比，纳米孔测序无需预先培养样本，即可更高效、更敏感地区分利什曼原虫的参考株及临床分离株^[20]。另一项对克氏锥虫的研究中，通过对Miniexon基因进行纳米孔测序，不仅成功鉴定出TcⅠ为主要遗传分型，还识别出TcⅠ与TcⅣ的混合感染情况^[21]。

在病原体分型方面，纳米孔测序同样表现出良好的应用潜力，能够为流行病学监测和传播规律研究提供更高分辨率的数据。印度一项研究针对恙虫病东方体的TSA 56基因进行长片段扩增子测序，发现该地区主要流行TA 763基因型，并证明长片段读长在分型准确性上优于短片段，有效避免了分型错误^[22]。在尼日利亚一项针对发热患者的虫媒病毒监测中，研究人员利用纳米孔测序获得了黄热病病毒的完整基因组，通过系统发育分析确认该病毒属于已知的西非基因型谱系3^[23]。在巴西发热患者的检测中同样应用该技术分离出马亚罗病毒，并快速确认其为D基因型^[24]。综合来看，纳米孔测序通过提供长读长、高分辨率的序列信息，在病媒生物物种鉴定及其携带病原体精细分型方面展现出显著优势，为复杂样本条件下的准确鉴定、流行株判定及传播风险评估提供了更加可靠的技术支撑。

2 纳米孔测序在病媒生物血餐分析、溯源及现场监测中的应用

2.1 纳米孔测序在病媒生物血餐分析中的应用

血餐分析是理解病媒生物与宿主相互作用、评估疾病传播风险的关键环节。该技术在识别混合血餐及拓宽宿主发现范围方面表现尤为出色。一项在泰国的利什曼病流行区开展的研究，通过CO Ⅰ基因纳米孔测序显著提高了库蠓混合血餐样本的分辨率，检测到4种不同宿主的血源，识别率远高于传统Cytb-PCR，并覆盖多种野生动物宿主^[25]。Kothera等^[26]在媒介控制区应用便携式设备开展蚊子血餐鉴定，显示纳米孔测序较桑格测序更适合混合血餐样本的物种识别，为大规模应用提供了简便的技术选择。此外，利用纳米孔自适应采样技术（Nanopore Adaptive Sampling，NAS）的研究进一步拓展了血餐分析的深度，在一次测序中能同时完成吸血昆虫自身完整线粒体基因组的组装和其血源物种的精准识别^[27]。

纳米孔测序的突出价值之一在于其能够实现多维信息的整合分析。Mirza等^[28]针对巴西蚊子样本的研究，开发了一套无偏联合测序方案，通过一次测序流程，便可同时完成蚊子种类鉴定、病毒病原体检测以及血餐来源分析，为研究蚊媒病毒传播周期提供了高效的整合性工具。类似的，在对美国得克萨斯州开展的吸血锥蝽研究中，纳米孔测序不仅被用于克氏锥虫的基因分型，还通过对12S rRNA基因的分析，成功鉴定出来源于犬、人类和多种野生动物的血餐，清晰地揭示了家养和野生动物共同参与的本地传播循环^[21]。

2.2 纳米孔测序在病原体溯源中的应用

在追溯病原体的地理来源与传播路径方面，通过对病毒全基因组进行快速测序和系统发育分析，研究人员能够揭示新发疫情的源头。比利时首次发现本土蜱传脑炎病毒后，利用纳米孔测序获得的完整病毒序列与芬兰菌株亲缘关系最近，为病毒可能通过迁徙鸟类等途径进行远距离传播提供了分子证据^[29]。挪威的一项研究发现，当地新出现的蜱传脑炎病毒变体与芬兰的毒株更为接近，而非该国早期的流行株，证实了病毒存在持续的跨区域传播^[30]。该技术不仅能追溯跨国传播，还能解析一个国家或地区内部的传播动态。在巴西，针对基孔肯雅病毒^[31]和登革病毒^[32]的大规模基因组监测，成功重构了病毒谱系在不同区域间的多次独立传入和复杂的替代模式，精确追溯了疫情的扩散历史。此外，纳米孔测序也能用于确认本地的持续传播，如在塞内加尔^[33]、南非^[34]和尼日利亚^[23]的研究中，通过对病毒进行测序，证实了相关虫媒病毒是在本地持续循环，而非新近从外部传入。

在更微观的层面上，纳米孔测序能够以单碱基的分辨率追溯特定感染事件的源头。在一例疑似寨卡病毒的实验室获得性感染病例中，研究人员通过对患者样本中的病毒进行全基因组测序，证实其序列与实验室所用毒株的相似度高达99.27%，从而锁定了感染来源^[35]。

除了追溯病原体，纳米孔测序同样被应用于追踪病媒生物自身的入侵和扩散过程。一项针对欧洲新入侵物种朝鲜伊蚊的研究，结合纳米孔测序获得了该物种的首个完整基因组。通过分析不同地区蚊群的CO Ⅰ基因单倍型，研究人员识别出多个独立的入侵路径和种群间的持续遗传混合现象，描绘了该入侵物种在欧洲大陆的扩散模式^[36]。这些研究表明，基于纳米孔测序的快速全基因组分析与系统发育推断，能够在不同空间尺度上精准解析病原体及病媒生物的来源与传播路径，为口岸在发现输入性病例或截获外来病媒生物时，及时判定其潜在来源、传播风险及是否存在本地扩散提供了重要的分子溯源依据。

2.3 纳米孔测序在现场监测中的应用

纳米孔测序的便携性推动了病媒生物基因组学由固定实验室分析向现场快速检测的转变，使“将实验室带到现场”成为现实。其便携的设备使得在资源有限或偏远地区开展实时基因组监测成为可能。一项研究成功验证了在最低限度样本纯化的条件下，可直接从蚊子样本中检测出完整的罗斯河病毒基因组，证实了其在现场病毒监测中的巨大潜力^[37]。更有研究将这一概念推向实践，美国佛罗里达州的一项研究利用便携式测序流程，在不依赖特异性扩增靶标的情况下，直接从环境蚊虫样本中检测并鉴定出委内瑞拉马脑炎病毒，展示了便携式测序体系在现场快速响应中的应用价值^[38]。

现场应用的前提是从样本到结果读取时间的极致缩短。结合新开发的实时分析流程，高滴度的病毒可在数分钟内被检出，整个流程可在6 h内完成，为临床诊断和突发疫情响应提供了近乎实时的决策支持^[39]。针对特定病原体，研究人员还开发了优化的引物富集方案，如针对发热伴血小板减少综合征病毒（Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus，SFTSV）的流程，可在10 h内从临床样本中获得高质量的全基因组序列^[40]。

在持续性监测方面，来自斯里兰卡和巴西的研究表明，便携式纳米孔测序能够追踪登革病毒血清型更替与再度流行，摸清登革热疫情流行演变模式，凸显了便携纳米孔测序在连续监测与流行病学研究中的应用潜力^[41-42]。

新型富集策略（Metagenomic Sequencing with Spiked Primer Enrichment，MSSPE）在多种虫媒病毒基因组测序中显著提高了覆盖率，能够有效应对低丰度和高变异度病原体，并已在便携式纳米孔平台上验证了对多类临床样本的适用性，展现出其在便携化测序和疫情应对中的实用价值^[43]。从口岸应用角度看，上述研究表明依托便携式纳米孔测序平台，可在不依赖完备实验室条件的情况下，实现病媒生物样本的快速处理、实时测序与初步分析，为口岸在入境检疫和应急处置中开展前移式、现场化的分子监测提供了重要技术支撑。

3 纳米孔测序在病媒生物学基础研究中的应用

除了在病原体检测与鉴定方面的直接应用，纳米孔测序凭借获取复杂基因组与转录组信息的能力等优势，正在推动病媒生物学基础研究进入更深的层次。它不仅能够解析抗性产生的复杂遗传机制，还能揭示病媒与共生体、病原体乃至环境之间的相互作用，为理解病媒生物的适应性、媒介能力及其与疾病传播的关系提供前所未有的分子视角。

纳米孔测序能帮助解析病媒生物抗性产生机制与遗传多样性分析。在家蝇对氯菊酯的极高抗性研究中，该技术帮助研究者将抗性与电压门控钠离子通道基因，以及5号染色体的抗性位点区域的一组复杂的结构变异相关联，揭示了基因结构变异在抗性形成中的关键作用^[44]。在对疟疾的防控研究中，纳米孔测序也成为监测抗药性的有力工具。一项在加纳开展的研究便利用该技术构建了一套端到端的基因组监测流程，能够直接应用于临床干血斑样本，快速、准确地评估恶性疟原虫对氯喹、磺胺多辛—乙胺嘧啶等药物的抗性状况^[45]。此外，该技术还能精细分析疫苗靶点的遗传多样性，一项针对疟疾候选疫苗靶点恶性疟原虫环子孢子蛋白（Circumsporozoite Protein）的研究，利用纳米孔测序揭示了埃塞俄比亚地区该基因存在极高的多态性，且所有单倍型均与疫苗株不匹配，这一发现为优化疫苗的等位基因提供了关键数据^[46]。

纳米孔测序同样为探究病媒与微生物的相互作用开辟了新途径。一项研究首次利用纳米孔测序平台的直接RNA测序技术，探究了共生菌沃尔巴克氏体对埃及伊蚊的抗病毒机制。结果发现，沃尔巴克氏体感染能显著改变蚊虫基因组的m⁶A RNA修饰水平和宿主免疫相关基因的表达，揭示了共生菌可能通过调控宿主表观转录组来影响其抗病毒能力^[47]。在更宏观的层面，该技术也促进了对病媒生物与环境互作的理解。通过对按蚊孳生地水样和幼虫样本的16S rRNA进行分析，研究人员发现孳生地与幼虫体内的细菌群落组成存在显著差异和特定联系，表明细菌群落可能影响按蚊对产卵地的选择，这为开发基于微生物的蚊媒控制策略提供了理论依据^[48]。此外，纳米孔测序还能在生态调查中发现新的生物互作关系，在对泰国库蠓的调查中，研究者结合形态学与分子分析，鉴定出一种寄生于库蠓的线虫新物种，为昆虫病原生物学和媒介生物防治研究提供了新线索^[49]。

此外，高质量的参考基因组是深入开展生物学研究的基础。Ripoll等^[50]开发了虫媒病毒监测的实用流程，成功完成了对阿根廷野外捕获的埃及伊蚊中多种病毒的全基因组测序，还能识别可能影响病毒传播的昆虫特异性病毒（Insect-Specific Viruses，ISVs）。另一项哥伦比亚的研究也证实，蚊子的病毒组以ISVs为主，并发现了一组在所有受测蚊种中共同存在的ISVs，这为理解ISVs与虫媒病毒的相互作用提供了基础^[51]。

4 结语与展望

纳米孔测序作为近年来快速发展的第三代测序技术，在病媒生物病原体检测中展现出独特的优势。一方面，纳米孔测序灵活的靶向测序策略，无论是通过对特定基因进行扩增子测序以实现对特定生物类群的快速鉴定，还是对目标病原体进行特异性富集，靶向测序都能将测序资源向目标区域集中。这不仅极大地提高了对低丰度病原体的检出灵敏度，还能有效降低测序成本和数据分析的复杂度，使得大规模、高通量的病原监测逐步走向成熟。另一方面，实时长读长输出能力使得完整基因组拼接、复杂基因结构解析以及微生物与宿主和环境间的互作研究成为可能。尤其是在病媒生物样本中，宿主、病原、共生微生物甚至环境中的遗传物质高度混杂，纳米孔测序通过无扩增、长片段直读的特性，为病原体的发现、分型、溯源及生物学研究提供了数据基础。此外，其设备的便携性与数据的快速实时输出，也大幅增强了其在口岸监测、野外调查及突发疫情应对中的应用价值。

然而，当前纳米孔测序在病媒生物学应用中仍面临一定局限，如单碱基识别准确率有待进一步提升，低丰度病原在复杂背景中的检出灵敏度有限，标准化样品处理流程与数据库建设仍不完善。此外，大规模数据分析依赖于算法与计算资源，也在一定程度上制约了技术的普及。

总体而言，纳米孔测序凭借其实时性和便携化优势，已成为病媒生物病原体检测的重要补充方法。随着测序精度的提升、成本的进一步降低以及配套生物信息学工具的成熟，其应用范围将从实验室研究逐步拓展至跨学科的常规检测与风险评估，在病媒生物学与公共卫生防控领域展现出更加广阔的发展前景。

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基金项目：海关总署科研项目（2023HK059）

第一作者：邱佳琦（1994—），男，汉族，浙江宁波人，硕士，实验师，主要从事病媒生物种类鉴定及病原检测工作，E-mail: 978157259@qq.com

通信作者：刘永磊（1989—），男，汉族，山东临沂人，博士，高级农艺师，主要从事病媒生物种类鉴定及病原检测工作，E-mail: toxinx@163.com

1. 宁波国际旅行卫生保健中心（宁波海关口岸门诊部） 宁波 315000

1. Ningbo International Travel Health Care Center (Ningbo Customs Port Outpatient), Ningbo 315000